蛋白质组的变化人类骨髓间充质干细胞诱导1,4-Benzoquinone

文摘

苯是对苯二酚在肝脏代谢,随后运往骨髓进一步氧化,4-benzoquinone (1, 4-BQ),这可能与白血病等血液疾病。在目前的研究中,我们调查了蛋白质组的人类原发性骨髓间充质干细胞(hBM-MSCs)治疗1,4-BQ。我们确定了32个差异表达的蛋白质。HSP27和波形蛋白,其中两个验证mRNA和蛋白水平及其细胞定位被免疫荧光检查。我们还发现RAP1GDS1 mRNA水平的增加,新陈代谢的关键因素已被确定为在各种造血系统恶性肿瘤融合伙伴。因此,这些差异表达蛋白可以扮演重要角色在benzene-mediated hematoxicity。

1。介绍

苯、挥发性溶剂和无处不在的室内空气中污染物或户外环境,主要来自交通排放,其次是石油和燃料的生产。暴露于苯引起白血病和其它血液疾病,如再生障碍性贫血、脊髓发育不良,恶性淋巴瘤(1,2]。最近的研究进一步表明,长期的职业或环境暴露于低剂量的苯也能导致血液疾病(3]。之前的研究表明,苯对造血障碍的影响机制是复杂的,包括DNA损伤、DNA甲基化,基因组不稳定性和细胞凋亡4,5]。动物和人类接触苯毒性的研究发现从母公司化合物生物转化反应的物种。苯本身不具有基因毒性(6]。描述由美国环境保护署(EPA, 1998),转移到苯酚代谢物(苯酚、邻苯二酚和对苯二酚)在肝脏是一个重要的苯中毒的主要事件。这些代谢物然后运送到骨髓,氧化酵素的来源。其中氧化酵素,髓过氧化物酶含量特别高,而激活对苯二酚,4-benzoquinone (1, 4-BQ),更多的活性物种的苯(6]。然而,迄今为止,苯在血液学毒性的机制仍不清楚。

目前尚不清楚如果1,4-BQ负责苯毒性。最近的研究表明,苯引起的DNA损伤或细胞毒性可能归因于生产活性氧(ROS),导致加合物的蛋白质和DNA, DNA链断裂,抑制DNA修复。活性氧诱导苯的代谢产物引起造血障碍。在以前的研究中,1,4-BQ鸡成红血球细胞诱导活性氧HD3细胞。建议苯可能发挥其毒性通过ROS-mediated c-myb体外信号通路(7]。1,4-BQ也形成DNA加合物或蛋白质在体外和体内。盖斯凯尔等人发现从DNA的四大DNA加合物的形成反应,4-BQ体外(8]。增加的白蛋白加合物(铝青铜)1,4-benzoquinone (4-BQ-Alb)也发现苯作业工人(9,10]。分析mRNA表达造血干细胞(hsc) 129 / SvJ (129 x1 / SvJ)小鼠暴露于1,4-BQ体外显示DNA修复基因表达的改变相比,控制肝星状细胞(11]。1,4-BQ是毒药的拓扑异构酶II与DNA修复相关体外(12]。如果苯暴露所造成的DNA损伤不能被正确修复,细胞凋亡,以防止扩散或突变的细胞转变成恶性肿瘤的发展。其他研究表明,苯的活性代谢物如1,通过共价4-BQ发挥他们的毒性作用和/或蛋白质氧化损伤。苯及其相关蛋白metabolites-mediated hematoxicity,包括CYP2E1、芳基碳氢化合物受体(AhR)、髓过氧化物酶、微粒体环氧化物水解酶,醌氧化还原酶1 (NQO1),硫氧还蛋白,联接蛋白43岁和拓扑异构酶(13- - - - - -15]。这些蛋白质有各种各样的功能在细胞新陈代谢,氧气压力、细胞信号交易,和DNA修复。

之前的研究表明,骨髓干细胞可能目标benzene-induced细胞毒性和DNA损伤,导致造血疾病和癌症16- - - - - -18]。在骨髓中造血干细胞(hsc) (19)是一个小的人口(< 0.05%的BM)的自我更新,多能细胞产生血细胞。在先前的研究中,肝星状细胞表现出剂量依赖性细胞毒性反应苯的metabolite-1 4-BQ接触(16]。暴露于苯还逮捕了肝星状细胞的细胞周期20.]。最近建议,在骨髓间充质干细胞(msc),另一种干细胞,提供结构和功能支持造血作用。与肝星状细胞在骨髓msc colocalize,形成多功能、自我更新的mesenspheres肝星状细胞所需的维护,自导,和迁移19]。Zolghadr等人的研究结果显示,更高浓度的BQ在msc诱导细胞死亡24小时的21]。我们之前的研究还发现,1,4-BQ不仅抑制肝星状细胞的增殖活动也抑制了msc的增殖(22]。我们推测,msc可能涉及启动,发展,各个方面的hematotoxic苯及其代谢产物诱导的损害。msc的机制造成的损害苯及其代谢物仍不清楚。

因此,本研究的目的是确定1,4-BQ hBM-MSCs诱导蛋白的变化资料。它将帮助我们找到新目标蛋白质和分子机制探索苯及其引起的造血毒性代谢物。

2。材料和方法

2.1。hBM-MSCs的隔离和栽培

伦理委员会批准的这项研究是浙江医学科学院(浙江,中国),按照《赫尔辛基宣言》。书面知情同意了从三个男性志愿者年龄在20到40年之前的研究。骨髓的志愿者没有苯暴露和其他收集血液病学的疾病。从不同的捐赠者实验重复三次。人类msc孤立如前所述[23与修改)。单核细胞分离通过密度梯度离心法1.073/毫升Ficoll-Paque溢价(通用电气医疗集团超AB,乌普萨拉,瑞典),享年400岁30分钟。单核细胞在培养瓶被播种1×10⁶/毫升(5毫升)的总量在低葡萄糖(1.0/ l)杜尔贝科修改鹰的介质(英杰公司公司,卡尔斯巴德、钙、美国)补充10%胎牛血清,公司保持在5%₂在37°C和95%湿度收集附着hBM-MSCs可能细胞。文化的10 d后,贴壁细胞形成同质殖民地,并分离出0.05%胰蛋白酶和亚文化的分流比1:3。媒介改变了每2 - 3 d和hBM-MSCs从通道3被用于以下研究。

2.2。通过流式细胞术分析hBM-MSCs的识别

如先前所述的研究[24),后14 d孵化,hBM-MSCs可能细胞使胰蛋白酶化成单细胞悬液,计算,用PBS。hBM-MSCs识别,藻红蛋白- (PE)共轭鼠单克隆抗体对人类CD29, CD34, CD44,和CD45 (BD生物科学,富兰克林湖,新泽西,美国)被添加到细胞悬液浓度推荐的制造商,和细胞分析FACSCalibur流式细胞术(BD生物科学)。使用CellQuest Pro™v5.2数据收集。软件(BD生物科学)。

2.3。MTT试验

1,4-BQ(99.5%) 106-51-4号中科院获得Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。细胞被播种在96 -孔板与1×10的浓度⁴(100 /毫升μl在每个)和治疗1、5、10、25、50、100、200年、500年和1000年μ1米,4-BQ 24 h。三个独立重复实验。细胞毒性的影响1、4-BQ hBM-MSCs测定使用3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyl溴化四唑(MTT)试验后,先前的研究25,26]。

2.4。样品制备对二维凝胶电泳(2 de)

根据麻省理工的结果,我们选择10、25、50μ1米,4-BQ 2 de分析。不同剂量处理后的4-BQ 24 h, hBM-MSCs用PBS,悬浮在2 de裂解缓冲(7 M尿素,2 M硫脲,4% (wt /卷)皮套裤,0.5% (v / v) IPG缓冲区,50 mM二硫苏糖醇(德勤)和1% (v / v)蛋白酶抑制剂混合(通用电气医疗集团,乌普萨拉,瑞典))。酝酿在冰上30分钟后,样本离心机在13000 rpm在4°C 1 h,和总可溶性蛋白用于后续2 de。蛋白质定量分析与Bio-Rad执行分析工具(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。所有样品都是储存在−直到进一步2 de分析80°C。

2.5。2 de分析和凝固态胰蛋白酶的消化

蛋白质样品(350μ每g)溶解在补液缓冲区(7 M尿素,2 M硫脲,2% (M / v)皮套裤,50 mM德勤,和0.5% (v / v) IPG缓冲区)和水化24厘米IPG地带(pH值5 - 8,Bio-Rad) 12 h 20°C紧随其后1 d等电点聚焦(IEF) 50的最大电流μA / IPG地带。1 d等电点聚焦(IEF)是在250 V 0.5 h, 1 h 500 V, 4000 V 2 h, 2 h 6000 V, 8000 V 2 h, 2 h 10000 V, 10000 V 8 h。的地带是平衡两次:第一次15分钟在20毫升平衡解决方案(6 M尿素,2% SDS (M / v), 0.375米Tris-HCl (pH值8.8),20% (v / v)甘油和2% (M / v)德勤);第二平衡解决方案二(m / v)碘乙酰胺(2.5%而不是2% (m / v)德勤)。二维电泳,平衡IPG SDS-polyacrylamide条被放置在10%与0.5%琼脂糖凝胶(SDS - page)和密封SDS运行缓冲。30分钟进行了sds - page的恒流20 mA /凝胶,然后30 mA /凝胶直到溴酚蓝染料方面达到了降低凝胶的边缘。后电泳,凝胶固定和染色用蛋白银染色设备(通用电气医疗集团,乌普萨拉,瑞典)根据指令。收集的图像silver-stained 2 de凝胶通过映象III(通用电气医疗集团)和分析利用Imagemaster软件(版本6.0,通用电气医疗集团)。所有相同的蛋白质斑点检测设置的亮度,对比,和颜色尽量减少偏见。每个成员在凝胶的原始数量除以总数量的有效点凝胶。 After data analysis, protein spots that were differentially expressed (>1.5-fold,)切除凝胶的凝固态消化如前所述[27]。

2.6。液相色谱加上串联质谱(质/女士)

消化蛋白质的分离和鉴定由Finnigan线性陷阱四极质谱仪(LTQ)(热Finnigan圣何塞,CA)耦合与高效液相色谱法(HPLC)系统(热Finnigan)根据Stastna et al。28]。溶剂为0.1% (v / v)甲酸,和溶剂B v / v 0.1%甲酸乙腈80% v / v。梯度95%溶剂举行了15分钟,从5%提高线性溶剂溶剂100% B在50分钟。缩氨酸的流量从C18微细管列筛选了150μl / min。蛋白质识别使用MS / MS原始数据进行BioworksBrowser rev.3.1软件(热电子,圣何塞)基于人类Uniprot数据库。

2.7。免疫印迹分析

治疗后,总蛋白质的提取hBM-MSCs SDS样品缓冲和煮5 - 10分钟在95 - 100°C。根据先前的研究[执行免疫印迹29日,30.]。蛋白质和抗体检测包括多克隆反波形蛋白、单克隆反HSP27(细胞信号技术,Inc .丹弗斯,妈,美国),多克隆人类GAPDH(圣克鲁斯生物技术、钙、美国),和量化使用FluorChem FC2系统(αInnotech Corp .)、圣克拉拉、钙、美国)。

2.8。免疫荧光共聚焦显微镜

先前的研究中描述(29日,30.),HSP27抗体(1:100)和波形蛋白(1:50)应用于1,4-BQ-treated hBM-MSCs,其次是immunofluorescent染色Alexa萤石633(红色)山羊anti-mouse免疫球蛋白或Alexa萤石514(绿色)山羊anti-mouse免疫球蛋白(表达载体corp .)。Hoechst33342 (Sigma-Aldrich)是用于核复染色。细胞形态学和细胞内定位的蛋白质分析共焦显微镜(蔡司LSM710,耶拿,德国)和导出为TIFF文件使用蔡司ConfoCor 3系统。

2.9。实时定量PCR(存在)

治疗后,总RNA提取使用超纯RNA从hBM-MSCs工具包(Cwbiotech,北京)。使用RevertAid进行逆转录合成第一链cDNA工具包(格伦Burmie Fermentas,医学博士,美国)。评估HSP27的mRNA水平和波形蛋白,存在LightCycler 2.0执行实时PCR系统(罗氏诊断GmbH,曼海姆,德国)使用SYBR预混料交货Taq™完美实时工具包(豆类,京都,日本)。GAPDH是作为内部控制。②相对量化值的计算使用比较循环阈值方法()。三个独立的实验中移动计算的平均和标准偏差()。

2.10。统计分析

每个实验进行至少三次。数据平均值±标准偏差。使用SPSS 18.0统计分析软件SPSS Inc .),上海,中国。学生的以及用于MTT和2 de分析和单向方差分析是用于免疫印迹和定量实时PCR分析。显著差异进一步分析Dunnett多重比较的方法。所有概率值2-tailed,被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。hBM-MSCs识别

根据前面的研究(31日],spindle-like-hBM-MSCs严格坚持烧瓶底部后三维文化。不依从细胞可以通过改变介质中删除。更大的克隆在第7天出现。丰富的纤维母细胞细胞质和大型核开始快速增长。细胞变得逐渐汇合的,有一个螺旋whorl-like前景(图1(一))。流式细胞术分析细胞表面抗原的发现CD29、CD44的表达间充质细胞的标记,而不是CD34、CD45的造血干细胞标记(数字2(一个)和2 (b))。CD29、CD44的积极的发病率是96.2%和96.1%,和CD34、CD45的负面发生率为95.3%和95.5%,分别为(图2 (c))。

3.2。1、4-BQ hBM-MSCs细胞生存能力

细胞生存能力研究中使用MTT测定hBM-MSCs处理1、5、10、25、50、100、200、500和1000μ米1,4-BQ 24 h。形态的变化在100年hBM-MSCs接受观察μ米1,4-BQ 24 h,许多细胞分离和浮动介质被发现(图1 (b))。此外,膜起泡和胞质收缩观察;细胞分散,单层没有形成(图1 (b))。如图1 (c)1 4-BQ显著抑制细胞生存能力hBM-MSCs剂量依赖性的方式()。细胞生存能力低于10%的浓度超过200μ1米,4-BQ相比对照组。

3.3。hBM-MSCs 2 de的状况

确定的影响1、4-BQ hBM-MSCs蛋白质组,蛋白质概要文件检查和1相比,4-BQ-treated和未经处理的hBM-MSCs。背景减法和匹配侦探景点后,每组蛋白斑点的数量是如下:1006±11 10μ米1,4-BQ治疗组和1017±16在相应的对照组;1207年25±5μ米1,4-BQ治疗组和1190±13在相应的对照组;在50 1053±26μ米1,4-BQ治疗组和1042±40在相应的对照组。选择了差异表达点强度至少1.5倍大于相应的控制凝胶()。如图3(一个)发现,32个蛋白质斑点之间的差异表达,4-BQ-treated组和对照组。

3.4。差异表达蛋白质的识别和分类

图像对比后的治疗和控制组织,42点显示一个明确的空间分离从周围的景点,足够的强度,和一致的位置形状和大小选择质/ MS鉴定和32人成功了。16个蛋白是调节1,4-BQ治疗组和其他人表达下调。

确定蛋白质可以分为四类根据定位,也就是说,细胞质、核、膜结合,或分泌蛋白(图3 (b))。根据他们的功能,32蛋白质可以分为以下组:新陈代谢(25.00%)、细胞应激反应(15.63%),细胞骨架(12.50%)、转录调控(12.50%)、膜贩运(6.25%)、信号转导(6.25%),和辅助功能(21.87%)(图3 (c))。所有识别蛋白质的信息,包括蛋白质名称、UniPropt ID、功能、理论MW /π,现货成交比列在表中1。

现货1915,热休克蛋白27 (HSP27),被确认为热休克蛋白beta 1。HSP27的表达水平显示1.6倍下降1,4-BQ细胞治疗。如图4,肽链碎片的HSP27被质谱鉴定。波形蛋白也被确定在1553年发现,在1增加2.0倍,4-BQ-treated hBM-MSCs有八个匹配肽和19.3%的序列覆盖率根据质/ MS分析。

3.5。验证差异表达的蛋白质

进一步证实2 de分析的结果,波形蛋白的蛋白质含量和HSP27 hBM-MSCs处理0,10、25、50μ1米,4-BQ测定免疫印迹。结果表明,50μ米1,4-BQ显著降低HSP27的表达和波形蛋白的表达增加hBM-MSCs相比对照组()(数据5(一个)和5 (b))。然而,10到25μ米1,4-BQ并不影响在hBM-MSCs HSP27和波形蛋白的水平。

检查是否改变蛋白质HSP27的表达和波形蛋白1,4-BQ-treated hBM-MSCs在转录水平的变化相关,我们存在进行分析。结果表明,50μ米1,4-BQ显著降低HSP27的mRNA水平和增加的mRNA水平与对照组相比hBM-MSCs波形蛋白()(数据6(一)和6 (b))。没有发现差异10至25μ米1,4-BQ-treated组和对照组()。此外,RAP1GDS1的mRNA水平也显著增加hBM-MSCs处理不同浓度的1,4-BQ剂量依赖性的方式(图6 (c))()。

以确定其亚细胞定位、HSP27和波形蛋白在使用immunofluorescent hBM-MSCs染色观察。结果表明,50μ米1,4-BQ导致极低的HSP27的表达(图7)和波形蛋白的高表达(图8在hBM-MSCs)。HSP27和波形蛋白表达hBM-MSCs细胞质中被发现。

4所示。讨论

可用数据表明,苯引起白血病和其他hematotoxicities [32,33]。最近,hematotoxicity发现工人暴露在低水平的苯(3,34]。1 4-BQ苯的主要代谢产物之一,已与许多影响观察在体内和体外都包括的DNA加合物的形成,在小鼠骨髓细胞DNA甲基化,抑制DNA复制(11,35,36]。找到有效的目标蛋白质1,4-BQ更好地理解关键重要benzene-induced毒性和hematotoxicity的机制。

在我们之前的研究中,氢醌,苯代谢物,诱导显著差异蛋白质表达谱在人类肝细胞(37),和四个蛋白被鉴定,包括ρGDP离解抑制剂GDIα,6-phosphogluconolactonase, erbB3绑定蛋白EBP1和核纤层蛋白A / C。苯氧化苯在肝脏代谢,苯酚,几个羟化化合物包括对苯二酚。对苯二酚然后运送到骨髓和髓过氧物酶代谢的高毒性和诱变1,4-BQ。苯的毒性作用是影响骨髓微环境的复杂的细胞间的相互作用。hBM-MSCs骨髓中骨髓微环境所需的维护。在目前的研究中,细胞的可行性hBM-MSCs处理25μM 1, 4-BQ 24小时没有显示差异与对照组相比,这表明hBM-MSC细胞可能不敏感,4-BQ。然而,在小鼠骨髓细胞治疗1,4-BQ浓度的0.1,1,10μ米24 h, p15和p16 mRNA水平相比明显调节控制(38]。治疗37μ米1,4-BQ 24 h也导致威尼斯平底渔船II的显著增加α在k - 562细胞启动子活动(39]。1,4-BQ (1 ~ 10μM 4 h) Rad51 mRNA水平的增加,xpc,和mdm-2男性造血干细胞(hsc) [11]。在另一项研究中,治疗5 10 25或50μ米1,4-BQ 48 h并不影响细胞的生存能力但显著诱导全球人类正常肝DNA hypomethylation L02细胞(40]。尽管疲软的影响细胞的生存能力,1 4-BQ仍然显示某些负面影响包括基因毒性,在分子水平上需要更多的证据来改善我们的理解。因此,在这项研究中,我们使用1,4-BQ浓度的10、25日和50μM调查改变了蛋白质的hBM-MSCs使用2 de和质/ MS-based方法。

2 de和质/ MS-based方法使得没有假设已知或未知的分子,允许过程独立于任何预设的假设。在这项研究中,我们发现有数量的蛋白质之间的微分表达式1,4-BQ处理和未经处理的hBM-MSCs。正如上面提到的,32差异表达蛋白中确定本研究参与各种功能方面包括代谢、细胞应激反应、细胞骨架、转录调节、膜贩运和信号转导(图3 (c))。这些发现表明,基因毒性机制障碍引起的1,4-BQ可能与多因素有关。

热休克蛋白(休克)是一个家庭的蛋白质引起的不同的侮辱和可以影响很多生理活动。应力条件下诱导热休克细胞可以存活。这些蛋白质作为分子陪伴在错误折叠蛋白的重折叠或消除,如果他们成为不可逆转的损坏。近年来,蛋白质组学的研究已经确定了几个不同的热休克在不同肿瘤类型作为癌症治疗的潜在临床生物标志物或分子目标(41,42]。在这项研究中,几个热休克蛋白,热休克等27个kDa蛋白质(HSP27),热休克蛋白60 (HSP60), 70 kDa热休克蛋白(HSP70蛋白5),热休克蛋白质同源71 kDa (HSP71)和热休克蛋白90 kDaβ1(一半成员β1)。HSP27 cytoprotective伴侣是phosphor-activated细胞压力,防止聚合和/或调节某些客户的活动和降解蛋白质。HSP27似乎发挥着至关重要的作用在调节细胞死亡和细胞存活率之间的平衡,其超表达与细胞凋亡的抑制,增加了cytoprotection,抵抗治疗(43]。HSP27在当下研究的差别,对这些建议HSP27可能不会发挥cytoprotective作用在反应1中,4-BQ。相反,其表达的改变可能是一个结果的反应途径的规定需要进一步探索。

在这项研究中差异表达的蛋白质包括波形蛋白等细胞骨架蛋白、beta-actin, alpha-actin-1。这些细胞骨架蛋白影响细胞的形态、强度、运动性和传染性。波形蛋白中间丝家族中的一员,而微管和肌动蛋白微丝,组成细胞的细胞骨架44]。通常表达间充质细胞,与肿瘤的侵袭性和迁移在各种肿瘤类型(45,46]。我们的观察波形蛋白的高表达1,4-BQ-treated hBM-MSCs表明,波形蛋白蛋白表达可能是一个有效的生物标志物细胞反应,4-BQ。免疫印迹分析,RT-qPCR immunofluorescent分析进一步证实了这些发现。需要进一步调查了解波形蛋白的功能影响hBM-MSCs及其与其他蛋白质的关系涉及benzene-induced白血病生成。

在我们的研究中,有几个代谢相关蛋白质显著调节或表达下调。基于我们的研究结果,载脂蛋白L2的表达,beta-enolase,公认的无特征蛋白质DKFZp686N1815, 26 s蛋白酶体non-ATPase调节亚基8 (PSMD8)和transaldolase(点4343、2665、1983、4493和4336年)诱导了1.5倍,而26 s蛋白酶体的强度non-ATPase调节亚基1和肌酸激酶斜(M-CK)和对照组相比,下降了1.5倍。1,4-BQ改变代谢相关蛋白的表达水平,这证实了考试RAP1GDS1 mRNA表达水平的。总之,这项工作揭示了蛋白质组的hBM-MSCs处理1,4-BQ使用2 de和质/ MS方法。差异表达的蛋白质可能是有用的治疗靶点造血障碍引起苯。还需要进一步的研究提供更多的证据,这些蛋白质是如何参与造血障碍引起苯及其代谢物。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是支持部分由中国国家自然科学基金(81202244和81202244号);浙江省自然科学基金(Y207394号和LQ12H26001);浙江省科学技术厅(2008 f1027和2013 f20004号);浙江省卫生和计划生育委员会(2015 rca007)。肖云是由浙江省项目高层创新卫生人才的培养。

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