增强和人类粒细胞集落刺激因子的分泌表达枯草芽孢杆菌SCK6

文摘

本研究描述了一个简化的方法增强人类细胞因子的表达和分泌活性的重要,也就是说,粒细胞集落刺激因子(包含),在文化的上层清液枯草芽孢杆菌SCK6细胞。密码子优化GCSF和pNWPH向量包含SpymwC信号序列被长时间的重叠延伸PCR扩增产生multimeric质粒DNA,直接用来变换枯草芽孢杆菌SCK6 supercompetent细胞。的表达GCSF在文化上层清液监测120小时。最高的表达式,它与分泌蛋白总量的17%,在72小时的观察增长。硫酸铵沉淀后,GCSF被快速蛋白液相色谱纯化接近同质QFF阴离子交换柱。圆二色性光谱分析表明,纯化的二级结构内容包含类似商用GCSF。再生的生物活性,发现中性粒细胞与ifosfamine小鼠,也类似于商业制备GCSF。据我们所知,这是第一个研究报告的分泌表达人类GCSF枯草芽孢杆菌SCK6最后复苏的96 mg / L的文化上层清液,不参与任何化学诱导物。

1。介绍

的发展有效的生物仿制药的生产系统是生物技术产业的关键目标之一。大肠杆菌,到目前为止,被认为是一个方便的主机的重组治疗重要的生产和商业相关的蛋白质1- - - - - -3]。然而,许多重组蛋白的超表达宿主导致所需产品的积累以包涵体的形式(IBs),生物活性。而经济复苏所需的额外步骤的生物活性蛋白肠易激综合症导致总体产量低,脂多糖的存在(木糖醇)的外膜大肠杆菌进一步复杂化的净化方案,因此限制了该系统的实用性([4- - - - - -7)和引用)。

针对培养基的外源蛋白的表达可能是一个有吸引力的选择,因为它可以减少下游处理成本(8]。在这方面,革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌直接出口的蛋白质在细胞外介质,可以利用好(6,9]。枯草芽孢杆菌自然,由于其高分泌能力,提供了更好的可折叠的条件,从而防止肠易激综合症的形成而不是大肠杆菌基于表达系统(10,11]。其Sec-dependent秘书通路参与形成分泌preproteins复杂的说法绑定到分泌移位酶,帮助在整个细胞质膜易位。蛋白质释放移位酶切除信号肽后,复合,穿过细胞壁(8,10,12,13]。低蛋白产量、丰富的分泌蛋白酶,质粒不稳定,然而,有一些瓶颈可能有时限制的应用潜力枯草芽孢杆菌([9)和引用)。

嗜中性白血球减少症,减少中性粒细胞计数,是最常见的副作用之一,化疗和/或骨髓移植。人类粒细胞集落刺激因子(包含)是一种重要的生物仿制生存中发挥了重要的作用,增殖和活化的中性粒细胞,从而降低患者发病率(14,15]。它是在临床试验中使用的一些细胞因子与不同的应用程序,也就是说,干细胞动员、治疗中枢神经系统疾病如脑缺血和中风,再生肝组织,等等16- - - - - -18]。克隆和表达这种治疗的重要细胞因子(~ 19 kDa蛋白质)已报告由几个研究小组大肠杆菌但在IBs的形式(14,19,20.]。实现GCSF表达在本土一样,生物活性形式,然而,是一个更有吸引力的选择。

本研究设计一个客观生成vector-host系统可能会利用人类GCSF溶性和生物活性的具有成本效益的生产形式。枯草芽孢杆菌表达宿主,“通常被认为是安全的”,美国食品和药物管理局一直在利用结合pNWPH向量包含强启动子()和SpymwC信号序列改进GCSF分泌到培养基。简化的方法同时放大的向量和插入DNA随后multimeric DNA重组的直接转换成主机也在这里描述的表达式。据我们所知,这是第一个报告,解释了multimeric克隆,增强和分泌,具有成本效益的生产人类GCSF枯草芽孢杆菌SCK6。这项研究可能有助于发展生物仿制药的生物制药公司,为不同应用和分析。

2。材料和方法

2.1。化工、装备、质粒和菌株

本研究中使用的所有化学品和包的最高纯度级商用。空斑形成单位DNA聚合酶、核苷酸、DNA和蛋白质大小标记是购自热科学(美国)。中使用的设计寡核苷酸POE-PCR获得从低聚糖Macrogen(美国)。

质粒pNWPH和枯草芽孢杆菌SCK6 (http://www.bgsc.org/viewdetail.php?bgscid=1A976&Search=sck)菌株,在这项研究中,使用一种X.-Z博士的礼物。张(21弗吉尼亚理工学院和州立大学,布莱克斯堡,弗吉尼亚州24061,美国。媒体的增长枯草芽孢杆菌Luria-Bertani(磅(1%胰蛋白胨、酵母提取物0.5%,1%氯化钠,和pH值7)]和修改2 x L-Mal介质(2%胰蛋白胨、酵母提取物1%,1%生理盐水、7.5%麦芽糖水合物,和7.5吗μg / mL MnSO₄)。氯霉素、红霉素的最终浓度5和1μg / mL,分别被用作选择抗生素。

2.2。重组质粒构建

质粒pNWPH-mini-scaf [22含有氯霉素耐药基因,强大启动子和SPymwC信号序列,用于建设pNWPH-GCSF(图1)。使用的引物多聚体克隆是由50个核苷酸(nt),有25元的重叠区域向量(表的插入和25元1)。人类的基因密码子优化GCSF (KT326155)从pGCSF-08构造放大我们的实验室(未发表的数据)通过使用如果/ IR底漆对向量(pNWPH)支柱使用VF / VR底漆对线性化/放大。

进行了PCR反应混合物中含有密码子优化GCSF基因作为模板,1 x高频缓冲区,0.2毫米核苷酸,0.5μ米的正向和反向引物5的单位空斑形成单位DNA聚合酶。用于高保真PCR用于放大的条件是98°C变性,1分钟;30 98°C的周期变性,10 s;20年代64°C退火;和72°C扩展,75年,其次是72°C扩展为5分钟。纯化PCR的multimerization过程线性化向量和的产物GCSF通过长期执行重叠延伸PCR基本上et al。像您描述23)使用高保真空斑形成单位DNA聚合酶(0.04 U)、核苷酸(0.2毫米),PCR-GCSF (2 ng /μL)和PCR-linearized pNWPH (2 ng /μL)。自行车概要文件是最初的98°C变性(30秒),然后20周期98°C变性(10秒),58°C退火(30秒),和72°C扩展(3分钟)之后,15个周期98°C的变性(10秒)和72°C退火和延伸(6分钟),最后10分钟(图72°C扩展1)。

枯草芽孢杆菌SCK6 supercompetent细胞被X.-Z准备本质上所描述的。张,中州。张平(21]。简单地说,包含1磅中等(5毫升)μg / mL红霉素是接种枯草芽孢杆菌SCK6一夜之间成长在37°C和不断摇晃在200 rpm。隔夜文化稀释用新鲜LB培养基含有2% (w / v)木糖_600年1.0和种植的一两个小时。枯草芽孢杆菌SCK6应变包含额外的副本comK基因,插入木糖启动子的下游。木糖,当添加在SCK6对数生长期的细胞,作为诱导物comK基因表达的细胞的能力。结果supercompetent细胞转换的直接使用或储存在−80°C 10% (v / v)甘油股票。

转换,质粒多聚体(1μ与100年L)涨跌互现μ在37°C L supercompetent细胞和孵化90分钟在200 rpm常摇晃。积极的转化株选择包含5磅平皿上μ孵化后g / mL氯霉素在37°C 14个小时。修改后的碱裂解法(24),涉及治疗细胞颗粒溶菌酶分解细胞壁,用于隔离质粒从两个well-isolated积极的殖民地。限制消化和HindIII和心好限制内切酶进行确认的存在孤立的质粒插入。

2.3。表达枯草芽孢杆菌

改变了枯草芽孢杆菌SCK6细胞,含有重组人类GCSF生长在两个不同的媒体,磅和2 x L-Mal 37°C在困惑厄伦美厄烧瓶内的200 rpm。分泌表达,细胞生长在较低的温度下,也就是说,30°C,总共120小时。1毫升示例整除被定期的增长直到120小时和12小时变化监测spectrophotometrically (OD_600年)。文化GCSF离心后的上层清液检查以分泌表达(6500×g 4°C, 20分钟)通过修改TCA-acetone降水和降水的方法。简单地说,1毫升的蛋白质溶液,150μL添加柠檬酸(100%),放在−20°C 10分钟,然后在14000×g离心5分钟。浮在表面的丢弃,球是用700年μL 100%的冰冷的丙酮去除剩余柠檬酸。解决方案是放在−20°C离心前10分钟。第二洗涤是用70%丙酮和颗粒溶解在50 mM Tris-Cl用于后续分析13% (w / v) SDS-polyacrylamide凝胶电泳。

布拉德福德试验(25)和紫外吸收法被用来测量总分泌蛋白含量和纯化重组GCSF浓度。光密度分析SDS-gels也用于确定%的表达和/或纯度的GCSF水平在不同样本的准备。

2.4。纯化的重组体人GCSF

净化rhGCSF, 72 - 80小时的文化上层的分数受到由硫酸铵盐析沉淀。硫酸铵添加慢慢不断搅拌在4°C到饱和的65 - 80%。收集沉淀,离心6500×g, 10分钟,透析对50 mM Tris-Cl (pH值8.5)缓冲区。随后的蛋白质纯化阴离子交换FPLC系统,使用1毫升HiTrap QFF列(通用电气医疗集团)。列与50 mM preequilibrated Tris-Cl (pH值8.5)。进样后,列洗了2列的50 mM Tris-Cl (pH值8.5)和蛋白质筛选了使用线性渐变的0到1 M氯化钠50 mM Tris-Cl (pH值8.5)。

2.5。圆二色性光谱

圆二色性(CD)数据的收集纯化rhGCSF ChirascanPlus CD分光光度计(英国应用Photophysics)配备了珀尔帖thermal-controlled小型管固定器。比较,CD光谱人类GCSF(白细胞生成素)的商用筹备工作也得到了。校准完成的水溶液中1 s - (+) 10-camphorsulfonic酸。蛋白质的解决方案包含156μ在10毫米Tris-Cl g / mL (pH值8.5)在185 nm - 260 nm波长扫描在2°C,使用石英电池0.5 mM路径长度。每个波长谱平均的结果两个连续扫描带宽为1.0海里。波长光谱被减去空白频谱细化与缓冲。蛋白质的二级结构内容使用CD谱反褶积计算软件CDNN [26)计算二级结构的肽与CD相比已知蛋白质结构的数据库。

2.6。生物活性评价

雄性老鼠每个重达20 - 24 g被分成两组3组,每组由四个动物。他们随意喂食和维护受控条件下的温度(24 - 28°C),相对湿度(~ 65%),和人工照明(每天12 h)。一组三组被用于管理药物。组织了内部准备rhGCSF之一,第二组被商用GCSF(美国σ白细胞生成素),第三组给予0.1% BSA 1 x PBS (pH值7.4)。第二组三组被以同样的方式除了药物是通过腹腔注射的路线。

所有的动物都被赋予了一项单一剂量的ifosfamine 0.5(4.3毫克/毫升)通过皮下或腹腔途径各自团队的每一个动物介绍嗜中性白血球减少症。内部生产rhGCSF和商业准备被稀释的浓度15 - 40μg / mL 1 x包含0.1% BSA PBS (pH值7.4)。注射毒品(1 - 2μg / g的老鼠体重)管理一天后注入ifosfamine,继续每天在接下来的四天。六个小时最后剂量后,外周血样本来自轨道静脉窦。载玻片涂片染色了May-Grunwald-Giemsa(σ)和中性粒细胞总数以及白细胞数使用血细胞计数器。

中性粒细胞的百分比计算通过均值±SD四种动物为路线的管理。通过使用GraphPad棱镜程序(版本4.0),单向方差分析(方差分析)其次是Bonferroni后续测试进行检查数据的统计学意义;值被视为重大当≤0.05。

3所示。结果

3.1。rhGCSF的分泌表达枯草芽孢杆菌

生产战略pNWPH-GCSF向量,用于分泌表达GCSF在枯草芽孢杆菌图中描述1。如图所示,包含的密码子优化基因是强大的监管下启动子和YwmC信号肽编码序列(SPywmC)枯草芽孢杆菌。核苷酸(~ 25)出席5′和3′末端插入和向量的生成在PCR扩增,作为引物对彼此,导致形成的二聚体在第一轮multimeric PCR。二聚体的数量增加了每一轮的PCR循环最后多聚体形成与重复insert-vector-insert-vector序列。multimeric克隆策略,使用在目前的研究中,涉及的直接转换枯草芽孢杆菌SCK6 supercompetent细胞的质粒多聚体,这是与传统的克隆方法,包括额外的限制措施消化和结扎,转换步骤之前。

积极转化株选择使用氯霉素作为选择抗生素的存在和在坐标系克隆GCSF通过限制消化pNWPH向量被证实。两个乐队,~ 3.3 kb pNWPH向量和~ 0.5 kb GCSF插入,可以看到在1%琼脂糖凝胶消化后的重组质粒心好和HindIII(图2(一个))。改变了枯草芽孢杆菌SCK6细胞生长在2 x L-Mal媒介120小时。细胞生长(OD_600年)(图记录2 (c))和分泌表达GCSF不同阶段进行分析的样本整除的文化上层清液(数字2 (b)和2 (d))。

当通过sds - page分析,文化浮在表面的改变枯草芽孢杆菌SCK6显示一个著名乐队~ 19 kDa的60小时的增长逐渐增加随着时间的流逝。最大的表达水平,对应~分泌蛋白总量的17%,达到72小时,96小时之前保持不变。之后,急剧下降在观察细胞生长合成的重组蛋白水平下降的文化上层清液(数字2 (c)和2 (d))。

3.2。净化rhGCSF

重组蛋白分泌到细胞外的培养基有利于早期下游加工。GCSF净化,文化上层清液澄清了离心沉淀和65 - 80%硫酸铵饱和度。虽然数量很少有沉淀在65%,最多可以恢复80%硫酸铵饱和度与纯度75%的水平(表2)。

收集到的分数与50 mM Tris-Cl透析去除铵盐和附近的部分纯化GCSF纯化同质性通过阴离子交换色谱FPLC节中描述2。感兴趣的蛋白质筛选了~ 0.3 M氯化钠梯度,第二峰的色谱图(图中所示3(一个))。纯度GCSF水平达到以下两个步骤的净化与最后一个~ 90%恢复96毫克每升文化的上层清液(表2)。

3.3。CD谱分析

CD光谱重组GCSF 20°C显示双重否定最小值在209和222海里(图3 (b))。二级结构的分析使用CDNN软件显示的57.8%α螺旋平行和反平行的4.2%和4.3%β表。这些典型的蛋白质二级结构值包含一个大的比例α螺旋结构和连贯性与商用GCSF准备。因为GCSF属于细胞因子超家族成员包含α螺旋和缺乏β表,我们重组GCSF中产生的数据支持枯草芽孢杆菌在适当的折叠构象。

3.4。生物活性评价

生物活性的重组,内部包含在一个评估在活的有机体内嗜中性白血球减少症的典范。老鼠,接受单剂量ifosfamine诱导中性粒细胞减少,有重组GCSF和中性粒细胞的百分比是监控数据4(一)和4 (b))。在两种途径的药物管理局检验在这项研究中,也就是说,腹腔和皮下,推出前交付路线被发现比后者更有效的路线(数据未显示)。

统计上显著的增加存在剂量依赖的相关性,中性粒细胞计数(值< 0.001)观察小鼠组处理内部产生GCSF。趋势是类似于我们观察到商用治疗组白细胞生成素(值< 0.001)。15岁μg / mL GCSF浓度,中性粒细胞数的增加50%,但进一步提高水平的60% GCSF注射剂量增加到40μ克/毫升(图4 (b))。总的来说,内部产生的影响GCSF和商用白细胞生成素准备两个治疗小鼠组在统计学上无法区分。

4所示。讨论

化疗,除了杀死癌细胞,经常破坏正常细胞快速分裂包括白细胞产生骨髓细胞。更明确地从白细胞,中性粒细胞,入侵的微生物防御中发挥核心作用,减少水平以应对化疗或骨髓移植的结果使身体更容易受到各种危及生命的感染和脓毒症(15,27]。GCSF的注射,糖化或nonglycosylated,因此建议,经美国食品和药物管理局批准用于治疗化疗所致嗜中性白血球减少症,骨髓移植引起的中性粒细胞减少,嗜中性白血球减少症与mylodysplatic综合症或再生障碍性贫血28]。除了在治疗嗜中性白血球减少症中的应用,包含已发现在治疗中枢神经系统疾病如脑缺血和中风,再生肝组织,等等16- - - - - -18]。因此,生物制药公司,重组第一代GCSF期满后,正在生产的新的生物活性GCSF生物仿制药品。

我们在目前的研究中,能够产生本土一样,生物活性形式的人类GCSF pNWPH-GCSF培养基使用组合的表达载体枯草芽孢杆菌SCK6主机系统。Multimeric克隆的方法,包括使用POE-PCR,选择了建筑的表达质粒pNWPH-GCSF(包含~ 0.5 kbGCSF基因下游的启动子)。这种技术,最初被你等。23),是相对较新的但很简单,并且具有成本效益,具有一定的优势传统的克隆策略,尤其是主机的直接转换限制消化和DNA结扎(没有额外的步骤22]。

在常见的表达宿主重组治疗性蛋白质的生产,即中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,人类胚胎肾细胞(HEK) 293,毕赤酵母属pastoris(29日- - - - - -32),而大肠杆菌,后者已经广泛用于生产GCSF高收益率高达15 mg / L shake-flask文化(14,33,34]。值得注意的是,包含的表达式大肠杆菌报道说,在几乎所有的研究中,肠易激综合症的形式,要求使用变性剂(强或轻度)溶解,然后切除变性剂重折叠的前提方案(31日,32]。

早些时候,我们克隆和表达了GCSF在大肠杆菌BL21 (DE3)细胞质水平对应~总数的35%大肠杆菌细胞蛋白但在IBs的形式。的方法用来改善GCSF的溶解度大肠杆菌转化株,转化细胞的生长低温第16 - 25 (°C),针对GCSF进入大肠杆菌周质通过附加pelB领袖序列的宠物系统,和coexpressionGCSF与结核分枝杆菌热休克蛋白(Hspx)(未发表的结果)会见了有限的成功。然而,使用枯草芽孢杆菌作为本研究导致增强表达宿主和分泌表达人类GCSF近3年来的收益率高于先前报道([33)和引用)。

SPywmC,强大的Sec-type肽之一枯草芽孢杆菌一般的分泌途径(Sec途径),用于分泌表达GCSF正如前面用于异种的酯酶的表达(35]。当生长在2 x-lmal营养丰富模型介质(36- - - - - -38),细胞生长逐渐增加到50个小时,之后达到高原。然而,GCSF分泌达到最高水平(17%)在72小时,也就是说,在细胞生长的固定相(数字2 (c)和2 (d))。这些结果是在良好的协议与模重组蛋白的分泌枯草芽孢杆菌先前报道(39]。分泌表达促进rhGCSF下游加工。用硫酸铵沉淀和单FPLC柱层析法,纯度> 90%水平的重组蛋白。纯化GCSF注入小鼠评估其生物活性显示类似的效应作为商用白细胞生成素,老鼠没有任何副作用。商用白细胞生成素准备的二级结构被用来证实rhGCSF圆二色性。高α螺旋内容显示典型的特征细胞因子(40]。总之,本研究首次报道的生物活性rhGCSF分泌表达枯草芽孢杆菌SCK6应变最小下游处理步骤和收益率远高于先前使用报道大肠杆菌基于表达系统(33]。

5。结论

总之,本研究首次报道的生物活性rhGCSF分泌表达枯草芽孢杆菌SCK6应变最小下游处理步骤和收益率远高于先前使用报道大肠杆菌表达系统。我们的结果表明,枯草芽孢杆菌SCK6,双重的下游加工方便,成本效益高产量生产外源蛋白(不需要诱导物),可以利用另一种表达系统GCSF仿生物药品的生产。

利益冲突

本文的作者声明没有利益冲突。

承认

本研究从巴基斯坦科学院提供资助巴基斯坦。

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