生产人类内皮细胞免于可溶性异种的人工小直径血管移植物Endothelization抗原

文摘

动脉旁路移植后植入保持先进的心血管疾病患者的主要治疗,但大多数缺乏足够的隐静脉或其他管道绕过程序和将受益于这种人工管道。本研究的目的是在大规模生产人类内皮细胞(hec),异基因的抗原,开发小直径、兼容的容器可能作为血管移植物。人类脂肪基质细胞(hASCs)是孤立的,培养和分化的人类血清和用于reendothelization脱细胞的大鼠主动脉。hASC派生ECs (hASC-ECs)表示VEGFR2 vWf和CD31内皮细胞标记,后者在水平高于hASCs和HUVECs,显示功能。去细胞的协议取得了主动脉没有细胞核,保存结构,包括保留基底膜。当与hASC-ECs播种时,脱细胞动脉完全reendothelized, hASC-ECs维护他们的表型在这个新的条件。hASCs可以分化为功能性hec不使用动物补充和能够reendothelizing脱细胞大鼠主动脉同时保持他们的表型。后去细胞基底膜的保护支持的完整reendothelization脚手架没有对其他层细胞迁移。这种方法可能是有用的快速obtention兼容,xenogeneic-free管道。

1。介绍

大约三分之一的500.000冠状动脉搭桥手术的患者每年在美国(1缺乏足够的或健康的自体组织血管移植(2]。这类病人然后依靠人工移植,这是一个有用的替代来填补这些差距,因为他们现在良好的开放属性(2]。不过,目前这些移植遭受小直径血管thrombogenicity率高(< 6毫米)(3),留下了一个伟大的未满足的需要对小直径血管移植。

迄今所采取的策略,以防止移植失败是覆盖移植接口主要人类内皮细胞(hec),尽管这一过程受阻,细胞产量低,有限的细胞可塑性和丧失分化能力hec后持续扩张在体外(4]。在这样的场景中,寻找替代来源hec的兴趣。人类脂肪基质细胞(hASCs)已被证明是容易分离,扩大,分化成hec在体外大规模生产的,构成一个优秀的选择和功能hec兼容。然而,当前单元格的文化补充含有异基因的蛋白质,这可能是感染的来源(5,6和生成特定的免疫反应7]。

最近,我们已经表明,人类同种异体血清(aHS)是一种适合细胞培养补充hASCs [8]。除了维护hASCs成功在体外,它维护hASCs multipotency和诱发高增殖率没有促进细胞衰老或丧失分化能力8- - - - - -10]。因此,唯有通过可能的使用有利于组织工程方法。

在目前的研究中,我们旨在生产功能hec和使用它们促进鼠reendothelization去细胞主动脉。我们建议协会hec起源于人类脂肪基质细胞(hASC-ECs)和异基因的细胞外基质(ECM)的可行性和可能构成一个快速和有效的策略来开发一个兼容的船舶免于异种的可溶性抗原为潜在使用直径较小的血管移植物。

2。材料和方法

2.1。唯有Obtention

观众是来自健康的捐赠者全血从所有血型类型,如前所述,我们组(8]。简单地说,全血收集并被允许自发凝结。血清是由离心分离和混合生产稳健。唯有通过灭活在56°C的30分钟和整除无菌管,保持冷冻直到使用。这个过程在研究伦理委员会批准的联邦大学的米纳斯吉拉斯(ETIC 21176413.9.0000.5149数量)。

2.2。基础培养基

基础培养基(BM)由杜尔贝科修改鹰中葡萄糖(DMEM) (Sigma-Aldrich)补充5毫米碳酸氢钠(Cinetica Quimica Ltda),青霉素(100 U /毫升),链霉素(0.1毫克/毫升)、两性霉素B(0.25毫克/毫升;Sigma-Aldrich)、庆大霉素(60 mg / L;先灵葆雅),10%的观众。

2.3。内皮细胞培养基

内皮介质(EM)组成的DMEM补充了5毫米碳酸氢钠(Cinetica Quimica Ltda),青霉素(100 U /毫升),链霉素(0.1毫克/毫升)、两性霉素B(0.25毫克/毫升),(Sigma-Aldrich)、庆大霉素(60 mg / L;先灵葆雅),1%的观众,1毫克/毫升VEGF表达载体,和0.1毫克/毫升bFGF(表达载体)。

2.4。hASCs隔离和文化

人类脂肪组织从健康的病人,减少腹部手术原因审美。本研究经伦理委员会批准的联邦大学的米纳斯吉拉斯(ETIC 21176413.9.0000.5149数量)。hASCs的隔离和文化进行描述,与少量修改8,11]。短暂,多余的血液的原始lipoaspirates与磷酸盐(PBS)洗和被酶消化脂肪组织进行孵化的解决方案中的组织0.075%的I型胶原酶在PBS(生命技术)在37°C 1 h。然后,间质血管分数被孤立在252 g离心10分钟,和颗粒悬浮在BM和镀到细胞培养瓶(Sarstedt)。烧瓶在37°C 5%孵化有限公司₂和一个湿润的气氛。银幕上h(孵化后,塑料贴壁细胞分离与媒体和那些被称为hASCs变化。BM改变每2 - 3天。亚文化进行每次细胞群confluency达到80 - 90%,孵化的细胞0.05% Trypsin-EDTA(表达载体)解决方案3 - 5分钟,当细胞开始脱离组织培养瓶。胰蛋白酶溶液被灭活,加入相同体积的BM补充人类血清烧瓶,以及由此产生的细胞悬液在新细胞培养瓶山肩。细胞扩展这种方法直到4通道,当他们被用于分析。

2.5。流式细胞术

表型特征的孤立hASCs进行间充质干细胞和组织委员会推荐的国际社会的细胞治疗(12和表现已经描述了其他地方8]。简单地说,第四段未分化hASCs脱离细胞培养表面,计算。大约一百万个细胞被洗PBS和孵化与以下主要非结合的鼠单克隆抗体:CD29(圣克鲁斯的猫。号码sc - 9970)、CD44(圣克鲁斯的猫。号码sc - 7297)、CD34 (Abcam猫。ab8147 - 500),数量和CD45 (BD生物科学,猫。616256号)和共轭抗体:HLA-ABC-fluorescein异硫氰酸酯(FITC) (Abcam,猫。号码ab20313 - 100)和HLA-DR-FITC (Abcam,猫。数量ab36775 - 500)。二次抗体使用Alexa萤石488山羊anti-mouse免疫球蛋白(表达载体,猫。 number A11001). Flow cytometry was performed using a Guava easyCyte 6-2L Flow Cytometer (Millipore). Five thousand events were acquired using the software Incyte (Millipore), analyzed using FlowJo 7.5.6 and compared to isotype controls.

2.6。内皮分化

内皮分化与7.5×10的文化表现⁴内皮细胞培养基。短暂,hASCs脱离组织培养瓶,统计,播种密度的BM 10³细胞/厘米²在T75细胞培养烧瓶(Sarstedt)血压得到较好的控制。24小时后,大英博物馆被删除,使用EM之后21天。他们是改变每2 - 3天。

2.7。rt - pcr

hASCs对内皮细胞的分化命运评估根据内皮标记基因表达VEGF受体2型(VEGFR2)和血管性血友病因子(vWF)。为了做到这一点,在诱导期的结束,总RNA提取使用试剂盒和反向转录成cDNA使用RevertAidTM H减去M-MuLV rt PCR进行VEGFR2(正向引物(FP): 5′GGAATACCCCTTGAGTCC3′,反向引物(RP): 5′CCTCCAACTGCCAATACC3′), vWF (FP: 5′公司治理文化TCCAGGATGGCTGTG3′,总机:5′GTACATGGCTTTGCTGGC3′), GAPDH (FP: 5′GGTATCGTGGAAGGACTCATGAC3′,和RP: 5′ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAGC3′)。信使rna也隔绝人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)积极控制。PCR循环如下:2分钟94°C, 94°C 30年代,56°C (vWF和VEGFR2)和60°C (GAPDH) 45和72°C 45 s(30个周期),并为10分钟72°C。分析了rt - pcr产品通过与溴化乙锭1%琼脂糖凝胶电泳和可视化。

2.8。免疫荧光

的分化时期,为内皮细胞染色标记。进行免疫荧光细胞后用4%多聚甲醛固定。之后,细胞被洗、permeabilized和孵化主要抗体在一夜之间在4°C。细胞进行清洗和孵化与二次抗体在室温下1 h。最后,细胞核与DAPI染色和幻灯片使用Hydromount安装。主要的抗体使用鼠标anti-vWF (Abcam,猫。ab129948)和兔anti-VEGFR (Abcam猫。数量2349 - 500)。二次抗体使用Alexa萤石山羊anti-mouse 488(分子探针,猫。A21428数量),Alexa萤石山羊anti-rabbit 555(分子探针,猫。 number A11001). HUVECs were stained and considered positive control.

相同的抗体也用于组织的免疫染色recellularized主动脉。组织部分被洗水和协议描述相似的细胞。

2.9。管形成分析

hASC-ECs形成管的能力在基底膜基质(如前所述)作为评估在体外分析评估内皮细胞功能(13]。对于这个试验,4×10⁴细胞被播种在每个24-well板涂上225µL的固化人工基底膜(BD生物科学)和隔夜37°C的5%孵化有限公司₂孵化器。细胞培养在3µg / mL Calcein-AM(英杰公司)在PBS稀释30分钟37°C的5%股份₂孵化器,免受光。最后,管形成观察、量化和管面积测量在光学显微镜和荧光显微镜下,使用ImageJ 1.47软件。

2.10。主动脉去细胞和动物的信息

刘易斯LEW-Tg (EGFP) F455.5 / Rrrc老鼠6 - 8周大,而表达增强的荧光绿色荧光蛋白(EGFP),从老鼠获得资源和研究中心,密苏里州,美国。动物们被安置在恒温环境下12 h与免费获取光/暗周期的鼠粮和水。所有实验协议依法进行实验动物的人道的使用指南建立在我们的机构。本研究在研究伦理委员会批准的联邦大学的米纳斯吉拉斯(协议编号140/2011)。

主动脉去细胞[发表的根据协议执行14由[],小修改,所述15]。短暂,孤立的主动脉灌注1% SDS和1% Triton x - 100解决方案和消毒的灌注PBS补充与100 U / mL青霉素,链霉素100 U /毫升、两性霉素b后,主动脉心脏和空心隔绝的另一端挂载一个封闭的灌注系统。去细胞后,大约50毫克的组织处理使用DNAzol试剂(技术)基因组DNA隔离,在制造商的指示。孤立的DNA量化使用Nanodrop nd - 1000分光光度计(生活技术,美国)。

2.11。主动脉Reendothelization

hASC-EC评价根据他们潜在的reendothelizing去细胞主动脉与人类血清EM的存在。为了这样做,内皮细胞收获和统计。2.5×10⁶细胞被灌注进了脱细胞基质与最初的静态阶段一夜之间,其次是7天的连续灌注。

2.12。主动脉脱细胞处理组织学和免疫荧光

在4%多聚甲醛固定后,主动脉是嵌入在石蜡或10月(最佳切削温度)。5μ组织学和免疫染色的组织片已经被取消了。苏木精和伊红染色。ECM蛋白质层粘连蛋白和胶原蛋白我是染色组织切片生产后,相同的步骤后免疫荧光细胞染色。主要的抗体使用鼠标anti-rat胶原蛋白我和兔子anti-rat层粘连蛋白(英国从Abcam)。二次抗体用于细胞染色是相同的。

3所示。结果

3.1。hASCs表征

在BM孤立hASCs培养阳性CD29(98.3%)和CD44(99.6%)和缺乏造血干细胞细胞相关标记CD34的表达(0.38%)和CD45 (0.72%)。此外,hASCs HLA-ABC表达(99.8%)和缺乏HLA-DR(0.15%)(图1(一))。

功能,隔离hASCs证明他们multilineage分化潜力,能够生成成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞分化(数据未显示)。这是成矿ECM的能力,在ECM沉淀蛋白多糖,分别在细胞质和储存脂滴。因此,孤立hASCs参加标准的间充质基质细胞(MSC)特征的表型和功能。

3.2。hASCs包含人类血清内皮分化诱导培养基

内皮分化hASCs在观众面前证实了基因和蛋白质表达内皮标记;因此,它们被认为是hASC-ECs。首先,表情VEGFR2通过PCR和vWF评估。正如所料,hASC-ECs能够表达这两个标记内皮血统有关。未分化hASCs也表达了这种基因在离散较小的水平,和HUVECs类似,作为积极的控制(图1 (b))。的定量方法,表达CD31也是评估(图。1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2015/652474),表明hASC-ECs约11倍CD31表达hASCs和HUVECs相比,统计这个标记的类似的表达,尽管后者略高然后hASCs CD31表达水平。

的表达VEGFR和vWF评估通过免疫荧光蛋白水平。我们的结果显示再次hASC-ECs一致的分化成内皮细胞表型,hASC-ECs和HUVECs VEGFR和vWF蛋白质展出。hASCs提出没有这些蛋白质的表达,evidentiating未分化的区别hASCs及其hASC-ECs衍生品(图1 (c))。

3.3。管形成分析

功能的分析来评估内皮分化形成管由调查hec的能力培养在人工基底膜的刺激。由于未分化hASCs表达VEGFR和vWF在离散的水平,这个试验是必要的区分hASCs功能hec。要做到这一点,首先,我们培养HUVECs在这种条件和显示他们的能力形成管。后,hASCs和hASC-ECs也只用于实验和分化hASCs (hASC-ECs)和HUVECs能够形成管一旦刺激在基底膜基质(图1 (d))。尽管hASCs表达一些hec标记,这些蛋白质水平和不存在hASCs不能形成管基底膜基质上播种时。细胞生存能力与Calcein-AM评估。的定性观察证实了定量分析的相对数量管形成和中等大小的管。HUVECs再次显示,高容量的形成管,平均8场,平均大小为22431μ米²。HUVECs hASC-ECs紧随其后,也能够产生管在测试条件下,与14管每个字段(平均大小:8599μ米²)。管形成由hASCs不是观察和考虑几乎缺席。

3.4。主动脉Reendothelization

最后,脱细胞的reendothelization主动脉进行以评估使用的适用性hASC-ECs促进构建可行性在活的有机体内。首先,主动脉去细胞被组织学和DNA验证隔离。正如预期的那样,脱细胞主动脉被证明是细胞核和DNA的部署。此外,脱细胞主动脉呈现层粘连蛋白保留沿着层,包括基底膜(数字2(一个)和2 (b))。

经过一段时间的静态播种,hASC-ECs reperfused和培养7天的封闭系统,以附加和扩散矩阵。在这样的时期,细胞形成连续的可行的细胞,通过组织学和免疫荧光(图所示2 (c)和2 (d))。甚至在灌注biorreactor经过7天的培养,hASC-ECs仍然表达VEGFR和vWF强烈坚持的基底膜去细胞主动脉(图2 (d)),evidentiating构造在灌注系统的稳定性为7天。

4所示。讨论

寻找血管替代物已被证明是困难的,特别是当考虑小直径移植。主要问题工程包括血栓形成、血管钙化,开放维护。一个有效的策略来防止此类事件发生是保护材料循环用hec。因此,无视血管化策略用来替代阻挡或病变的血管,hec总是一个关键组件。一个连续流表面内皮保持移植物通畅,防止血小板沉积,血栓形成,血管内膜增生(16]。此外,它不需要固定的步骤,防止细胞碎片的存在由戊二醛和钙的吸引,都与钙化的过程(17]。除此之外,hec在直接接触一些淋巴细胞类型和可能发起拒绝在一个同种异体移植物上下文,功能作为抗原呈递细胞和直接激活淋巴细胞(18]。因此,他们不得不同主机也不存在异种的抗原。

Endothelization血管移植物观察在活的有机体内个月postgrafing在数周内。单克隆抗体、重组蛋白和寡核苷酸适配子被用来加速移植物endothelization [19]。我们建议endothelization在体外是更快和更高效,因为它已被证明,尽管被reendothelized吗在活的有机体内血管移植缺乏连续内皮仍然显示血栓形成和钙化。在这个场景中,获得大量的自体hec势在必行。hec很容易孤立从病人循环祖细胞(20.,21)或从血管壁活检(22,23]。然而,这些方法都阻碍了细胞产量低,有限的可塑性,拉长后扩张和分化能力在体外(24]。在这里,我们表明,脂肪组织是一个有前途的hec代细胞来源,因为它不受上述限制。此外,脂肪组织可能是一个更可靠的自体来源比血液或骨髓干细胞在糖尿病和其他并发症的存在可以显著减少的可用性干细胞临床使用。

hASCs很容易从脂肪组织中分离出来,并有明确的临床应用潜力。事实上,一些临床试验使用这些细胞执行目标治疗各种伤害和疾病(clinicaltrials.gov)。hASCs可以获得从病人在健康的时候,为了在必要的时候才使用特权,或者从健康的捐赠者。因此,隔离hASCs并进一步分化对内皮血统构成组织工程血管移植物更快和更可靠的方法(TEVG)。

hASCs内皮分化在体外是一致的和可再生的25- - - - - -27]。大多数差异化协议是基于感应与VEGF和bFGF [25,27]。尽管hec诱导的机制还不清楚,众所周知,VEGF诱导Rho-GTPase-dependent hec的分化方式。物理刺激(剪切应力)也促进hASCs内皮分化(26,28]。在目前的工作,我们将刺激hASCs分化。我们的研究结果表明,代hASC-ECs的存在已经是成功的。hASC-ECs CD31, VEGFR2(也称为KDR)和vWF。在这些标记,CD31是最具体的,因为可能KDR表达祖细胞和多能干细胞(29日,30.),和vWF可能发布的血小板(31日]。因此,CD31表达定量评估,由qPCR(图S.1),和显示hASC-ECs高表达的表面标记在样品测试,也包括hASC和HUVECs。这个数据可以表明HUVEC细胞线保持在我们的实验室可能已经失去了这种标记的表达,或者也许我们的文化条件没有促进CD31表达的维护。然而,其他标记评估和出席HUVECs,除了hASCs hASC-ECs,信使rna和蛋白质含量。这些标记是VEGFR2和vWF。尽管这些标记会关联到其他事件,众所周知,前中起着重要作用在活的有机体内血管生成和贡献与基质金属蛋白酶的形成capillary-like结构观察在体外(29日]。后者介导的血小板粘附的血管损伤,稳定第八凝血因子,并有助于hec锚定ECM (30.]。尽管他们也表示不连续的mRNA水平hASCs,这些标记是在蛋白质水平不存在。细胞群在目前的工作也正在调查评估的功能,为了进一步加强我们的索赔在nonxenogeneic hASC-ECs生成条件。正如所料,hASCs不是功能性hec,无法产生管基底膜基质上播种时。相比之下,hASC-ECs能够产生管在测试条件下,确认他们的内皮细胞表型,以及HUVECs。尽管hASC-ECs形成管在更高的金额和小直径和HUVECs相比,这些差异强调的更高的增殖潜力hASC-ECs [31日),这是一个积极的特性,考虑目前工作的提出的目标。这个试验还证实,HUVEC细胞线保持在我们的实验室可能已经失去了CD31表达但仍然是功能和内皮细胞表型的代表。

hASC-ECs播种的生物材料和脱细胞矩阵进行了激动人心的结果(19,31日]。描述,hEC涂布TEVG是可行和安全的,但发达的策略使用自体hEC的主要文化和要花几周时间才能实现完整的贪污endothelization [32]。与我们的方法,可以缩短这个时间,由于高增殖率hASCs培养与保持稳健。

生产上述TEVG需要调查的可溶性抗原动物排除在细胞培养的方法,在执行hASCs分化之前。使用动物源试剂是有争议的因为疾病传播人畜共患病的可能性。朊病毒感染的风险是可以避免的,但是使用平均20%的边后卫在细胞培养中,无论类型,导致MSC携带7至30毫克的牛血清蛋白,导致人类特定的免疫反应(33]。

动物任意选择出现了永生化细胞培养,但很少有产品主要存在于成人细胞,他们通常提供理想的结果。以前,我们组描述了同种异体的人类血清的增殖和分化是一个合适的补充hASCs [8]。在这部作品中,结果表明,hASCs不仅保持经典的表型在这样的条件(例如,细胞标记和多功能分化能力),但也可以分化成功能性hec,管形成如图所示的实验。最后,功能性hec能够生成一个连续的细胞表保存大鼠主动脉的基底膜,在剪切应力的存在。这里,我们生成功能hec免费从动物可溶性抗原和显示功能,能够被用于TEVG方法,可能更快和更安全的方式。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

朱莉安娜洛特·德·卡瓦略进行实验设计、细胞培养和分化,主动脉去细胞和播种,疣状、数据分析和论文写作。亚历山德拉Zonari导致实验设计,数据分析,论文修改。安娜克劳迪娅恰加斯德波拉了实验设计、同种异体血清obtention细胞隔离,和文化和分化,除了论文修改。泰国人玛丽亚·德·马塔马丁斯导致实验设计,数据分析,数据准备,纸和修订。Dawidson阿西斯戈麦斯和阿尔弗雷多·米兰达执行研究概念和设计,数据分析和解释,提供学习资料和论文写作。

确认

共焦激光扫描显微镜在执行Centro de Aquisicao e Processamento de画像(生产技术)。这项工作是由CNPq、披肩和FAPEMIG机构。

补充材料

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