隔离和表征人类肺淋巴内皮细胞

文摘

描述的淋巴内皮细胞呼吸系统可能是至关重要的调查淋巴系统的作用在正常和病变的肺。我们描述一个简单而廉价的方法来收获,隔离,扩大淋巴内皮细胞从人类肺(HL-LECs)。55健康肺样本选自接受叶切除术的患者进行了研究。一个两步净化工具,基于顺排序与单克隆抗体CD31 Podoplanin,来选择一个纯HL-LECs人口。的纯度HL-LECs被形态学评估标准,免疫细胞化学、流式细胞术和功能分析。有趣的是,这些细胞保留在体外几个受体酪氨酸激酶(rtk)与细胞存活和增殖。HL-LECs代表临床相关研究淋巴细胞基质生物学、lymphoangiogenesis,交互与微生物制剂,伤口愈合,抗癌治疗。

1。介绍

淋巴系统由血管网络的封闭端,薄壁微血管和大血管排出淋巴,大多数器官的细胞外空间,通过胸导管静脉循环。淋巴毛细管壁是由一个连续的单细胞层重叠内皮细胞。由于不连续基底膜,这些血管高度渗透。淋巴系统还包括淋巴器官,如淋巴结、扁桃体,付款人的补丁,脾脏和胸腺。通常不存在淋巴管无血管的结构和在某些血管器官如脑、视网膜和骨髓。通过调节组织液内稳态、免疫细胞贩运和膳食脂肪吸收淋巴系统在炎症中起着关键作用,伤口愈合,肿瘤转移(1- - - - - -4]。最近,一个小鼠模型中提出了肺淋巴功能是必需的,在胎儿后期生活,防止组织水肿和确保出生时肺合规(5]。

在过去的15年里,一个重要的在某些方面的援助在体外和在活的有机体内血管生物学已经促使淋巴的识别标记,可以准确区分血管和淋巴管。因此,透明质酸受体Lyve-1 [6),prospero-related同源框基因转录因子Prox1 [7),膜糖蛋白podoplanin(生产)/ D2-40 [8),血管内皮生长因子受体(VEGFR -) 3酪氨酸激酶(9),及其配体VEGF-C VEGF-D [10)已记录在淋巴系统的规范和血统的承诺。

证据也被提供,具体的先天性或后天失调的淋巴系统可能会导致病理条件如淋巴管炎、淋巴水肿,淋巴管瘤,淋巴管肉瘤11]。

尽管在肺淋巴管有被描述在几百年前12)详细报告的准确识别人类肺淋巴管是零星的。

肺结构的组织学特征表明,淋巴管位于附近的航空公司和主要血管,这一现象可能与他们的角色在肺泡间隙必须获得一个有效的呼吸。虽然不是由该领域的专家,据几位调查人员之后,这个特定的函数将比血淋巴的贡献更重要的脉管系统(13- - - - - -16]。在这方面,数值较低发病率和压扁的淋巴管很难评估他们的形态学评价在牙槽间的隔膜的正常的人类肺癌和因此可能功能相关性(13,15]。然而,通过免疫组织化学(13]或铸型扫描电子显微镜(15),可测量的量淋巴管主要位于小叶间和bronchovascular间质似乎不到一半的血管(13]。有趣的是,观察淋巴管密度和表面积的增加在peribronchiolar空间比血管周的位置(13]。

尽管淋巴管和lymphangiogenesis与肺部疾病的发病机制,评估他们的生物和功能参与是失踪。人类研究显示新创分别lymphangiogenesis或缺乏淋巴管受弥漫性肺泡损伤或严重哮喘患者(17- - - - - -19]。在特发性肺纤维化严重伤害的胸膜下和小叶间淋巴管建议肺泡间隙作为一种新的假定的疾病发病的机制(20.,21]。淋巴血管系统结构和功能的变化也与肺移植和同种异体移植物排斥的设置11]。

很明显,更好的理解特定的淋巴器官可能导致识别细胞和分子的目标,其调制可能干扰引起的一些病理过程包括neo-lymphangiogenesis肿瘤及其转移扩散。

细胞培养模型可能是至关重要的阐明肺微血管内皮细胞的病理学。然而,大多数我们当前的知识来源于实验培养人脐带静脉内皮细胞(HUVECs)。

方法来获得淋巴内皮细胞从几个组织(22- - - - - -25已报告和提出了不同的隔离程序隔离一个相对单纯的人口从人类和小鼠肺微血管内皮细胞组织(26- - - - - -30.]。然而,协议的详细描述收获,培养和传播淋巴内皮细胞(lec)从人类肺还没有发布。

在这里,我们描述一个简单和廉价的方法,要求最低设备及配件,获得淋巴(HL-LECs)和血液(HL-BECs)内皮细胞从健康的人类肺使用两步净化工具基于顺序排序和CD31单克隆抗体——Pdn-coated顺磁珠。

HL-LECs广泛特点是形态,包括透射电子显微镜(TEM)、免疫细胞化学、流式细胞术,人工基底膜上形成管状结构的能力评估。

2。材料和方法

2.1。组织抽样

研究55影响肺癌患者和期或肺切除术的手术,帕尔玛大学医院。患者知情同意后参加就业的生物样品的研究目的。过程是人类研究机构审查委员会批准的帕尔马(大学医院的伦理委员会),符合《赫尔辛基宣言》提出的原则。

肺组织收集和无菌条件下转移到实验室的病理学(S.Bi.Bi.T。部门)。样本由医务人员确保他们的优先级处理1小时内切除用于诊断目的。0.5 - 1 g得到的碎片最小安全距离7厘米的肿瘤。正确的抽样程序排除病理结果由随后的组织学分析。

新鲜、健康的肺组织被沉浸在无菌PBS不久执行细胞隔离或中性缓冲福尔马林固定在10%,嵌入在石蜡组织学和免疫组织化学分析。

2.2。免疫组织化学

以确保收获肺组织并没有肿瘤病变或其他病理条件下,固定样本与苏木精和伊红染色())。免疫组织化学检测淋巴管进行石蜡包埋部分减少5点μ米厚度。deparaffinization之后,燥热引起抗原检索在10毫米进行柠檬酸钠缓冲(pH值6)15分钟的微波炉。部分被冷却到室温(RT),在蒸馏水清洗,冲洗在PBS和孵化20%山羊血清(西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州,美国)30分钟在RT阻止非特定的绑定。

部分是孵化主要抗体:鼠标反CD31(可以使用;一夜之间(o / n) 4°C;DAKO,哥本哈根,丹麦)和兔反生产(1:100;o / n 4°C;ReliaTECH,布伦瑞克,德国)。TRITC——FITC-conjugated anti-mouse anti-rabbit抗体(西格玛奥德里奇),同时分别被用来检测两个抗原表位。核和0.5毫克/毫升4′,复染色6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI;18分钟RT;西格玛奥德里奇)。幻灯片被Vectashield安装(美国向量实验室,伯林盖姆,CA)和分析使用荧光显微镜(徕卡DMI6000B,海德堡,德国)。 Fluorescent images were digitally captured with “LAS Advanced Fluorescence” software (Leica) connected to the microscope provided by a digital camera (Leica DFC350FX).

2.3。处理的新鲜的肺部组织

片段的健康肺标本洗几次磷酸缓冲溶液(PBS)和切碎用剪刀和被酶消化75分钟37°C和1毫克/毫升胶原酶/ dispase解决方案(罗氏、巴塞尔、瑞士)。结果消化产品挤在一个100年μ尼龙网(美国BD生物科学,圣何塞,CA)去除总量。收获细胞被洗,播种胶原涂层的6-well板(BD生物科学)和培养完全生长介质组成的内皮生长medium-MV (EGM-MV;Lonza Walkersville,医学博士,美国)+ 5%胎牛血清(的边后卫;Lonza)和2 ng / mL重组人血管内皮生长因子c (VEGF-C;ReliaTECH)。

24小时后,不依从细胞和碎片被移除,而粘附细胞的人口被PBS和培养在完全培养基,直到70 - 80%融合(通常在5 - 7天)。

2.4。LEC隔离和文化

主要的文化被胰蛋白酶/收获EDTA(西格玛奥德里奇),孵化20μL货代试剂和20μL反CD31 immunolabeled磁性微,根据制造商的建议(CD31微磁设备;Miltenyi研究,Bergisch格拉德巴赫,德国)。

总之,15分钟后在4°C,细胞被加载到一个列女士(Miltenyi研究)和放置在磁场OctoMACS分离器(Miltenyi研究)。所有恢复ECs,积极选择CD31的磁性粒子集中器,培养在collagen-coated T25烧瓶(BD生物科学)在完全培养基。

当达到80 - 90%的融合,细胞CD31选择被胰蛋白酶化分离,洗涤、resuspended在100年μL PBS和孵化,20分钟在4°C, 1μg鼠标反生产(ReliaTECH)。孵化后,细胞被洗,离心机,resuspended 30μL PBS 0.5%的边后卫,孵化15μL山羊anti-mouse antibodies-coated磁性微(MiltenyiBiotec) 15分钟在4°C。细胞被重新加载到一个列放置在磁场的女士OctoMACS分离器和筛选了2毫升PBS添加0.5%的边后卫。未分类的人口,是细胞分数和磁贴上标签ECs保留在列分别处理。删除列的磁场后,磁保留生产排序细胞筛选了2毫升PBS包含0.5%的边后卫和淋巴内皮细胞(lec)表示。lec被播种、培养和传播EGM-MV加上5%的边后卫和2 ng / mL VEGF-C。生产无序细胞代表血内皮细胞(bec)被播种,培养和传播EGM-MV + 5%的边后卫。

人类肺淋巴内皮细胞(HL-LECs)和人类肺血内皮细胞(HL-BECs),定期检查倒置光学显微镜(奥林巴斯CK40、东京、日本),是连续他们的亚文化的分流比1:5到biocoat T25瓶(1×10⁴细胞/厘米²)。HL-LEC可以很容易地从一段2 (P2)扩大到8 (P8)没有形态的变化和细胞衰老的迹象。几个低温瓶(VWR国际PBI价格PA,美国)包含5×10⁵从每个恢复内皮细胞细胞系被冻结在低温贮藏的解决方案包含90% (v / v)的边后卫(西格玛奥德里奇)和10% (v / v)二甲亚砜(西格玛奥德里奇)储存在液氮和创建一个主细胞库。瓶在一夜之间被放置在低温1°C冷冻集装箱(VWR国际PBI)−80°C和转移后24 - 48小时之内在液态氮。这里描述的所有实验进行HL-LECs P8 P2。

2.5。TEM分析

HL-LECs被透射电子显微镜(TEM)分析检测典型的亚细胞的特性与淋巴内皮有关。

HL-LECs后被扩大,胰蛋白酶化离心获得可见的颗粒。颗粒固定在Karnovsky溶液(4%甲醛、5%戊二醛)90分钟RT与磷酸盐缓冲洗后,pH值7.2,颗粒是嵌入在琼脂保持凝聚力进行后续处理。

样品在1%四氧化锇(OsO你找找₄)90分钟在RT和脱水,增加酒精的浓度。在这个过程中,样本水洗氧化丙烯和嵌入在环氧树脂(Durcupan ACM,西格玛奥德里奇)。树脂聚合后,样品被削减的部分0.5μ米厚度,随后与亚甲蓝染色和红色染料选择形态感兴趣的领域。超薄部分收集300 -铜网格和网格,柠檬酸与醋酸双氧铀和铅染色后,定性研究了透射电子显微镜下飞利浦EM(208年代)。

2.6。流仪结果

HL-LEC汇合的单层膜在P3和P8分离胰蛋白酶/ EDTA、细胞颗粒resuspended PBS的边后卫和整除1×10 1%⁵细胞/管抗体标记。一百毫升的细胞悬液在4°C孵化30分钟和1μg鼠标反生产(ReliaTECH)。主要抗体绑定是探测到山羊anti-mouse免疫球蛋白FITC。消极的控制由遗漏主要抗体的反应。活细胞的使用前(FSC)和侧散射(SSC)点阴谋。

细胞被FACS-Diva分析软件(FACScanto II, BD生物科学)获得至少50000事件。

2.7。免疫细胞化学

免疫细胞化学进行HL-LEC室上培养的幻灯片(BD生物科学)使用胶原蛋白溶液1型(西格玛奥德里奇)。当达到80%的融合,细胞被固定在寒冷的4%多聚甲醛在PBS, pH = 7.4 30分钟在RT与PBS洗涤后,HL-LECs山羊血清暴露于20%(西格玛奥德里奇)30分钟在RT阻止非特定的绑定。

细胞培养用以下主要非结合的抗体:鼠标反CD31(可以使用;o / n 4°C;DAKO),兔子反血管性血友病因子(vWF) (1: 200;o / n 4°C;DAKO),兔子反Prox-1 (1: 20;75分钟37°C;阿克利,Herford,德国)与0.1% Triton X100光透化作用后,鼠标反alpha-smooth肌肉肌动蛋白(αsma) (1: 200;o / n 4°C;DAKO),鼠标反血管内皮生长因子受体2 (VEGFR-2 / KDR) (1: 100;o / n 4°C;ReliaTECH),兔子反VEGFR-3 (1: 25;o / n 4°C;Abcam)。Fluorochrome-conjugated二级抗体(1:70;60分钟37°C;西格玛奥德里奇)被荧光显微镜用来检测不同的抗原表位。 Nuclei were recognized by counterstaining with DAPI for 15 minutes at RT and cover slips mounted with Vectashield.

样品进行了分析使用荧光显微镜(DMI6000B徕卡)。荧光图像数字捕获与“拉斯维加斯先进荧光”软件(莱卡)连接到一个显微镜由数码相机(徕卡DFC350FX)提供。

D2-40 LYVE-1,纤维母细胞生长因子受体(FGFR) 1、表皮生长因子受体(EGFR),肝细胞生长因子受体c-MET,胰岛素样生长因子受体1型(IGF-1R),血小板源生长因子受体(PDGFR)β,Tropomyosin-related激酶(TrkA),生成我受体()被immunoperoxidase调查。简单,固定后,室的幻灯片HL-LECs沉浸在3%过氧化氢溶液10分钟,然后用鼠标反D2-40孵化(1:50;o / n 4°C;Biocare医疗、和谐、钙、美国),兔子反LYVE-1 (1: 50;o / n 4°C;Abcam,剑桥,英国),兔子反FGFR-1(1: 40岁;o / n 4°C;细胞信号传导,贝弗利,妈,美国),鼠标反人类表皮生长因子受体(1:40岁;o / n 4°C;Zymed-Invitrogen,宏伟的岛,纽约,美国),兔子反c-MET(根据制造商的建议; Ventana-Roche), rabbit anti-human IGF-1R (1 : 30; o/n 4°C; Cell Signaling), rabbit anti-human PDGFR-beta (1 : 25; o/n 4°C; Abcam), rabbit anti-human TrkA (1 : 40; o/n 4°C; Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Germany), and rabbit anti-human(1:70;o / n 4°C;微孔,达姆施塔特,德国),分别。抗体的免疫反应被anti-mouse透露,anti-rabbit二次聚合与辣根过氧化物酶在Tris-HCl缓冲指令后提前/合装备(DAKO)。细胞学的准备然后用苏木精复染色,分析了光学显微镜(奥林巴斯BX60)连接到QICAM相机(打印大师、萨里、BC、加拿大)。

对于每一个抗原决定基immunoperoxidase或免疫荧光测试,消极的控制由样本孵化与二次抗体和省略主反应的抗体。的特异性免疫反应被暴露我们的内皮细胞记录准备CD45作为无关的抗原抗体(参见图S4在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2015/747864)。此外,人类皮肤成纤维细胞被作为采用消极的控制检测内皮标记。

2.8。在体外血管生成试验

管的形成进行分析根据制造商的建议和之前报道的方法做了一些调整(31日]。简单地说,80年μL(基底膜基质(BD生物科学)加载的96孔板的底部(BD生物科学)。30分钟后在37°C,细胞(2×10⁴细胞/ 100μL在每个)悬浮在完成生长介质轻轻分层在基底膜基质。24小时后,评估成型能力,图像使用倒置显微镜捕捉到一个(奥林巴斯CK40)连接到一个数码相机(奥林巴斯DP21)。

3所示。结果

3.1。免疫组织化学检测的人类肺淋巴管

用于细胞隔离肺样本的片段进行显微镜检查。部分沾)分析排除病理发现和识别领域的保护肺泡薄壁组织(补充数据,图S1A)。检测淋巴管、双immunolabelling CD31和淋巴标记进行生产。

与之前的研究结果相一致(13- - - - - -16),在健康的肺组织淋巴管记录的存在血管概要文件(补充数据,图印地)。血内皮细胞被标记只CD31(补充数据,图印地)。

3.2。隔离和HL-LEC和HL-BEC的文化

组织消化后,主文化的异质粘附细胞的人口,主要是由基质细胞、成纤维细胞、巨噬细胞和内皮细胞集群时显示“cobblestone-like”形态(数字特征1(一)和1 (b))。Sub-confluent单层细胞恢复了胰蛋白酶/ EDTA和排序与微涂anti-CD31抗体清除污染细胞(图1 (d))。

CD31排序ECs培养直到融合恢复与胰蛋白酶/ EDTA和另外排序anti-Pdn immunolabelled微。通过这种方法,高纯度lec从人类肺组织(HL-LEC)成功地收获(图1 (c))和进一步扩大他们的描述(见下文)。

消极的选择从生产排序是恢复和血内皮细胞(bec)表示。虽然也bec被播种、培养和传播到biocoat瓶EGM-MV加上5%的边后卫,这个细胞的人口将不会详细的报告。

这种方法允许我们隔离内皮细胞从51 55加工人类肺样本的收益率为92%。

3.3。HL-LECs传播和低温贮藏

HL-LECs被播种,培养和传播(比1:5)到biocoat T25瓶(1×10⁴细胞/厘米²EGM-MV加上5%的边后卫和2 ng / mL VEGF-C至少8通道没有显著变化形态、生长特性和细胞衰老的证据(数据没有显示)。一个统一的单层最初根据形态学标准确定为内皮细胞。在典型的文化中,从P2 P8, HL-LEC的倍增时间为32.3±2.5小时。

在几个段落,细胞被整除,低温贮藏。随后,随机低温瓶是解冻复苏(数据未显示)。

3.4。TEM分析

典型的淋巴内皮细胞的超微结构特征被TEM记录。肺中培养内皮细胞显示突出的微绒毛细胞表面(图1 (e))。除了丰富的胞质microvescicles的存在和高度发达的粗面内质网(图1 (f)),电子致密杆状microtubulated身体,原本被韦贝尔,Palade32),被发现在培养HL-LECs(数字1 (g)- - - - - -1 (j))。此外,正如之前报道(33),大量的自噬空泡和并行总量扩大的中间丝经常被观察到内皮细胞(数据没有显示)。

3.5。Immunophenotypic表征HL-LECs

3.5.1。流仪结果

在细胞分离和确定效率HL-LECs淋巴的本质,流式细胞仪生产的表达进行分析。如数据所示2 (b)和2 (c),100%的分离和培养淋巴内皮细胞系来自人类肺组织阳性淋巴特定标记在P3和这个属性被保留直到P8。细胞筛选了从生产immunomagnetic排序代表HL-BECs没有表达相关的淋巴抗原在流式细胞仪分析(图2 (d))。

3.5.2。采用免疫分析

确保纯度的细胞恢复了双immunomagnetic排序、免疫细胞化学进行lec室上培养的幻灯片。

pan-endothelial标记CD31膜糖蛋白是一个积分,也称为血小板内皮细胞粘附Molecule-1 (PECAM-1),这是既定的成熟内皮细胞表面的表达。CD31在相邻内皮细胞之间的连接,高纯度在体外和在活的有机体内(34,35]。因此,几乎所有我们培养lec与丰富的膜表达CD31阳性(图3(一个))。同样,血管性血友病因子(vWF)糖蛋白,表现出强劲颗粒胞质表达(图3 (b))。有趣的是,vWF Weibel-Palade体内存储在内皮细胞(32进一步加强他们通过TEM检测。相比之下,的表达αsma一直没有在我们准备HL-LEC(数据没有显示)。

定义淋巴表型,三个特定的细胞标记D2-40 LYVE-1 Prox-1检查。

D2-40 / podoplanin mucin-type跨膜糖蛋白和CD31不同,认识到血液和淋巴内皮细胞抗原表位,其免疫反应性限制和有选择地表达LEC。我们的调查结果证明,从人类获得所有lec行肺表达率为100%(图生产3 (c))。

LYVE-1,淋巴细胞外基质粘多糖透明质酸受体广泛表达在我们准备的lec显示特征模式在细胞膜表面(图3 (d))。

Prox-1、关键控制基因的程序指定淋巴内皮细胞的命运,一直表达的淋巴内皮细胞分离出健康的人类肺组织(数据3 (e),3 (f),3 (g))。

重要的是,这些标记物的表达是保存在细胞扩大至少8通道。

因此,通过免疫细胞化学,我们的人口HL-LEC拥有不同的淋巴内皮细胞的表型特征。

3.6。HL-LECs表达多个酪氨酸-受体

受体酪氨酸激酶(rtk)跨膜受体,使磷酸化酪氨酸残基与各蛋白质底物特异性。rtk扮演重要的角色在细胞信号和参与各种流程。尤其是在淋巴管内皮细胞rtk是高度相关的由于他们的重要作用在细胞生存、增殖,迁移,lymph-angiogenesis [36]。

因此,TK受体的存在在我们人类HL-LECs调查的主要文化。

VEGFR-2被认为是血管生成的主要中介,虽然也表示对lec在低水平。VEGFR-3是一个关键受体淋巴血管的生长在发展和成人的生活。配体结合促进受体二聚作用,这可能发生在两个VEGFR-3分子(homodimerization)或VEGFR-3和VEGFR-2分子(heterodimerization)。这些生化事件中发挥基础作用lymph-angiogenesis [36,37]。如数据所示4(一)和4 (b)VEGFR-2和VEGFR-3被人类HL-LECs明确地表达在体外。这些抗原表位的免疫荧光信号中没有检测到负控制细胞系(补充图S3)。

表皮生长因子受体,也称为ErbB1 HER - 1,第I型受体酪氨酸激酶,ErbB成员,或者她,家庭的受体(EGFR, HER - 2,她的3个,4)。表皮生长因子受体与内部是一种跨膜蛋白酪氨酸激酶域。激活的许多表皮生长因子受体配体导致二聚作用,与另一个表皮生长因子受体(homodimerization)或另一个从她的家人(heterodimerization)受体,激活酪氨酸激酶的催化系统的(36,38]。这将导致多个通路的激活,促进生存、增殖和血管生成。这些活动是由增殖作用主要通过蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3-kinase (PI3K) akt通路38]。典型的EGFR蛋白表达的主要文化HL-LEC图所示4 (e)。

同样,FGFR-1属于一个高度保守的受体酪氨酸激酶家族:FGFR1-4。这种受体激活下游信号通路的数组,如MAPK和PI3K / Akt通路。这两个通路调节等关键细胞行为生存,增殖,分化和lymphangiogenic效果在目标细胞(39]。如图4 (f),几乎所有HL-LECs在体外表达FGFR-1。

1型胰岛素样生长因子受体(IGF-1R)属于RTK总科和调节关键信号通路与增长,增殖,分化和细胞凋亡。在质膜在配体结合,介导的信号事件IGF-1R发生主要通过激活PI3K-Akt和MAPK通路(40]。HL-LECs培养在体外表达IGF-1R,如图4 (g)。

c-MET受体酪氨酸激酶及其配体肝细胞生长因子(HGF)中扮演一个重要的角色在组织内稳态的调控在正常的生理条件。然而,HGF / c-MET轴也被卷入癌细胞生长的规定,血管生成,入侵和转移。除了交互与其他血管生成信号,c-MET似乎作为一个独立的血管生成因子(41,42]。HL-LECs表达c-MET受体的特征模式(图4 (h))。

PDGFR-beta主调节器的lymphangiogenesis拥有各种各样的生物活动,包括细胞生存、增殖和趋化作用[43]。因此,我们可以观察到,我们准备HL-LEC广泛表达在体外PDGFR-beta(图4 (d))。

最后,TrkA和生成受体的表达进行评估,因为最近的研究表明,这两种受体参与血管生物学。高亲和性TrkA受体作为受体对于某些神经营养因子,包括神经生长因子(神经生长因子),脑源性神经营养因子(BDNF),生成3 (NT3),在开发和维护中起着至关重要的作用的中枢和周围神经系统。的低亲和力雪旺细胞和神经元中表达,属于肿瘤坏死因子家族,导致大量的信号与多个共受体复合物的同事,包括TrkA [44- - - - - -47]。如数据所示4(我)和4 (j)表达TrkA和HL-LEC确认由我们实验室。

3.7。在体外血管生成试验

capillary-like管的形成是一个非常特定的内皮细胞功能特性(31日,48]。确定我们的细胞群至少血管生成属性在体外,我们调查的能力HL-LEC组织基底膜基质tubule-like网络。lec能够形成管状结构,以应对一个矩阵,它模拟基底膜的物理和功能特性(补充数据,图S5)。

4所示。讨论

血液血管系统已经深入研究了自发现以来,然而,只有在最近几年,淋巴系统已成为一个至关重要的球员在各种不同的病理生理过程和条件如炎症、伤口愈合、肿瘤转移。具体来说,需要有效的呼吸,肺淋巴管主要归因于肺泡间隙已经建立的重要贡献。淋巴管一直也与特发性肺纤维化的发病机制,lymphangioleiomyomatosis和转移性癌症,代表一个潜在的新方法,开发有效的目标治疗严重的肺部疾病(1,13,17,20.]。

内皮细胞形成的内在细胞衬里血液和淋巴管。内皮细胞表型在时间和空间不同的监管,导致这一现象的“EC异质性”这意味着每个血管床具有独特的结构和功能性质49]。

可能是至关重要的细胞培养模型研究肺微血管内皮细胞的病理生理的作用。我们的大部分知识是来自研究培养人脐带静脉内皮细胞(HUVECs)由于其可访问性和可再生的隔离,但不代表成年人体微循环的典范。大多数研究已成功地识别和净化血液从肺部微循环内皮细胞。此外,像自动细胞分选方法昂贵,耗时且不容易访问每一个实验室。此外,直到最近,淋巴内皮细胞系已制作完毕并虽然昂贵的商业应用。

因此,我们的实验室开发了一个协议,常规和大规模的内部使用,收获,隔离并扩大人类肺淋巴内皮细胞。

我们相信,几个步骤是关键的成功和有效性的过程获得纯人口淋巴内皮细胞从人类肺微循环。

首先,快速(一小时内)处理生物材料切除后立即确保保存细胞的生存能力和生物属性。此外,每日观察内皮细胞形态和生长至关重要决定珠分离的最佳时间,避免不必要的细胞的增生。最后,使用标记细胞排序CD31和生产等,无疑是丰富,特别是淋巴内皮细胞表达的在活的有机体内和在体外允许HL-LEC隔离的可再生的和有效的结果。采用免疫检测细胞表面标记的证实,孤立的淋巴细胞来源。经流式细胞仪这些表型特征。

缺席的情况下α光滑的肌肉肌动蛋白是重要的细胞在培养中排除污染后立即CD31和生产的双重选择。这些数据被存在进一步加强淋巴endothelium-specific标记Lyve-1和Prox-1等。

我们也证明,我们的收获和扩大HL-LEC在功能上是称职的。实际上,当重组基底膜上镀矩阵,HL-LEC快速连接,对齐,并形成capillary-like小管,模仿lymphangiogenesis。Lymphangiogenesis新淋巴管的形成从先前存在的一个重要的生物过程与不同病理状态。这个试验是容易的,具有成本效益,意味着HL-LECs能够激活信号通路参与细胞粘附、迁移和蛋白酶活动最终导致tubule-like微脉管的形成。

获得淋巴内皮细胞生物学见解,我们决定是否准备HL-LEC表达相关受体酪氨酸激酶(rtk)。

rtk核心球员在信号转导网络和配体结合激活内在蛋白酪氨酸激酶域触发细胞内的信号级联。

我们证明,几乎所有HL-LECs,在体外保留VEGFR-2的表达,VEGFR-3 EGFR-1, FGFR-1, c-Met, IGF-R1, PDGFR-beta TrkA,。除了他们的含义在细胞生存、增殖、迁移,lympho-angiogenesis, rtk已成为研究最多的一类药物制药行业的目标。

5。结论

我们已经能够孤立地人类肺淋巴内皮细胞从健康肺组织通过双磁性细胞分选使用商用抗体的结合。为数不多的失败发生在最初的应用程序,主要是由于设置时间组织消化和微生物污染。完全地描述HL-LECs证实了高水平的纯度和成功的文化产生大量的细胞,可以扩大几个段落和低温贮藏对进一步的研究是可行的。

HL-LEC可能代表一个重要的工具在体外淋巴研究生物学、lympho-angiogenesis、伤口愈合、炎症、抗癌疗法,和与微生物制剂。我们的报告表明,纯化策略隔离bec和lec,可以应用于其他人体组织。我们相信器官,针对病人的内皮细胞对阐明至关重要信号通路参与肺部疾病的发病的机制,并提供新方法达到一个真正的个性化治疗的目标。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

布鲁诺Lorusso和费德里科•Quaini设计研究,写论文。安吉拉·法尔科,丹尼斯Madeddu Caterina Frati,高卢Graiani,安德里亚·Gervasi劳拉·里纳尔蒂和大卫。Maselli获取和分析数据。莱蒂齐亚Gnetti和恩里科·m . Silini负责形态和病理分析。Eugenio Quaini、卢卡Ampollini和保罗Carbognani负责选择和登记的病人和外科手术。斯特凡诺卡瓦利和Lagrasta批判修正之前提交。

确认

作者要感谢加布里埃尔Becchi(生物医学、生物技术和转化科学,帕尔玛大学医院,意大利),伊米莉亚Corradini(生物医学、生物技术转化Sciences-University-Hospital帕尔马,意大利),和塞布丽娜Bonomini(临床和实验医学,帕尔玛大学医院,意大利)技术援助。这部分工作是支持的当地格兰特FQ资助大学的帕尔玛。

补充材料

引用

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