穿透性角膜移植术后的激光共聚焦显微镜扫描

摘要

目的。应用激光共聚焦显微镜观察穿透性角膜移植术(PK)后角膜中央组织中角化细胞和树突状细胞的变化。方法。本研究招募了30名在山东眼科研究所接受PK治疗的患者，手术后接受透明移植，无免疫排斥迹象，10名健康成人作为对照。激光共聚焦显微镜观察移植中心的角化细胞和树突状细胞，以及上皮细胞、角化细胞、角膜内皮细胞和角膜神经(特别是上皮下丛神经)。结果。透明移植物上皮下神经丛的中位密度、间质各层角化细胞密度和角膜内皮细胞密度均低于对照组。5例患者(16.7%)的树突状细胞在PK后移植物的鲍曼膜和间质膜活跃。结论。在部分透明移植物中可检测到活化的树突状细胞和朗格汉斯细胞，提示免疫反应的亚临床应激参与了PK后透明移植物的慢性损伤，即使没有临床排斥反应。

1.介绍

角膜移植有超过100年的悠久历史[1,2]。显微技术大大提高了角膜移植的成功率[3.]。临床应用环孢素A、FK506等免疫抑制剂可显著降低急性排斥反应的发生频率[3.- - - - - -9]。尽管如此，临床研究发现，角膜移植物在移植后数月至数年的时间里功能逐渐退化。也就是说，在没有排异史的情况下，角膜移植物最终会水肿和不透明。这种行为被归因于进行性晚期内皮细胞衰竭或慢性异体角膜移植功能障碍[10,11]，穿透性角膜移植术（PK）后可能表示差的长期生存率的主要原因。据报道，内皮细胞的损失率是每年0.6％的正常人眼角膜。血管内皮细胞的移植物损失率高达每年4.2％，甚至手术后在没有排斥反应[12]。

迄今为止，很少有研究报道即将由于缺乏明确的临床移植的物种的移植慢性损害。我们不知道，无免疫排斥反应的迹象清晰的移植物是否患有慢性免疫损伤。这也是争议是否可以在这些患者中使用免疫抑制剂。共聚焦显微镜是用于角膜生理学和疾病的细胞结构的调查的非侵入性技术。它提供的生物体组织的可视化，并提供灰度图像超过光生物显微镜和biocytology大大增加的分辨率，这可以观察角膜的超微结构[13- - - - - -15]。由于在体内共焦显微术，有可能观察到移植物在体内和角膜的激活的优点。在这项研究中，我们观察到清晰的接枝没有PK后免疫排斥反应的任何迹象通过共聚焦显微镜并研究免疫细胞和其他角膜是否参与角膜移植物的慢性损伤。

2.方法

2.1。主题

谁1997年11月1日和2013年12月21日之间进行PK山东眼科研究所的患者，通过采用裂隙灯生物显微镜，以确定是否移植是明确检查。受到任何临床免疫排异反应的移植物被排除在研究。30例（30只眼）都包括在内。平均年龄是年龄(16至65岁)。术前未矫正视力(Log MAR)平均值为(范围:1.00至3.00)

2.2。组

30个透明移植物在术后年(范围1-17年)。角膜移植术前适应证为:角膜溃疡(18眼)、粒状角膜营养不良(3眼)、前房晶状体引起的假性大疱性角膜病变(2眼)、眼损伤引起的角膜瘢痕(2眼)、圆锥角膜(2眼)及其他(3眼)。在2009年至2014年期间，10名受试者的10个正常角膜作为角化细胞密度和基底下神经密度的同步对照。平均年龄是年龄(24至34岁)。平均未矫正视力为(范围:0.52至3.00)

2.3。角膜的体内扫描共聚焦显微镜

使用海德堡视网膜断层成像II罗斯托克角膜模块(海德堡工程公司，海德堡，德国)对所有受试者进行体内共焦显微镜激光扫描。所有的眼睛麻醉与下降0.4%的苯氧酸盐酸盐(Chauvin Pharmaceuticals，萨里，英国)。粘泪液(卡波姆980,0.2%;(诺华公司，北莱德，新南威尔士州，澳大利亚)被用作苹果状透镜帽和角膜之间的偶联剂。在检查过程中，所有受试者被要求注视一个距离目标，以使检查角膜中央。PK后角膜中央厚度随时间增加[16,17]。为了简单起见，我们将这个变量称为“角质细胞的数量”。每个受试者随机选择三张图像进行分析和统计比较。

2.4。数码影像记录

目的是调整，以提供一个绿色的外观中央角膜。病人用对侧的眼睛注视一个目标，以减少眼球运动。角膜中央的数字图像记录与光学切片前进通过全层角膜。每张图像都代表了大约380度的角膜冠状部分μm(水平)×380μ(垂直)(18,19]。使用该设备的“切片模式”对角膜中央的整个厚度或中心2毫米直径范围内的区域进行扫描。这种模式可以在需要的深度对角膜的单个区域进行瞬时成像。一个角膜的“对焦”系列图像构成了一次“扫描”，有超过450个视频帧，这取决于角膜的厚度。每只眼睛进行2 - 4次扫描，其中中央基底上皮的图像最为清晰。

2.5。图像分析

对于每次共聚焦显微镜检查，三个图像分别来自以下水平:上皮下神经丛、前间质、后间质和内皮。由经验丰富的观察者为每个角膜选择无运动伪影的最佳质量扫描(SW)。角膜密度测量分为3层:上皮、基质(角膜前基质细胞和角膜后基质细胞)和内皮。角质细胞的核边界清晰，只有高反射的核，在基质上可以看到反射性的角质细胞。共聚焦显微镜允许在体内评估郎格汉斯细胞(LCs)和其他免疫细胞在人角膜，特别强调细胞形态分布在鲍曼膜和基质。使用免费半自动图像分析程序NeuronJ和ImageJ (http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/;访问2012年11月)，一个插件程序。角质细胞的图像使用自定义的自动化程序进行分析，该程序客观地识别出明亮的物体(假定代表角质细胞核)并计算出角质细胞密度[10,20.]。所有图片的10%由一位审查员复述，以确定考官的同意限度。

2.6。统计分析

比较PK后的透明移植物和对照组全层间质的平均角化细胞密度、各层间质的角化细胞密度、角化细胞数量和基底下神经密度。采用非配对的方法分析差异-tests如果数据被正常地或使用Wilcoxon秩和检验，如果数据不是正态分布分布。被认为具有统计学意义。角膜移植术后角化细胞密度或基底神经密度与时间的相关性如果数据正态分布采用Pearson相关系数，如果数据不正态分布采用Spearman检验。角质细胞的年损失率(每年减少的百分比)是根据每次检查的角质细胞数量和检查间隔时间计算的，假设角质细胞数量减少为简单的一级损失。

2.7。医学伦理学

这项研究遵循了《赫尔辛基宣言》的原则。在对研究的性质和可能的后果进行解释后，所有受试者均获得知情的书面同意。本方案经山东眼科学会伦理委员会批准。

3.结果

3.1。角膜神经的评价

平均密度的上皮下神经丛移植的透明(1506)μ米/毫米²;范围782-5846 μ米/毫米²)()比对照组(7020μ米/毫米²;范围内,2371 - 12448μ米/毫米²;)()。上皮下神经再生中的随机和无序模式更小和比PK后的正常时间缩短（图1)。

3.2。的评价,可见

与对照组相比，透明移植物间质各层的角化细胞密度较低。前基质细胞密度为细胞/毫米²(范围493 - 1404细胞/毫米²)，而它是细胞/毫米²(范围798 - 1380细胞/毫米²)的正常眼角膜()。后基质细胞密度为细胞/毫米²(范围295 - 1203细胞/毫米²）明文移植物，显著高于正常角膜降低（细胞/毫米²;范围内,587 - 1380细胞/毫米²;)。几个核的形状从椭圆形变成了不规则的纺锤形。PK后患者间质细胞紊乱无序，部分细胞形成瘢痕(图)2)。

3.3。内皮细胞的评价

角膜内皮细胞密度为细胞/毫米²(范围480 - 3371细胞/毫米²）明文移植物，显著高于正常角膜降低（细胞/毫米²;范围内,2798 - 3972细胞/毫米²;)。内皮细胞由六边形变为七边形甚至更多，体积更大。部分核高反射，少数多核细胞。PKs的内皮细胞核影响了比正常情况下更亮的光线折射(图)3.)。

3.4。炎症细胞的评价

平均角化细胞密度与术后时间相关性较弱(;)。5个(16.7%)成人的树突细胞在PK后移植物的鲍曼膜和间质膜中活跃。共聚焦显微镜扫描有5 ~ 6个激活的LCs(两端分叉的白色物体)(图)4)。

4.讨论

PK是角膜疾病的最重要的治疗方法之一。全世界每年约有10万人接受这种手术的视力康复。然而，PK慢性经过角膜移植免疫功能障碍或晚期移植失败的威胁是长期的移植存活一个很大的问题。根据最近的一份报告的一半时间成分是PK21年后[20.]。移植可保持约20年的透明性[12]。虽然慢性角膜功能障碍的原因目前还不是很清楚，但文献和实验数据表明，它与细胞免疫有一定的关系。当切片灯显微镜观察到移植物清晰，没有任何免疫排斥的迹象时，共聚焦显微镜的结果可能会被忽略。本研究采用共焦显微镜观察透明中央角膜移植物PK后的病理形态学变化，以客观评价移植物的变化。

考虑到神经学方面，我们主要关注上皮下丛神经。角膜神经感觉眼部表面有一个重要的功能,也可以发布各种各样的营养物质,如P物质和垂体腺苷酸环化酶激活多肽,促进上皮细胞的稳态,泪液分泌和瞬目反射和激活,以保持结构的完整性和眼表面的功能作用21,22]。此外，角膜神经通过传导生长因子信号-，促进角膜上皮细胞的增殖和迁移，调节角膜缘干细胞的分化和增殖β及完成移植物的修复[23]。已经证明，PK后，无论什么物种的神经再生都非常缓慢，角膜的感觉很难完全恢复。移植的角膜神经破裂可能导致角膜再生缓慢。术后基质再生不完全，角膜中央神经的敏感性与基质神经的形态和密度密切相关[24,25]。短神经可以产生更少的神经肽，导致随机的图案。

正常的角膜基质细胞是稳定的，不分化或增殖。在我们的系列实验中，角膜移植后基质细胞的数量明显减少，显示出一种不稳定的状态。我们推测一些基质细胞可能被免疫细胞清除。基质雾霾可能是角质细胞的一种重要现象，与非晶态脱细胞反射结构的积累和纤维化的结果相对应。基质细胞是正常角膜基质的主要成分，负责胶原和细胞外基质的合成，在维持角膜透明度方面发挥着相当重要的作用[26]。当无定形的无细胞的反射材料的减小，可识别的基质细胞逐渐增加。在角膜的再生修复，基质细胞还可以输入，而不是转化到维修型的成纤维细胞[由增殖迁移角膜损伤27,28]。基质疤痕和细胞核形状的变化可能暗示基质细胞处于“应激状态”。

角膜内皮是角膜移植最重要的层。在我们的研究中，当内皮细胞数量减少时，角膜出现水肿和混浊，影响视力。这与Bourne的研究结果一致[17]。慢性异体角膜移植功能障碍主要表现为内皮细胞的丢失和形态学改变。但未见明显的免疫排斥反应。Patel等人[18用共聚焦显微镜检查了505名患有不同眼病的患者的角膜。他们发现，在17例PK患者中，有9例(53%)患者内皮细胞核出现反射，且内皮细胞下降速度快于生理速度[29]。据报道，叛变的细胞区主要充满来自周围区域的迁移和增大的细胞[29]。有研究者推测，内皮细胞面积的增加或细胞的拉伸会导致内皮细胞层变薄，单位面积细胞质含量减少。这是一种细胞的代偿机制。在面积增大的内皮细胞中，出现了双核甚至多核的反射。这可能是细胞融合的现象。角膜内皮细胞核形态的改变会影响光的折射，使共聚焦显微镜下直接观察到内皮细胞核的明亮反射[27,30.]。这些现象也提示了PK后移植物处于应激状态。

角膜移植后免疫排斥反应的发生时间以及免疫细胞是否参与了排斥反应均存在争议。角膜是具有良好组织相容性的异体体。如果没有免疫细胞，这似乎是不可能的。但通过角膜移植超微结构观察，我们在再移植末期患者中并未发现大量的免疫细胞或炎性细胞。因此，体内免疫细胞的检测对指导临床用药具有重要意义。我们注意到并非所有的移植物都与活化的免疫细胞(尤其是LCs)粘附。结果与之前的报告大致一致[11,28,31]。只有16%的患者发现了明显的免疫细胞，这表明一些患者仍然受到影响。我院PK后常规使用免疫抑制剂，定期随访的患者给予低浓度皮质类固醇滴眼液或免疫抑制剂，可能导致移植物免疫细胞数量减少。活性免疫细胞从角膜缘的血管网络侵入角膜移植物床并迁移到角膜移植物中[32]。角膜神经和角化细胞的减少表明移植物可能有慢性炎症和处于应激状态。这些免疫细胞不足以引起临床可见的免疫排斥反应，但它们可能造成角膜移植物的慢性损伤，并逐渐降低细胞功能。免疫细胞的粘附机制尚不清楚，有待进一步研究。在我们的研究中，病人被安排每三个月随访一次。但有些病人未能及时到场。因此，数据并不完整。

总之，皮下神经丛，角膜细胞，和内皮细胞可在显著数下降在PK后中央空白接枝。PK后的移植物是在应力状态，影响角膜的正常生理功能，并导致移植物功能的偏角。免疫因子及其他非特异性因素都参与了角膜移植的慢性功能障碍的发展。

利益冲突

作者宣称没有关于本文的发布利益冲突。

致谢

这项工作由国家自然科学基金(81370989,81570821)、国家基础研究计划(2013CB967004)、山东省医学科学院创新项目、泰山学者计划二期(20081148)、山东省优秀创新团队计划资助。作者感谢林平在语言和编辑方面的帮助。

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