瑞香素对脑缺血/再灌注损伤保护老鼠通过抑制TLR4 / NF -κB信号通路

文摘

越来越多的证据表明,免疫介导机制有助于开发脑缺血/再灌注(I / R)损伤。瑞香素(DAP)是一种香豆素衍生物提取达芙妮odoravar,显示抗炎作用。然而,衣冠楚楚的在脑I / R损伤的影响还不清楚。最近的研究表明TLR4 / NF -κB信号通路参与脑I / R损伤的破坏性炎症过程。本研究旨在调查DAP的影响对脑I / R损伤体内及其可能的机制。磷酸二铵是管理之前在老鼠大脑中动脉阻塞再灌注。神经评分、脑梗塞大小、炎性细胞因子的水平,凋亡神经细胞TLR4的水平,NF -κB p65,和我κBα是估计的。结果表明,一个明显改善神经分数和梗塞大小在DAP-treated MCAO / R后小鼠。DAP降低TNF的过度治疗α,il - 1β神经细胞凋亡,il - 6和减毒。此外,衣冠楚楚的治疗降低了TLR4的表达,我κB -α退化,以及核易位NF -κb .综上所述,我们的研究结果表明,衣冠楚楚的发挥神经保护和抗炎作用在脑I / R损伤。的潜在机制参与抑制TLR4 / NF -κB介导炎性信号通路。

1。介绍

缺血性中风是死亡和残疾的主要原因在全世界成年人1]。静脉溶栓与组织纤溶酶原激活物(t-PA)是目前治疗缺血性中风的批准。然而,第二个障碍被称为脑缺血/再灌注(I / R)损伤提出了t-PA治疗(2]。这源于一个复杂的病理生理事件的模式。免疫介导机制的重要作用在脑I / R损伤已经越来越认可在过去几十年(3通常]的重要贡献的toll样受体)诱导的炎症反应已经证明(4]。toll样受体4 (TLR4)被发现高度诱导脑I / R后(5]。此外,据报道,TLR4 / NF -κB信号通路参与脑I / R损伤的破坏性炎症过程(6),抑制TLR4 / NF -κB信号通路可以下调炎症和减轻脑损伤(7]。因此,TLR4 / NF -κB信号通路可能是脑I / R损伤的治疗目标。

目前,大量的研究集中于探索抗炎和神经保护药物,可以减轻脑I / R损伤。天然产物可能代表的理想来源开发安全有效的代理管理脑I / R损伤。瑞香素(DAP,图1),香豆素衍生物提取达芙妮odoravar。,是一种天然的抗炎产品(8,9]。中药Zushima,主要由瑞香素,被用于治疗炎症性疾病。最近的研究表明,衣冠楚楚的可以提供抗炎作用在类风湿性关节炎(10,11),endotoxin-induced肺损伤(12),急性胰腺炎(13]。DAP抑制炎症细胞的浸润,减轻炎性损伤状态小鼠通过减少促炎细胞因子的生产,包括肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α),interleukin-1β(il - 1β)和白细胞介素- 6 (il - 6) [10- - - - - -12]。更重要的是,新发现表明DAP实验性自身免疫性脑脊髓炎有神经保护作用[14)和预防慢性不可预知的应激认知缺陷(15]。然而,衣冠楚楚的神经保护作用脑I / R损伤是不清楚和弹跳能力去对抗炎症信号通路在大脑还有待确定。

因此,鉴于DAP的功能相关性在炎性疾病和神经病理学,我们认为DAP防止脑I / R损伤TLR4的差别,通过对这些基因/ NF -κB信号通路。我们试图探索DAP的潜在作用在脑I / R损伤和参与机制。

2。材料和方法

2.1。动物

C57BL / 6小鼠(23-28 g)从实验动物中心,获得武汉大学,湖北,中国。老鼠在12 h暗光周期情况提供食物和水。所有实验过程涉及动物按照指南的护理和使用实验动物由国立卫生研究院和协议是由武汉大学动物实验伦理委员会批准。

2.2。大脑中动脉闭塞的制备和再灌注(MCAO / R)模型

鼠标和5.0%异氟烷麻醉,维持在70% 1.5%异氟烷N₂O和30%啊₂使用一个小动物麻醉系统。这是放置在一个操作表在仰卧位。手术操作显微镜下进行。左侧颈动脉三角,颈总动脉(CCA),颈动脉分叉,颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)受到钝性剥离。ECA的CCA暂时结扎和永久的结扎缝合6/0。然后,ECA凝固,将远端结扎,收回了尾。两个在ICA临时哨卡准备:一个远端分支和其他完全高于分岔。执行一个动脉切开术ECA树桩和单丝缝合线是插入。单丝缝合线慢慢先进达到终端ICA直到轻微阻力感觉和结扎ICA收紧。然后,切口被暂时关闭,鼠标放置在笼子里。 One hour after the occlusion, the mouse was reanesthetized and the monofilament was gently removed from the MCA. The hole was closed with electrocautery and normal blood flow perfusion was reestablished. After recovery from anesthesia, the mouse was returned to the cage and raised at 23 ± 1°C.

2.3。实验小组和瑞香素治疗

小鼠随机分为四组,如下所示():虚假的操作组,MCAO / R组,MCAO / R +汽车集团和MCAO / R + DAP组。瑞香素纯度> 99.4%是来自Tauto生物技术有限公司有限公司(上海,中国),在0.9%盐水稀释。瑞香素的解决方案是通过腹腔内注射接种MCAO / R前30分钟。在初步实验中,小鼠获得三种不同剂量的DAP(5、10和20毫克/公斤)。同等体积的0.9%生理盐水在MCAO / R +车辆管理组。

2.4。评估神经赤字

神经赤字被一名调查员盲法评估实验24小时后再灌注组。评分系统是基于5点量表系统前面描述的(16):没有神经赤字,0;未能充分扩展右前爪,1;向右绕,2;下降,3;无法走自发和沮丧的意识水平,4。

2.5。评估脑梗死

DAP在脑梗死体积的影响评估了2,3,去除氯(TTC)染色。脑缺血/再灌注损伤后24小时内,小鼠安乐死在深用10%水合氯醛麻醉。大脑很快被删除,冻结在−20°C 10分钟。然后,日冕部分减少2毫米厚度和切片沾2% TTC解决方案(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)20分钟37°C后用4%多聚甲醛固定过夜。正常脑组织是染色深红色,而梗塞的面积仍然苍白的。梗塞区被观察者分析,盲目的实验条件,使用ImageJ分析软件(1.37 v NIH),梗死体积的百分比计算(如前所述17]。

2.6。ELISA测定炎性细胞因子

炎性细胞因子(TNF -的水平α,il - 1β,并使用ELISA测定il - 6)量化工具(博士德,湖北,中国)。实验根据制造商的指示。

2.7。TUNEL分析来确定神经细胞凋亡

formalin-fixed组织是嵌入在石蜡和切割在4μ米厚的切片机。的部分被TUNEL分析化验检测凋亡细胞。TUNEL分析工具包就从罗氏分子生化药剂,购买德国曼海姆实验是根据制造商的协议进行的。凋亡细胞与凝聚核染色棕色TUNEL检测,而正常细胞大,圆的,而不是彩色。光学显微镜下分析了阳性细胞实验的研究员失明组。脑损伤的程度被TUNEL-positive细胞的百分比计算。

2.8。免疫印迹分析

总蛋白提取的梗塞皮层和蛋白质浓度测定用BCA化验设备按照制造商的指示(Beyotime生物科技、江苏、中国)。1/4的体积5 x加载缓冲区添加和紧随其后的是变性的沸水浴10分钟。样品,包含40µg蛋白,被加载,SDS-polyacrylamide凝胶电泳分离的12%。随后,蛋白质转移到PVDF膜,阻止了两个小时的有5%脱脂牛奶在室温和孵化兔子anti-TLR4 (Abcam 1: 300年,剑桥,妈,美国),anti-NF -κB p65(1: 2000年,Proteintech Rosemont,美国),anti-IκBα(1:2000年,Proteintech Rosemont,美国),反β肌动蛋白(1:200,博士德,湖北,中国),和anti-Histone 3(1: 2000年,Proteintech Rosemont,美国)抗体在一夜之间在4°C瓶然后洗,其次是孵化与相应HRP-conjugated二级抗体(博士德,湖北,中国)。最后,它的解决方案是添加到显示的乐队和灰度值分析了ImageJ软件(NIH)。

2.9。统计分析

数据是平均数±标准差。平均值之间的差异被学生的评估以及或单向方差分析测试。所有测试的值被认为是具有统计学意义。使用SPSS 17.0软件进行统计分析。

3所示。结果

3.1。衣冠楚楚的对神经的影响分数,MCAO / R后梗塞大小

MCAO / R模型建立。确定DAP的神经保护效应对脑I / R损伤,我们评估了神经学分数和脑梗塞大小MCAO / R(图24小时后2)。5毫克/公斤的弹跳并不影响神经成绩或梗塞大小与车辆()。然而,神经功能评分明显改善通过10毫克/公斤,20毫克/公斤的DAP治疗(,图2(一个))。TTC-stained日冕部分,与此同时,随着演示的梗塞大小也减少了在同一剂量与车辆(,图2 (b))。此外,10毫克/公斤,20毫克/公斤的DAP防止脑I / R损伤相同的学位这个模型()。基于这些结果和先前的研究14,15),最佳治疗剂量的DAP(10毫克/公斤)是用于以下实验。

3.2。DAP TNF的表达——的影响α,il - 1βMCAO后,il - 6 / R

确定在TLR4 / NF -下游效应器κB信号通路,炎性细胞因子(TNF -的水平α,il - 1β和il - 6)被ELISA(图检查3)。结果表明,肿瘤坏死因子-α,il - 1β强劲,il - 6表达虚假的组(;)。然而,衣冠楚楚的政府明显降低肿瘤坏死因子的水平α,il - 1β和il - 6 ()。这些发现表明DAP抑制脑卒中后炎症反应。

3.3。DAP MCAO后神经细胞凋亡的影响/ R

进一步评估DAP后神经细胞凋亡的影响脑I / R损伤,我们检查了使用TUNEL检测凋亡细胞死亡。如图4,我们发现凋亡细胞的数量在MCAO / R组显著增加而虚假的集团()。然而,凋亡细胞的数量明显减少的DAP治疗组相比,汽车集团(),这意味着该凋亡DAP脑I / R损伤的活性。

3.4。TLR4 / NF -瑞香素的影响κB信号通路在MCAO / R老鼠

提供证据关于TLR4 / NF -的贡献κB信号通路的保护作用DAP治疗,TLR4、NF -κB p65,和我κBα蛋白质含量测定,免疫印迹分析(图5)。TLR4的蛋白质含量和NF -κB p65 MCAO / R组被大量增加而虚假的集团(;),而TLR4和NF -κB p65 DAP相比,治疗组显著下降的汽车集团()。此外,DAP治疗显著降低我的退化κBα()。这些结果表明TLR4 / NF -κB信号通路参与DAP的保护作用在脑I / R损伤。

4所示。讨论

本研究的结果表明,DAP显示神经保护效应在MCAO / R脑I / R损伤老鼠。一个明显改善神经功能缺损评分和梗塞大小在DAP-treated老鼠再灌注后24小时。与此同时,DAP降低TNF的过度α,il - 1β神经细胞凋亡,il - 6和减毒。此外,我们评估的影响DAP TLR4的表达,NF -κB p65,和我κBα,这表明潜在的神经保护作用的机制与抑制TLR4 / NF -κB信号通路。

脑缺血/再灌注损伤是一个严重的临床问题与高死亡率和发病率。最近,越来越多的证据表明,免疫介导机制发挥重要作用在脑I / R后的继发性脑损伤(3,18]。免疫介导机制成为一个新边疆和需要更多的考虑在制定治疗策略对提高脑I / R损伤的结果。抑制炎症反应已经脑I / R损伤的治疗目标。

瑞香素,天然的香豆素衍生物与传统的中草药达芙妮odoravar,据报道显示抗炎作用[8,9,19]。最近的研究表明,衣冠楚楚的保护作用在炎性疾病和神经病理学10- - - - - -15]。然而,衣冠楚楚的神经保护作用的脑I / R损伤尚未明确和衣冠楚楚的能力去对抗炎症信号通路还有待确定。为了发展脑I / R损伤小鼠,我们建立了脑I / R MCAO / R(引起的小鼠模型20.]。神经评分和脑梗塞大小的评价表明,衣冠楚楚的治疗有效地防止脑I / R损伤诱导MCAO / R。10毫克/公斤,20毫克/公斤的DAP防止脑I / R损伤相同的程度,而5毫克/公斤的DAP没有显示神经保护效应。根据这一结果和之前的研究[14,15),10毫克/公斤被选为最佳治疗剂量在随后的实验。

在脑I / R损伤后的炎症反应,神经胶质细胞被激活和外周免疫细胞渗透到大脑,导致大量炎性细胞因子的分泌,引起神经细胞凋亡。肿瘤坏死因子-α,il - 1β和il - 6的潜在的炎性细胞因子参与发展和大脑脑I / R损伤观察TNF -增加的情况α,il - 1β,il - 6 (21,22]。在目前的研究中,我们的研究结果表明,DAP显著降低肿瘤坏死因子的水平α,il - 1β,il - 6和减毒神经细胞的凋亡。因此,衣冠楚楚的抑制脑卒中后炎症反应。我们探讨了潜在机制后的神经保护和抗炎作用的研究。

激活先天免疫受体如toll样受体(通常)已被证实能诱导炎症反应中起着重要的作用[3,18]。通常代表一个家庭的跨膜模式识别受体,它可以激活内源性有关分子模式(抑制)从受伤或压力释放细胞在缺血情况下。TLR4是第一个哺乳动物TLR认可。抑制可以激活TLR4 / NF-kB信号通路在邻近的小胶质细胞和诱导促炎细胞因子的释放,从而导致神经细胞的变性和凋亡23]。最近的研究也表明TLR4是高度后诱导脑I / R和脑I / R损伤减轻TLR4-deficient老鼠(5,24]。所有这些结果表明TLR4 / NF -κB信号通路参与了脑I / R损伤。因此,我们认为DAP可能防止脑I / R损伤通过抑制TLR4 / NF -κB介导炎性信号通路。在目前的研究中,我们发现脑I / R损伤与TLR4表达显著增加,我κB -α退化,以及核易位NF -κB,与先前的研究一致。然而,DAP治疗显著下降TLR4的表达,我κB -α退化,以及核易位NF -κb .这些结果表明DAP抑制TLR4 / NF -κB介导炎症信号通路在脑I / R损伤。综上所述,我们的研究结果表明TLR4 / NF -κB信号通路参与神经保护和抗炎作用的弹跳在老鼠脑I / R损伤。

5。结论

总之,目前的研究表明,DAP缓解脑I / R损伤通过减少炎性细胞因子的生产和体内神经细胞凋亡。此外,衣冠楚楚的潜在机制负责神经保护和抗炎作用是参与抑制TLR4 / NF -κB介导炎性信号通路。DAP显示治疗中风的治疗潜力。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是支持由中国国家自然科学基金(81372683)。

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