调节血管生成函数通过Calcium-Dependent组信号通路

文摘

组血管因素对于血管组装和正确的组织和成熟。本研究描述了一个小说calcium-dependent机械激活通过Angiopoietin-1/2-Tie受体系统在HUVECs单层。两种细胞因子被发现引起细胞内钙动员。针对细胞内钙^{2 +}信号,得罪IP₃与2-APB或cADPR 8 br-cadpr,调节在体外血管生成反应组在一个特定的方式。2-APB和8 br-cadpr受损的一种蛋白激酶的磷酸化和FAK Ang-1和Ang-2。另一方面,磷酸化ERK1/2和p38以及细胞增殖,并不是影响抑制剂。ECs迁移的能力和刺激后,评估“划痕试验”,降低了2-APB或8 br-cadpr Ang-2后刺激和略受2-APB与Ang-1细胞刺激。这些结果确定一个小说calcium-dependent机械参与复杂的相互作用调节血管生成过程显示IP₃- - - cADPR-induced Ca^{2 +}发布专门调节不同Angs-mediated血管生成步骤。

1。介绍

血管生成是一个复杂的重构过程的特点是既存国家的新血管的萌芽,主要发生在胚胎发育和病理过程,如癌症。在这个过程的早期阶段,内皮细胞(ECs)等生长因子刺激形成新的毛细血管的血管内皮生长因子(VEGF)和纤维母细胞生长因子(FGF)。组(ang)扮演的基本角色在随后的成熟一步,微血管中获得一层壁画细胞,和平滑肌细胞周围的周的关键功能的脉管系统的开发和维护1,2]。实验证据识别和和他们的领带感受器肿瘤导致血管生成和转移的重要监管机构(3,4]。迄今为止,主要工作领域的血管生成控制集中在VEGF-VEGF受体系统[5,6]。然而,尽管部分成功,抗vegf治疗,造成各种各样的机制,仍然是一个主要障碍(7- - - - - -9]。寻找小说主要下游效应器共同“信号中心”可能因此ang和其他已知的生长因子之间的潜在意义在肿瘤血管生成的角度控制。

领带受体及其检验(Ang)配体被认定为第二血管组织酪氨酸激酶受体系统。Angs-Tie在胚胎船舶装配系统是至关重要的,正确的组织和成熟的新血管形成和功能作为一个成年人的血管内稳态的关键调节器在血管级联的后期。因此,而VEGF信号促进血管生成的初始的事件,如ECs发芽和增殖,Ang-Tie信号似乎促进ECs生存和血管组装、稳定和成熟10]。最合适的和他们(Ang-1)和Angiopoietin-2 (Ang-2),分泌的糖蛋白的二聚的结构和分子量约75 kDa [11氨基酸序列同源性]显示约60%。Ang-1表示由平滑肌细胞和其他血管周的细胞旁分泌的方式和行为作为内皮Tie-2受体的激动剂,而Ang-2被认为是它的对手虽然也报道了上下文相关的充当Tie-2受体激动剂诱导受体磷酸化(12- - - - - -14]。织的分子基础与敌对Ang-2尚未解开的函数。细胞类型的具体影响,内皮细胞融合的程度,Ang-2刺激的持续时间,浓度依赖的影响,和coreceptors的存在如Tie-1都涉及控制格斗和敌对Ang-2的函数(15- - - - - -18]。Ang-1诱发酪氨酸磷酸化的ECs Tie-2和激活下游信号通路如增殖蛋白激酶(MAPK)通路。在成人组织,Ang-1不诱导内皮细胞趋化作用或扩散但产生一个双重角色:它刺激血管新生血管重建的网站导致毛细芽的形成,虽然刺激prosurvival通路,促进血管静止在成熟的血管,防止细胞凋亡和炎症通过PI3K-AKT和MAPK / ERK信号通路的激活(19- - - - - -21]。Ang-2几乎完全表达了ECs,它存储在Weibel-Palade身体(由22,23]。内皮细胞因子激活后,Ang-2迅速释放,以自分泌的方式作用于Tie-2受体结合为或多聚体。在生理条件下,在成人组织Ang-2表达区域的血管重塑,在视网膜血管化或在血管形成/卵巢黄体的回归。Ang-2表达式也是调节在病理条件下,例如,在内皮细胞的肿瘤(24- - - - - -26]。有趣的是,实验证据表明Tie-2激活下游信号受体亚细胞定位的影响,不同的支流和稀疏ECs (1,27]。在这些研究中,Ang-1产生更强的一种蛋白激酶信号融合性的细胞,其中Tie-2本地化细胞/细胞连接,和更强的ERK活化细胞稀疏时,Tie-2本地化细胞/矩阵结,表明在Tie-2 Ang-1激活的影响可能取决于细胞/细胞或细胞矩阵的本质联系。鲜为人知的角色是钙(Ca^{2 +}在血管生成过程的监管。Ca^{2 +}是一个关键的交叉点为许多不同的分子信号通路,促进和调节血管生成。特定的Ca^{2 +}签名依赖的时空变化(28),主要是基于三个第二信使,即肌醇联结(IP₃)和环腺diphosphoribose (cADPR)动员Ca^{2 +}从内质网(ER)商店,烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAADP),触发Ca^{2 +}释放酸性细胞器(29日,30.]。我们之前已经证明组胺H1受体调节NAADP-dependent Ca^{2 +}信号在ECs (31日),最近发现,在HUVECs(人类脐静脉内皮细胞)VEGF增加通过动员Ca^{2 +}从内部商店。后者研究证明的直接作用NAADP VEGF-induced Ca^{2 +}动员酸性细胞器及其重要参与血管生成过程的控制(32]。据我们所知,Ca的角色^{2 +}信号调节Ang-1 / Ang-2-induced血管新生尚未研究。在目前的工作中,我们确定一个新的Angs-Tie信号通路,受体激活导致的IP₃- - - cADPR-dependent Ca^{2 +}发布和显示这些Ca^{2 +}动员第二信使专门控制不同Angs-mediated血管生成步骤。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

获得人类脐静脉内皮细胞(通过传代形成细胞从Lonza销售有限公司在EGM-2培养内皮细胞生长Medium-2(内皮基底介质EBM-2 + EGM-2子弹装备,Lonza), + 100毫米青霉素和链霉素(σ)。细胞被维持在37°C腐殖化的5%(卷/期)孵化器和增长达到融合。在通道1到6层使用。

2.2。钙成像

细胞被EGM-2包含3.5中孵化μM Fura-2-AM(表达载体)1 h在37°C,然后冲洗汉克斯平衡盐溶液(hbsσ)或Krebs-Henseleit-HEPES (KHH)缓冲区(140毫米Na⁺,5.3毫米K⁺,132.4毫米Cl⁻,0.98毫米,1.25毫米^{2 +}0.81毫米毫克^{2 +}、5.5毫米葡萄糖和20毫米玫瑰)。盘子被置于一个文化室保持在37°C控制温度在舞台上的反向microfluorimeter(尼康TE2000E)连接到一个冷却CCD相机(512 b级联,普林斯顿仪器)。样本照亮交替使用随机存取单色仪在340和380海里(光子技术国际)和排放检测使用510 nm排放过滤器。图像获得的图像(1 /秒的比率)使用MetaFluor软件(通用成像公司)。校准信号得到的每个实验通过最大限度地增加细胞内钙^{2 +}与5端依赖Fura-2-AM荧光μM ionomycin (ionomycin钙盐链霉菌属conglobatusσ),其次是记录最少的荧光在Ca^{2 +}无介质。根据先前描述的计算公式(33]。

2.3。免疫印迹

细胞第一次被饿死在EBM-2 4 h,然后用BAPTA-AM孵化(σ,20μ米),2-APB(σ75μ米)或8 br-cadpr (Sigma 30μ米)刺激了20分钟前30分钟与100 ng / mL而或200 ng / mL Angiopoietin-2 (PeproTech)。细胞被洗冷PBS之前添加裂解缓冲10 x(细胞信号),π,PMSF(σ1毫米)。在确定蛋白质浓度由BCA试剂盒(热科学),25岁μg-35μ每个样本的g蛋白在8% - -10% sds - page加载。蛋白质随后被涂抹在硝化纤维膜和膜处理与屏蔽解决方案ttb + 5%牛奶(ECL '阻滞剂,通用电气医疗集团)。以下主要使用抗体:Phospho-p42/44 MAPK (T202 / Y204: E10、细胞信号、1:1000),Phospho-AKT (ser - 473细胞信号,1:1000),Phospho-FAK (Tyr925、细胞信号、1:1000),Phospho-p38 MAP激酶(Thr180 / Tyr182、细胞信号、1:1000),一种蛋白激酶(细胞信号,1:1000),ERK - 2(圣克鲁斯,1:1000),p38(圣克鲁斯,1:1000),和FAK(细胞信号,1:1000)。所有的抗体在ttb 5% BSA稀释。在ttb三洗后,膜与二次孵化HRP-conjugated稳定山羊anti-mouse(皮尔斯,1:10000)和稳定peroxidase-conjugated多克隆山羊anti-rabbit (Bio-Rad, 1: 10000) 1 h rt,确保=加载与单克隆HRP-conjugated reprobed反膜β肌动蛋白(σ)。免疫印迹乐队的强度是由图像量化J软件从至少三个独立的实验中,归一化的蛋白质总量表示和β肌动蛋白含量,并与控制(车辆)设置为1。

2.4。划痕试验

汇合的ECs镀单层膜在35毫米菜刮沿着一条直线与一个p10吸管提示创建一个窄隙(划痕)。抓创建类似的大小在不同的实验条件以减少任何可能变化的差异造成的宽度。碎片被移除之前用PBS孵化的新鲜培养基含有和抑制剂的存在与否。记录细胞迁移、图像的伤口是在时间为零和24小时后再次倒置显微镜(尼康Eclipse TS100)配备了数码相机(尼康Ds Fi2 Nis元素F 4.00.00软件)。五个随机微观领域以及每个伤口拍照。

2.5。在体外基底膜基质试验

Capillary-like内皮管形成评估血管生成在体外血管生成试验。130年μL基底膜基质基底膜基质生长因子减少(BD生物科学)被添加到每个的预冷24-well组织文化板块。吸管技巧和基底膜基质溶液保持冷过程中避免凝固。盘子被孵化1 h在37°C允许矩阵解决固化。4×10⁴细胞在500年最后一卷μL EBM-2被播种到表面的每个包含聚合矩阵。细胞用药理抑制剂预处理指示或与车辆本身和刺激特定的受体激动剂100 ng / mL Ang-1或200 ng / mL Ang-2 4 - 5小时37°C。管形成在倒置显微镜下检查(尼康Eclipse TS100)在20 x放大和图像获得的数码相机(尼康Ds Fi2 Nis元素F 4.00.00软件)。在五个随机形成的封闭多边形每口井的微观领域统计平均和价值观。

2.6。统计分析

数据提出了均值±s.e.m.造成至少三个独立的实验。学生的以及用于统计对比方法适用的地方。考虑,,。在数据统计分析的数据1(一)和1 (b)都使用了单向方差分析测试。考虑值< 0.0001,值< 0.05。乐队在西方的屁股被光密度扫描量化电影三个或更多独立的实验。

3所示。结果与讨论

3.1。从细胞内钙商店Ang-1和Ang-2动员钙

在目前的研究中,Ca的参与^{2 +}和信号的测试和分析调查ECs如果Ca^{2 +}和参与反应。我们进行了Ca^{2 +}成像实验HUVECs单层使用microfluorimetric分析。首先,我们进行剂量反应实验刺激Fura-2-AM-loaded HUVECs盎在不同浓度(5 ng / mL - 400 ng / mL)使用哈佛商学院缓冲,使Ca^{2 +}从细胞外环境。最大的细胞内钙增加^{2 +}浓度被发现在100 ng / mL的浓度Ang-1和200 ng / mL Ang-2(数字1(一)和1 (b))。这两个浓度因此用于所有后续的实验。为了研究细胞外钙的参与^{2 +}涌入,我们执行^{2 +}成像实验Ang-1 / Ang-2-stimulated细胞使用Krebs-Henseleit-HEPES缓冲区(KHH)和Ca^{2 +}包含细胞外钙无缓冲^{2 +}螯合剂EGTA(图1(c1)和1(d1))。代表配置文件数据所示1(c2)和1(d2)。的响应和被发现buffer-independent,指示的参与细胞内的商店。综上所述,这些数据显示,首次和刺激触发细胞内Ca^{2 +}信号。实质上等于值观察到细胞外钙的存在与否^{2 +}促使我们评估不同的参与胞内细胞内钙Angs-induced隔间^{2 +}动员。我们采取了药理学的方法使用bafilomycin A1,抑制pH-dependent Ca^{2 +}吸收到酸性商店的抑制vacuolar-type H⁺腺苷三磷酸酶泵,和thapsigargin抑制ER SERCA的泵(29日]。Angs-induced Ca^{2 +}释放被thapsigargin明显受损(数字2(一个)和2 (c)),但不是由bafilomycin A1(数字2 (b)和2 (d)),证明Ca^{2 +}商店不同酸性隔间参与这个过程。

3.2。cADPR和知识产权₃参与增加Ang-1和Ang-2

许多细胞的刺激作用于受体结合磷脂酶C (PLC)水解磷脂酰肌醇4,5-bisphosphate (PIP)₂)生产IP₃反过来被受体位于ER导致钙的释放^{2 +}。Ca的时空上的组织模式^{2 +}版本是一个非常通用的信号系统控制大量的过程在许多不同的细胞类型34]。另一个Ca^{2 +}动员信使,与IP无关₃,已被确定为循环ADP-ribose (cADPR)激活阿诺定受体(RyRs)石棺/ ER [28]。探讨这两种不同的参与第二信使Ang-1和细胞内钙Ang-2-dependent负责^{2 +}动员从ER商店,药理方法采用使用抑制剂各级专门针对他们中的任何一个。IP的参与₃研究了通过Ca^{2 +}在细胞成像实验进行20分钟的2μM U73122, PLC的对手,或U73343,其非功能模拟,在细胞进行预处理与75年30分钟μM 2-APB, IP的选择性拮抗剂₃受体,刺激10μM ATP积极控制或者Ang-1 Ang-2。预处理与抑制剂明显受损Ang-1 Ang-2-induced Ca^{2 +}(数据3(a3),3(a5),3(b3),3(b5)),正如所料,阻塞ATP-evoked Ca^{2 +}动员,依赖的IP₃(数据3(a1)和3(b1))。代表跟踪数据所示3(a2),3(a4),3(a6),3(b2),3(b4)和3(b6)。

识别可能的参与cADPR, Ca^{2 +}细胞成像实验进行预处理与30 30分钟μ米8 br-cadpr cADPR细胞渗透的拮抗剂,结合ER RyRs然后用Ang-1刺激或Ang-2。如图4、细胞内钙^{2 +}释放与盎是显著降低在刺激后细胞用这种抑制剂(数据预处理4(a1)和4(a3))。代表跟踪数据所示4(a2)和4(a4)。这些观察表明,ang动员Ca^{2 +}通过IP从ER商店₃和cADPR信号的参与途径是Ang-1/2同种型具体。特别是thapsigargin意想不到的部分不敏感,U73122, 2-APB,和8 br-cadpr,与Ang-2刺激,观察表明,该受体激动剂可能依赖更多的Ca^{2 +}存储隔间/立地[35]。

3.3。Ang-1——Ang-2-Dependent MAPK通路是由不同的IP₃和cADPR

Ang-1 / Ang-2信号通过Tie-2受体已知控制特定的血管生成过程中必不可少的步骤,这一过程涉及细胞内的传导通路的复杂网络。之间的相互作用与Tie-2 Ang-1成人血管系统对ECs的生存至关重要,迁移和血管修复。众所周知,在ECs Ang-1诱发一种蛋白激酶的磷酸化36],ERK1/2 [27],p38增殖蛋白激酶(MAPKs) [37]。Alitalo集团(38]表明Ang-1 Tie-2形式不同的信号复合物的存在与否取决于inter-ECs粘附与占主导地位的一种蛋白激酶的磷酸化和弱激活ERK在HUVECs单层。的细胞内磷脂酰肌醇3-kinase PI3K / AKT通路的关键调节器几个细胞过程,促进细胞存活在应对各种压力,如营养不足。在众多信号通路,应对压力、MAPK的家人也基本维持细胞生存能力。几项研究表明,Ang-1促进细胞存活激活MAPK和PI3K / AKT通路(16,19]。在血管生成的早期阶段,新生血管性豆芽是由主要由ECs。当他们成熟,微血管获得涂层的壁画细胞,功能脉管系统的开发和维护的关键。在大鼠主动脉模型(39]p38 MAPK转导信号已被证明血管重建和成熟的关键。目的是识别Ca的参与^{2 +}在Angs-dependent信号事件,我们评估ERK1/2已知蛋白的激活目标,一种蛋白激酶,p38。HUVECs与Ca进行预处理或不^{2 +}螯合剂浓度的BAPTA-AM 20μm .如图5(一个)和数字S1 f(在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2015/965271),和一种蛋白激酶的磷酸化,激活ERK1/2, p38和联合治疗BAPTA-AM发现抑制Ang-1和Ang-2-dependent一种蛋白激酶磷酸化,磷酸化的同时ERK1/2没有影响。细胞内钙的缺乏对p38磷酸化产生了相反的效果。为了进一步评估的具体贡献不同的Ca^{2 +}动员第二信使在一种蛋白激酶磷酸化,我们进行了免疫印迹分析细胞的两个特定抑制剂,要么2-APB (IP₃/ IP₃R)或8 br-cadpr (cADPR / RyR)前和刺激。如数据所示5 (b)和5 (c)和数字S1 G-L,一种蛋白激酶的磷酸化是不同的监管两个盎。预处理与2-APB特别减少了刺激产生的一种蛋白激酶磷酸化程度Ang-1认为知识产权的要求₃端依赖Ca^{2 +}(数据5(b1)和5(c1)),而cADPR / RyR信号明显没有参与此响应Ang-1或者Ang-2(数字5(b2)和5(c2))。

3.4。不同的Ca^{2 +}签名调控细胞迁移反应Ang-1 Ang-2

在新血管形成和血管生成ECs降解基底膜和迁移到血管周围间质血管生成因子的梯度。细胞迁移和入侵细胞外基质下基底膜是必不可少的步骤包括肌动蛋白细胞骨架重组。成员粘着斑激酶FAK nonreceptor酪氨酸激酶,起着关键的作用在调节肌动蛋白细胞骨架重组参与迁移的动态变化和附着力。Ang-1诱发毛细管发芽活动通过没有方向的定向迁移由Tie-2但不是Tie-1受体和诱发酪氨酸磷酸化的FAK依赖PI3K活动(40- - - - - -43]。识别可能的参与p-FAK上升Angs-dependent激活,我们进行免疫印迹分析细胞治疗与Ca^{2 +}螯合剂浓度的BAPTA-AM 20μ刺激与Ang-1或Ang-2之前。我们观察到,ang激活p-FAK通过Ca^{2 +}端依赖机制(图6(一)数据S2, a - b)。评估的贡献不同的第二信使,细胞使用两个特定抑制剂,2-APB和8个br-cadpr。引起的FAK磷酸化依赖知识产权和被发现₃信号在细胞刺激Ang-1(数字6(b1)和6由第二信使(b2))和强烈的刺激与Ang-2(数字6(c1)和6(c2),数字S2氟)。进一步测试的具体参与IP₃和cADPR Ang-1 Ang-2-induced细胞活性,我们执行一个“划痕试验”,即融合性的ECs单层手动受伤沿着窄线和随后的细胞迁移到改革单层可以研究。这种方法的优点是,细胞迁移可以随着时间的推移,监控从而允许我们估计迁徙的速度响应。量化是任意的,根据伤口的大小和细胞生长。为了区分迁移和扩散,流仪评估细胞增殖与propidium碘(PI)进行(图S3)。这个试验表明,在伤口愈合的培养条件试验,ECs下不扩散和刺激。从定性的角度,伤口愈合实验清楚地表明,ECs的能力将在24小时Ang-1 2-APB治疗刺激被修改,在Ang-2刺激下细胞迁移是减少治疗8 br-cadpr或2-APB(数字6 (d)和6 (e))。

3.5。Capillary-Like网络形成由Ang-1 IP₃端依赖

capillary-like结构的形成在活的有机体内被认为是代表后,血管生成和细胞分化阶段通常化验测试化合物与赞成或抗血管新生的效率功能。Angs-Tie轴是至关重要的血管生成,血管的正常发展,血管生成。当ECs镀上一层凝胶矩阵,它们是刺激迁移和分化成tubular-like结构模拟在活的有机体内过程(44]。人工基底膜,一个模仿细胞外基质的复杂化合物,包含细胞外和基底膜蛋白,被认为是最有效的矩阵小管形成。这通常是化验的调节器的血管生成和小管发展潜力是在4 - 24小时内观察到。Cord-like毛细管结构可视化为关闭多边形和结构的复杂程度可以定量评估计算关闭多边形或关联一个分数的数量根据ECs组合的数量。如数据所示7(一)和7(d),当镀在基底膜基质矩阵密度较高时,HUVECs形式cord-like毛细管结构在几小时内,这个过程由Ang-1和Ang-2增强。评估可能的钙信号参与血管生成的调控过程,细胞使用Ca^{2 +}螯合剂浓度的BAPTA-AM 20μm .的形成Angs-induced capillary-like结构受损,这种抑制剂Ang-1刺激样品但在细胞与Ang-2刺激影响,表明此响应Ang-2独立。进一步评估^{2 +}信号是可有可无的Ang-2诱导capillary-like形成,我们进行人工基底膜试验的第二信使抑制剂如图7(e)和7(f),没有发现明显的抑制管形成。此外,识别的第二信使Ang-1控制capillary-like结构的形成,细胞使用相同的第二信使抑制剂。代表图像表明,该反应Ang-1被2-APB预处理抑制(图7(b))。近似估计的效率,这个过程可以推断通过手机网络形成的程度,即细胞首先对齐形式线性段和随后互连形成封闭的多边形结构。如图7(c),形成封闭的多边形的数量与Ang-1细胞刺激2-APB的存在显著降低与样品相比刺激与Ang-1,仅表明IP的参与₃介导钙^{2 +}信号capillary-like形成在体外。

4所示。结论

在血管生成的复杂的过程,各种生长因子和细胞因子调节和发挥他们的功能通过自分泌/旁分泌信号。其中,Ang-1 Ang-2扮演重要的角色。Ang-1不刺激ECs增长,而是促进稳定的血管网络和分支形态发生在体外和在活的有机体内血管生成;相反,Ang-2,不知为何上下文相关的拮抗剂Ang-1,促进血管不稳定有利于分离(周围的周45]。在目前的研究中,我们发现了一个新奇的Ca^{2 +}端依赖机械激活和控制血管生成过程,包括移民和诱导capillary-like结构的能力在体外。我们的数据表明,Ca^{2 +}信号可能被设想为一个可能的“信号中心”和和其他血管生成因素。鉴于angiogenesis-blocking疗法的治疗潜力基于特定信号通路的抑制,这一概念可以打开新实验方法在这一领域。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

艾琳Pafumi和安东尼奥Filippini设计研究;艾琳Pafumi和Annarita Favia进行研究;艾琳•Pafumi Annarita Favia Guido Gambara,弗兰西斯卡Papacci,埃利奥•Ziparo,和安东尼奥Filippini分析数据;艾琳•Pafumi Annarita Favia Fioretta Palombi,安东尼奥Filippini写道。

确认

这项工作是支持由Ministero戴尔'Istruzione,戴尔'Universita e德拉Ricerca (MIUR)和阿Spaziale Italiana从基金会(安东尼奥Filippini)和罗马(埃利奥•Ziparo)。

补充材料

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