克隆和表达γ-聚谷氨酸合成酶基因PGS在BCA枯草芽孢杆菌WB600

摘要

克隆和表达γγ-聚谷氨酸（γ-PGA）合成酶基因PGS在BCA枯草芽孢杆菌中，pWB980质粒被用于构建和转染重组表达载体pWB980-PGSBCA进枯草芽孢杆菌WB600。PgsBCA在pWB980质粒的P43启动子作用下表达。结果表明，重组菌具有合成能力γpga。表达产物从细胞外分泌到发酵液中，产率为1.74 g/L以上。γ对发酵液中的-PGA样品进行了纯化和表征。玉米胚芽蛋白酶解物的γ-PGA在单一形式存在，构成仅简单谷氨酸，其中匹配的红外光谱的特征γ-PGAstandard, and presented as multimolecular aggregates with a molecular weight within the range of 500–600 kDa. Expressing theγpga合成酶基因pgsBCA在枯草芽孢杆菌系统具有潜在的工业应用。

1.介绍

伽马聚谷氨酸（γ-PGA）是一种新型的水溶性可生物降解的材料。它是由间酰胺键的缩合而形成的阴离子多肽α氨基酸和γ微生物中D-和/或l -谷氨酸的-羧酸基团。无毒、食用、粘附、成膜、保湿[1]。γ-PGA及其衍生物可作为药物载体，并已被广泛应用于医药，化妆品，食品，农业生物黏附材料，以及污水处理等行业，并已成为在生物聚合物研究中最有趣的话题之一[2]。

传统上，γ-PGA主要由微生物发酵产生[3.]。细菌参与γ-PGA合成多为革兰氏阳性(属:芽孢杆菌，等级：杆菌）并且被分类为基于它们对谷氨酸的需求[谷氨酸 - 依赖性或谷氨酸非依赖类型4]。野生型γ-PGA生产菌具有不稳定遗传力，容易导致的能力，以合成降低或丧失γ-PGA发酵期间，经历γ-PGA降解和产生的副产物的胞外多糖，从而降低产品的成品率。相对于传统的诱变育种，基因工程技术已有望成为一种有效的方法来创建γpga高产菌株。Ashiuchi等[5]和Tarui等人[6]证实，PGSB,PGSC，和PGSA是涉及到的三个基本基因γ-PGA合成谷氨酸依赖性菌株。Urushibata等。[7]和Jiang等。[8含有]构建重组质粒PGSBCA基因通过不同的融合表达方式进一步转化为质粒大肠杆菌以获得均能够产生的阳性克隆γpga。大肠杆菌，革兰氏阴性细菌，已报道作为主要宿主菌株用于转化的重组载体γ-PGA合成酶基因。然而，它的合成酶基因主要是源自枯草芽孢杆菌（革兰氏阳性细菌）。这两种类型的细菌的膜结构和蛋白质分泌系统而变化，这又可能导致在重组的不良定位表达γ在细菌细胞膜-PGA合成酶系统[9]。因此，表达的水平γ-PGA在宿主菌株较低;和量γ-阳性克隆的pga仅在0.024-0.134 g/L范围内[10]。枯草芽孢杆菌作为食品安全的原核表达宿主，具有一些优良的表达特性γ-PGA那大肠杆菌不具备。例如，枯草芽孢杆菌能够表达可溶性和非融合蛋白，并优先表达非致病和非表观密码子[11]。此外，其转化后的重组质粒表达量高。因此，其表达产物在为食品、医药行业制造生物工程产品方面具有更大的优势和潜力。然而，有关克隆和表达的研究PGS在BCA枯草芽孢杆菌是比较稀缺的。迄今为止，的表达γ-PGA合成酶基因PGSBCAstill need D-xylose and L-arabinose induced, generally with poor expression yield and low molecular weight (only 200–500 kDa) [12]，说明需要解决这个特定的瓶颈。考虑到这一点，在本文中，重组质粒表达PGSBCA基因重建并高表达枯草芽孢杆菌以提高其产量和分子量γpga。枯草芽孢杆菌168已广泛应用于研究γ-PGA调节。这是为数不多的菌株之一是拥有一套完整的γ-PGA合成酶基因，但不产生γpga (13]。本研究中所用的基因组DNA枯草芽孢杆菌168作为DNA模板来扩增γ-PGA合成酶基因PGSBCA并进一步克隆PGSBCA基因进入枯草芽孢杆菌将表达载体pWB980转化为型菌株枯草芽孢杆菌WB600。我们构建了重组枯草芽孢杆菌用于表达系统γ-PGA合成，其可充当用于高产工业生产的基础γ-基于工程的pga枯草芽孢杆菌表达系统。

2.材料和方法

2.1。细菌菌株和质粒

枯草芽孢杆菌168和枯草芽孢杆菌WB600购自上海健密生物技术有限公司(中国上海);大肠杆菌JM109准备，并在我们的实验室中保存，在先前的研究描述。PMD19-T载体，并枯草芽孢杆菌表达载体pWB980购自TakaRa生物技术(大连)有限公司(中国大连)。

2.2。试剂

所有限制性内切酶，T4 DNA连接酶，TaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA梯级标记、蛋白质分子量标记购自TakaRa生物技术(大连)有限公司。质粒提取和琼脂糖DNA提取试剂盒购自天根生物技术(北京)有限公司(中国北京)。购买细菌基因组DNA提取试剂盒，引物由生工生物技术(上海)有限公司(中国上海)设计合成。薄层色谱用硅胶板购自青岛吉益达硅胶试剂厂(型号:50×100 GF254，中国山东)。

2.3。培养基

Lysogeny broth (LB) was prepared using 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, and 10 g/L NaCl (pH 7.0) and 2.0% (W/V) agar powder to solidify the medium.大肠杆菌和枯草芽孢杆菌选择了50个转化子μ克/ mL氨苄青霉素（）和30 μ卡那霉素(克/毫升）， 分别。Fermentation broth for the genetically engineered recombinant bacteria contained 40 g/L glucose, 0–100 g/L sodium glutamate, 6 g/L (NH₄)₂所以₄,2 g/L K₂HPO₄， 0.2 g/L MgSO₄（pH 7.5）中。

2.4。引物设计

参照NCBI数据库，上游和下游PGSB,PGSC，和PGS的编码基因序列枯草芽孢杆菌168设计如下:BAC1: 5′-CGCGGATCCATGTGGTTACTCATFATAGCC-3’(的限制位点BamHI内切酶有下划线）;BAC2：5'-CCC一个AGCTT的限制位点C-3’后III核酸内切酶是下划线）。

2.5。克隆γpga合成酶基因

枯草芽孢杆菌168的基因组DNA用作模板。BAC1和BAC2引物扩增基因。PCR反应体系包括2 μ微升DNA模板，10 μL的5x缓冲液，2μ大号的dNTPs，2 μL对BAC1和BAC2的单个引物，0.5μL 5x引物星和无菌双蒸馏水，准备最终体积为50μL.反应条件:94℃3 min, 94℃30 s, 55℃15 s, 72℃3 min，最后72℃延长10 min, 30个循环。用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR反应产物进行鉴定。PCR产物用DNA快速恢复试剂回收，连接到pMD19-T载体中，转化成大肠杆菌使用氯化钙JM109感受态细胞₂方法。所选择的单菌落接种到液体LB扩大质粒。中间载体pMD-PGSBCA然后获得和使用鉴定Bam你好,后三、双酶切及测序。

2.6。建设枯草芽孢杆菌表达载体

Bam你好,后进行III双重消化以切割中间载体PMD-T-PGS然后将BCA和pWB980质粒连接到重组表达载体pWB980-中PGSBCA(图1)。对重组质粒进行卡那霉素抗性筛选，然后进行质粒提取、酶切和测序鉴定，得到菌株的阳性克隆。

2.7。诱导表达PGSBCA基因

pWB980 -PGSBCA质粒转化为枯草芽孢杆菌获得重组菌株芽孢杆菌WB600 -PGSBCA，接种于5 mL新鲜液体LB中，其中含有30μg/mL卡那霉素，在37℃200转/分的摇床中孵育过夜。次日，取2%接种的培养悬浮液接种到250 mL的烧瓶中，加入100 mL含卡那霉素的重组发酵培养基，在37℃、200 rpm的摇床中孵育36-48 h，直至细菌浓度停止增长，终止发酵。pWB980 -PGSBCA含有一个组成性的P43启动子。因此，在发酵过程中我们不添加任何诱导剂。在发酵培养基中加入约0-100 g/L的谷氨酸钠作为合成底物γ-PGA以进一步研究不同底物浓度对的合成收率的影响γpga。

2.8。γ-PGA分离纯化

After adding the optimal substrate concentration and fermentation had ended, the fermentation medium was centrifuged at 5,000 rpm for 5 min to collect the supernatant. The supernatant was mixed with 4 volumes of absolute ethanol and left to stand overnight at 4°C, followed by centrifugation at 4,000 rpm, and then the supernatant was discarded. The pellet was redissolved in the appropriate amount of distilled water and further centrifuged at 5,000 rpm to obtain the supernatant. A 20 mg/mL solution of proteinase K was added into the supernatant and dialyzed overnight using deionized water. After the centrifugation as earlier described, the supernatant was collected and freeze-dried to obtain the purified solid samples ofγpga。γ-PGA样品储存在-70℃直至分析。

2.9。水解的γ-PGA

A 0.5 g purifiedγ-PGA样品加入10 mL 6 moL/L的HCl中，真空10 min，密封。样品在110℃水解12-24 h，冷却后过滤，在6 moL/L NaOH中重新溶解，调整pH至7.0。将水溶液转移到100ml烧瓶中，用硅胶板对水解液进行TLC，分析其氨基酸组成。

2.10。测定γ-PGA内容和属性

γ-发酵液pga含量采用高效液相色谱法测定[14]。的纯化γ-PGA样品采用岛津公司IR presti- 21红外光谱仪进行红外光谱分析，岛津(中国)有限公司(北京，中国)。使用溴化钾(KBr)作为标准物质[15]。的分子量γ-PGA通过SDS-PAGE [确定16]。

3.结果

3.1。PCR扩增和鉴定γpga合成酶基因PGSBCA

靶基因通过PCR扩增。数字2示出分离，并且使用琼脂糖凝胶电泳分析该PCR产物。经放大的所观察到的尺寸PGSBCA片段，2.8 kb，与我们预期的结果一致。采用琼脂糖DNA提取试剂盒对PCR产物进行回收和纯化。经DNA测序确认，PCR产物的DNA序列与报道的基因序列100%相同枯草芽孢杆菌168.

3.2。鉴定枯草芽孢杆菌表达载体

将构建的重组表达载体pWB980-转化PGSBCA，到感受态细胞，收集质粒和使用鉴定Bam你好,后III限制酶消化。数字3.示出，如图双限制酶消化的该映射中，切割片段的大小为相同的PGSBCA的PCR产物，从而确认最初的重组表达载体的构建成功，pWB980-PGSBCA。

3.3。不同底物浓度上的合成收率的影响γ-PGA

数字4显示，与量的底物，谷氨酸的增加，所生产的γ-PGA增强。However, when glutamate concentration was >50 g/L, the synthetic yield ofγpga拒绝了。这个结果表明PGSBCA是由分泌枯草芽孢杆菌WB600。表达了产品,γ-PGA，可以分泌到胞外的发酵液。使用较低的底物浓度，我们观察到，重组细菌没有合成γ-PGA，说明重组菌需要过量的底物才能合成γpga。的refore, from the perspective of economic efficiency, we identified that a substrate concentration of 50 g/L was optimal to synthesize the highest possible amount ofγpga (1.74 g / L)。

3.4。重组的表征γ-发酵液中的pga

数字5示出了水解物样品的TLC结果在紫外光下观察到，其中，后的酸水解γ-PGA，观察到在硅胶板上但均匀的颜色强度的仅单个斑点没有其他频带。其保留（）值与标准，谷氨酸斑点的一致，表明水解产物没有其他氨基酸和其它蛋白质杂质。这些水解产物是在单一的形式，仅由纯谷氨酸。数字6示出的红外（IR）光谱γpga。的absorption peak at 3,421 cm⁻¹是对称伸缩振动带N-H的;和the absorption peak at 1,649 cm⁻¹为酰胺基-CONHR的不对称伸缩振动带。这两个峰是用于鉴定酰胺和酰胺基存在的主要指标γpga分子。吸收峰为1,408 cm⁻¹为COOH的对称伸缩振动带;吸收峰为1076厘米⁻¹标志峰是否代表脂肪烃-CH的存在₂或-CH_3.(弯曲振动)，在分子结构中;吸收峰在1000 cm范围内⁻¹-500厘米⁻¹是由(CH₂)_n(）平面摇摆振动，以及在平面内弯曲振动。重组的光谱特性γ-PGA在发酵液与标准一致γ-PGA的红外光谱，表明本研究得到的样品含有N-H和C=O官能团，以及脂肪族烃结构(CH)₂)₄的γpga (17，从而确认该样本是γpga。的分子量γ后发酵，分离获得-PGA的样品，和重组菌株的分离芽孢杆菌WB600 -PGSBCA使用SDS-PAGE确定。数字7显示，的分子量γ-PGA在500 - 600kda之间，并作为一个多分子质量的聚集体出现，但不是单一的分子组成。

4.讨论和结论

本研究对基因的克隆和表达进行了评价γ-PGA合成酶基因PGS在BCA枯草芽孢杆菌和使用的质粒pWB980以构建重组表达载体，pWB980-PGS并进一步将重组表达载体转入BCA枯草芽孢杆菌WB600。pWB980的P43启动子诱导的表达PGSBCA;然后该表达载体的宿主细胞显示出的容量，以合成γ-PGA和的产率γ-PGAreached ≥1.74 g/L. The isolated and purifiedγ-来自发酵液的pga样品被确认有单一形式的水解物，仅由纯谷氨酸组成。这个结果符合标准的特点γ-PGA的红外光谱显示了一个多分子质量的聚集，分子量在500 - 600kda之间。

本研究采用枯草芽孢杆菌作为表达宿主，并且PGSBCA基因起源和表达枯草芽孢杆菌。的γ-PGA合成酶系统被更好地定位在细胞膜上（如第1)。因此，合成的收率和分子量γ-PGA产生在枯草芽孢杆菌were as high as ≥1.74 g/L and between 500 and 600 kDa, two features that are consistent with or even higher than the expression system of大肠杆菌和B.枯草杆菌之前被描述为具有高表达效率的s [18- - - - - -20]。的分子量γ-该主机所表达的pga在现有报告中最高[21- - - - - -24]。重组表达载体pWB980-PGS本研究中BCA含有P43启动子。因此，使用异丙基成本较高β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG），d木糖和L-阿拉伯糖作为诱导以分泌的PGSBCA到细胞外发酵液是用在本研究中开发的方法规避。这种技术也可在工业生产被潜在使用，因为它可提高产品的稳定性，简化提纯工作，并有更多的明显的应用潜力的优势。

虽然构建的重组菌芽孢杆菌WB600 -PGSBCA具有合成能力γ-PGA，我们的结果还是找不到的最高合成收率γ-突变菌发酵产生的pga (40-50 g/L) [25,26]。因此，我们下一步研究的研究将重点引进血红蛋白，其他外源基因，或某些控制序列有效地合成和表达γ-PGA并增加细菌浓度、吸氧量或内源性合成酶表达，从而最终增加γpga收益率(27,28]。或者，我们将敲除降解酶的基因γ- pga产生菌株减少γ-PGA降解，从而增加γpga收益率(29]。因此，我们今后的研究方向和目标将集中在通过基因工程建立和修改我们目前的工程菌株，以提高其性能，并进一步提高γ-PGA产量，从而为工业化高产生产奠定基础γ-PGA工程细菌的基础上枯草芽孢杆菌表达系统。

相互竞争的利益

作者声明，本论文的发表不存在任何利益冲突。

致谢

这项研究是由学生创新创业训练计划在福建省（编号201511312053）的支持，JK项目为福建省科学技术（不。JK2014051）部，龙岩市科技计划项目（不。2015LY32）。

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