制造的新型水凝胶Berberine-Enriched羧甲基纤维素膜和透明质酸作为抗炎障碍

文摘

antiadhesion屏障膜是一种重要的生物保护组织从手术后的并发症。然而,这些膜有提升空间。最近,羧甲基纤维素(CMC)和透明质酸(HA)合并作为一个antiadhesion屏障膜和药物输送系统据报道提供优秀的组织再生和生物相容性。本研究的目的是制造一种新型水凝胶膜由berberine-enriched CMC的树皮p . amurense树和哈(PE-CMC /公顷)。体外抗炎作用进行评估,以确定可能的临床应用。PE-CMC / HA薄膜被混合PE-CMC捏造,HA与聚乙烯醇的加入为基础,形成了一个电影。膜的抗拉强度和ultramorphology进行评估使用万能试验机和扫描电子显微镜,分别。小檗碱膜被确认的内容使用紫外可见分光光度计波长260纳米。膜的抗炎特性测量使用格里斯反应试验。我们的研究结果表明,捏造PE-CMC /公顷释放小檗碱浓度的660μg / ml,获得了最佳的可塑性在30:70 PE-CMC /公顷比率。的berberine-enriched PE-CMC /公顷有抑制炎症刺激有限合伙人的60%。这些结果表明,PE-CMC /公顷膜制作在这项研究中是一个有用的抗炎小檗碱释放系统。

1。介绍

antiadhesion屏障是保持健康的基本要求之一,保护组织免受手术后的并发症。例如,一个antiadhesion屏障膜是至关重要的正常腹腔手术后防止自由组织从粘在一起1]。成功的牙科植体手术,重要的是要保持足够的牙槽嵴维度,它通常需要引导骨再生(GBR)。这个手术使用屏障膜(2)经常使用扩大生产聚四氟乙烯(e-PTFE) [3,4]。然而,临床和实验研究已经证明,不完整的覆盖或牙龈萎缩等并发症可能发生当这个nonresorbable材料用于GBR [5- - - - - -7]。因此,bioresorbable聚合物膜,如聚polyglycolides,开发替代nonresorbable膜。bioresorbable膜的优点是消除需要膜去除手术更大的时效性。然而,据报道,聚合物膜大大与炎症反应相关(8]。胶原蛋白最近介绍了作为GBR膜材料,因为它可以克服的缺点之前nonresorbable聚合物膜(9,10]。然而,胶原膜降解的速度是一个关注当制造屏障膜(11]。

最近,一些天然聚合物被用来制备水凝胶组织障碍。在这些天然聚合物,透明质酸(HA) (12和纤维素13)是两个无处不在的和丰富的生物聚合物用于组织工程和再生医学。生产廉价的GBR膜很容易操纵,羧甲基纤维素(CMC)和哈。CMC是一个基于多糖的水凝胶,当合并与羟磷灰石CMC-based水凝胶提供了出色的组织工程函数(14]。2013年,Sagar等人开发了一个nanohydroxyapatite /明胶和化学羧甲基化甲壳素支架,增强成骨细胞的活动和矿化15]。然而,纤维素基水凝胶缺乏好的机械礼节为临床使用(14]。

透明质酸是一种天然的组件发现在细胞外空间的丰富16和负重关节17,18),据报道在伤口愈合起着重要的作用,保持皮肤水分(19]。此外,它有抗炎、抗氧化和抗菌治疗牙周疾病的影响(20.]。然而,HA的润滑效果的持续时间通常是短暂的和生物效应是不可预测的。来解决这些问题,一种半合成的天然聚合物从CMC结合获得HA已经被开发出来,它可以生成一个新的混合膜用作组织屏障(1,14,21]。中央军委可以通过1 - (3-dimethylaminopropyl)交联与HA 3-ethylcarbodiimide盐酸盐(EDC)与不同交联度(22]。该混合膜可以延长药物释放功能。此外,CMC的问题缺乏力学性能时应用就可以解决。

黄柏Rupr (p . amurense)是一种中药用于治疗不同形式的炎症和疼痛。小檗碱是一个活跃的化合物p . amurense中含量相对较高,已被证明具有抗菌(23和抗炎24]属性。的树皮p . amurense含有丰富的纤维素(25),是否berberine-enriched CMC可以捏造的树皮p . amurense尚未确定。

因此,本研究的目的是制造一种新型水凝胶膜由berberine-enriched CMC的树皮p . amurense和HA (PE-CMC /公顷)。体外抗炎财产评估,以确定可能的临床应用。

2。材料和方法

2.1。物理性质测试哈

HA的粒度分布用于本研究确定使用粒度分析仪(90 +,布鲁克海文国家实验室仪器公司,Holtsville,纽约,美国)。在测试之前,HA样本稀释到0.25毫克/毫升纯净水和搅拌12小时。公顷,PE-CMC /公顷的pH值测量在室温下使用酸碱计(型号6173,JENCO质量工具,圣地亚哥,美国)。热稳定性检测使用thermogravimeter (TGA, TG 209 F3跗骨、Netzsch-Geratebau GmbH德国)。在测试期间,5毫克样品从室温加热到700°C的速度10°/分钟。热分解温度()和剩余重量检测。运动粘度的HA测试使用粘度计(x - 420,大炮仪器有限公司,PA,美国)。40毫克样本添加到分析级水将每个解决方案的浓度为0.5毫克/毫升。磁搅拌1小时后,测试的运动粘度HA是读厘沲单元(cSt)。

2.2。细胞毒性测试在这项研究中使用的哈

细胞毒性测试是根据国际标准ISO10993-5执行。NIH 3 t3和巨噬细胞RAW264.7细胞株的细胞毒性测试HA和PE-CMC / HA薄膜。对于HA测试,NIH-3T3成纤维细胞被播种到培养皿的密度10000细胞/毫升。杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM Gibco,大岛,纽约,美国)补充谷酰胺和10%胎牛血清作为培养基。这些细胞被孵化有限公司37°C的5%₂在100%湿度。NIH-3T3细胞培养2%二甲亚砜(DMSO, Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)是用于一个积极的控制而单独使用DMEM培养的细胞用于负控制。与HA coculturing后24小时,细胞生存能力是决定使用MTT法。570/690纳米波长的吸光度测量使用标仪(型号2020,Anthos Labtec仪器,Eugendorf,细胞膜,奥地利)。

2.3。PE-CMC准备

修改后PE-CMC准备技术从先前的研究(26]。原油p . amurense树皮提取物含小檗碱含量高的准备按照以前的报告。然后残留果渣晒干,磨成粉,沉浸在5%的氢氧化钠(费舍尔科学,宾夕法尼亚州匹兹堡,美国)在室温下2小时,然后加热到90°C 10%氢氧化钠为4小时。NaClO(记述有机物、Geel、比利时):H₂O₂(穿越有机物)= 3:4用于漂白底物,然后用淡水洗净。一个吸气填料用于进一步干燥2小时的衬底。底物在30°C 60分钟碱化,醚化在70°C 150分钟在85%乙醇。衬底冷却后,用75%的乙醇清洗两次,吸气填料用于获得纯CMC衬底。最后,冷冻干燥机是用于3小时获得干PE-CMC粉。

2.4。CMC /公顷和PE-CMC / HA薄膜制造

PE-CMC /公顷膜是由PE-CMC和哈基聚乙烯醇(PVA Sigma-Aldrich)形成一个电影,TWEEN80(一支化工、台北、台湾)乳化。Sapindus mukorossiseed-extracted油润滑了。透明质酸钠(M。W: 2.6×10⁶从一支化学Da)购买。PVA和TWEEN80商用Sigma-Aldrich和一支化工、分别。首先,PVA溶解在蒸馏水在浓度为0.5 g / mL 30分钟的121°C。PE-CMC(10毫克/毫升),哈(30毫克/毫升),TWEEN80,籽油,berberine-enriched CMC添加和电磁搅拌器的混合。当彻底混合,3毫升的混合物是搬到一个圆形模具直径60毫米和15毫米深度。模具然后放进烤箱在37°C 3小时干膜。在这项研究中,CMC /公顷的使用商业化CMC (Sigma-Aldrich)和HA使用上述同样的方法被用来作为对照组。

2.5。膜的机械测试

在测试前,膜切成15×20毫米的长方形。机械测试PE-CMC /公顷和CMC /公顷膜与各种CMC: HA比率(30:70、50:50、60:40)进行使用万能试验机(ags - 1000 D,日本岛津公司,东京,日本)根据ASTM D 638 - 08年的规定。简单地说,样本固定宽度5毫米。十字头的速度被设定为30毫米/分钟和负载应用到样例骨折。抗拉强度是决定力的最大值。

2.6。膜的形态学特征

加强形态学特征,PE-CMC /公顷和CMC /公顷膜表面涂上一层薄薄的钯金(千代田IB-2,日立公司(Hitachi Ltd .),东京,日本)。超微结构图像样本,观察使用扫描电子显微镜(SEM)(型号2400;日立、日本东京)。

2.7。小檗碱检测

小檗碱含量是决定使用NanoDrop紫外可见分光光度计(nd - 1000,热科学、沃尔瑟姆,妈,美国)在260 nm波长在一项研究27]。小檗碱的校准曲线的标准(B3251 Sigma-Aldrich)决心从六个浓度点的浓度范围(37.25 - 1000μ与一个g / mL)值大于0.99。在检测之前,细胞膜溶解在蒸馏水和浓度500创建一个解决方案μ克/毫升。小檗碱释放的大量测试膜计算的标准曲线。

2.8。膜的抗炎试验

测试的抗炎特性CMC /公顷和PE-CMC / HA薄膜,RAW264.7细胞巨噬细胞被播种到96孔板在一个4×10的浓度⁵细胞/毫升和培育37°C和5%孵化器有限公司₂。孵化24小时后,细胞被刺激与1μSigma-Aldrich g / mL的脂多糖(LPS)大肠杆菌菌株055:B5和HA / CMC膜提取介质。N-nitro-L-arginine-methyl酯(L-NAME Sigma-Aldrich)浓度1毫米作为一个积极的控制。264.7原始细胞产生的一氧化氮浓度通过格里斯试验确定。短暂,同等体积的格里斯试剂(N5751σ)是与文化上层清液和混合颜色开发使用标为530 nm (Biochrom EZ读400年,Holliston,妈,美国)。抗炎活性的生产提出了抑制百分比。

2.9。统计分析

细胞生存能力测试,平均值和标准偏差的测量记录。评估样本之间的变化和控制,单向方差分析(方差分析)(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)与图基的事后。一个值低于0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。物理性质的哈

HA粒子有两个种群的大小。如图1,HA粒子大小都集中在100 - 250μ米和600 - 900μm。哈运动粘度的增加浓度的函数(图1 (b))。当HA的浓度从0.1增加到0.8毫克/毫升,HA的运动粘度增加从2.93到36.31。图1 (c)说明了HA的温度记录在这项研究中使用。分解温度()测试HA为71.75°C。剩余的重量为25.82%在700°C。

3.2。细胞毒性测试在这项研究中使用的哈

图2细胞毒性测试的结果显示公顷用于这项研究。NIH-3T3细胞培养的可行性与2% DMSO显著降低了20%。增长分析NIH-3T3细胞培养与HA含量0.4毫克/毫升显示没有相关可行性抑制。即在给定的条件下没有细胞毒性基质释放HA材料。

3.3。小檗碱检测

标准小檗碱的紫外可见光谱图所示3(一个)。有两个吸收乐队在250年和350 nm和疲软的乐队在430纳米左右。的吸收光谱的形状p . amurense树皮中提取小檗碱类似标准。示例也表现出两个吸收乐队在250和350海里。然而,乐队大约430海里不显著。250和350 nm乐队也可以检测到伪造PE-CMC /公顷p . amurense提取(图3 (b))。图4给出了定量的结果紫外检测波长260纳米。装配式PE-CMC /公顷时膜溶解在水中,重大发布了小檗碱的浓度660μ克/毫升。

3.4。机械测试

图5显示了CMC /公顷的机械测试膜捏造在这项研究。膜表现出一个重要的塑料的特点。CMC /公顷的极限强度降低时增加哈。样品混合的比例30:70年,50:50和60:40岁的终极力量,,kgf分别。相比之下,中央军委的最终位移/公顷增加哈量增加时。30的最终位移数据:70年,50:50和60:40 CMC /公顷,,分别为毫米。添加p . amurense提取减少膜的极限强度和伸长。的极限强度和位移PE-CMC /公顷膜kgf和分别为毫米。考虑到塑性、变形能力比力量更重要的目的。同时,哈量可以有一个生物对伤口愈合的影响。自哈量有显著积极影响膜的可塑性,膜将70 wt %公顷用于制造中使用的PE-CMC /公顷以下biofunction测试。

3.5。表面膜的地形

扫描电镜的图像伪造CMC /公顷和PE-CMC /公顷样本显示不同的表面。30:70 CMC /公顷样本与任何统一形状的多孔孔观察(图6(一))。50:50 CMC /公顷样,表面孔隙度明显降低(图6 (b))。有趣的是,60:40 CMC /公顷样例是一个无孔隙的材料。只有60:40 CMC /公顷样本有一个光滑、平面纹理(图6 (c))。PE-CMC /公顷的孔隙表面也可见(图6 (d))。然而,孔不规则形状和显著更大的孔隙大小比CMC /公顷的样本。

3.6。抗炎试验

如图7,当细胞接受有限合伙人(1μg / ml),发现了明显的形态学变化。此外,细胞培养与CMC-HA PE-CMC /公顷没有改变形态变化由于有限合伙人的待遇。然而,CMC-HA PE-CMC /公顷显著影响LPS-treated没有释放的细胞。没有释放的样本归一化通过比较测量数据未经处理的样品。没有释放显著减少(8.56%)指出L-NAME组相比空白控制(图8)。也就是说,L-NAME的没有释放的抑制率为91.44%。264.7时,有限合伙人加载原始细胞处理复合的商业化CMC和HA的释放减少到54.11%。当p . amurense提取是添加到捏造PE-CMC /公顷和用于文化有限合伙人264.7加载原始细胞,发现没有空白控制相比,下降到39.73%。

4所示。讨论

临床前评价表明,HA / CMC是无毒的,摘要,nonimmunogenic,无刺激性的,nonpyrogenic [28]。一项研究表明,HA / CMC不引起炎症细胞因子反应[29日]。因此公顷/ CMC可以不仅一种antiadhesive材料,也为药物释放材料。由于感染是GBR膜失败的主要原因在临床应用30.),开发GBR膜能够进行局部给药预防感染是一个重要的生物材料工程问题。2012年,Epstein-Barash等人伪造的水凝胶交联CMC和HA蛋白/肽释放系统(22]。为临床使用,该混合水凝胶有几个优点,如蛋白质释放缓慢,易于处理和被交付通过微创手段的能力。此外,制造这样的CMC /公顷水凝胶不需要化学添加剂或能源的来源。

的主要生物活性成分p . amurense小檗碱。在这项研究中,提取的p . amurense是添加到捏造PE-CMC释放基质/公顷。如图4,berberine-specific吸光度乐队在之前的研究中发现了260海里(31日]。这一结果表明我们的PE-CMC /公顷膜可以作为berberine-released系统操作。众所周知,小檗碱展览具体药理特性,如抗菌、抗寄生虫、抗炎和anticytotoxic属性(23,24,27]。如图8,捏造PE-CMC /公顷(NO)显著降低炎性细胞因子释放。根据这个结果,它是合理的建议当前PE-CMC /公顷膜可以作为抗菌和抗炎药物释放系统。

据报道,膜的强度是由大小、形状、结构和密度的微孔隙/纳米孔(32]。因为膜的强度减少气孔的大小和孔隙度增加,也就不足为奇了当前CMC /公顷膜的机械性能CMC-to-HA混合比例密切相关(图5)。从图5,我们可以看到更高的CMC浓度导致更高的极限膜强度。这是因为CMC比率的增加会降低膜的孔隙度(图6)。这个结果证实了之前的发现,纤维素基水凝胶缺乏好的机械礼节为临床使用(14]。在合同,HA的数量有显著积极影响的可塑性膜(图5)。这是因为哈是一个高度粘性凝胶(图1 (b))允许水性PE-CMC /公顷捏造在这项研究中,可以注入组织和涂层底层组织的轮廓。

根据特定的特征PE-CMC /公顷,膜可以用于广泛的生物医学应用。例如,伪造PE-CMC /公顷膜有潜力作为候选人治疗阴道感染。阴道上皮细胞的特征变化取决于雌激素和孕激素的浓度的变化。肥沃的期间,阴道是柔软和弹性由于阴道上皮的平衡机制,保持适当的水化和润滑。在某些情况下,比如在哺乳期间,更年期,怀孕后,使用口服避孕药,或在压力下,这种平衡可能被打扰。在这种情况下,阴道干涩的迹象,燃烧的感觉,可以观察到或瘙痒,由于阴道润滑不足。众所周知,HA的主要能力是保持水,保持适量的水分(33]。如图6PE-CMC /公顷膜的超微结构图像的研究中有一个多孔结构。这种孔隙度滋润膜。此外,HA展品数量的治疗功效,包括细胞迁移和分化组织形成的便利化和修复(33]。因此,它是有效和安全的使用HA治疗绝经后妇女阴道干涩的(34]。

然而,HA由酶迅速降解,被组织吸收。这意味着不能用于长期治疗。混合HA与CMC不仅延误HA的吸收,还延长了HA的抗菌和抗炎效果的持续时间和小檗碱(35,36]。公园et al。(2011)表明,肽/蛋白释放CMC /公顷的概要文件可以很容易地调整,通过调整其交联密度(21]。在这项研究中,交联并没有添加在制造PE-CMC /公顷。了解交联的程度影响小檗碱的释放效率和膜的力学性能是本研究的局限性。

5。结论

总之,PE-CMC /公顷膜制作在这个研究小檗碱发布系统提供抗菌和抗炎功能。PE-CMC /公顷的优秀的粘度是一个可能的候选人为生产水凝胶治疗感染的疾病。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Haw-Ming黄和Chun-Han Ko了同样的工作。

确认

作者想表达自己的真诚感谢森林湖有限公司,贵州,中国提供的树皮p . amurense树和研究资源的大力支持。

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