文摘
鲁兹锥体突然暴露在温度变化在它的生命周期。适应这些变化对疟原虫的生存至关重要,繁殖和传播。这些条件可能会改变蛋白质的基因表达的模式参与体内平衡的压力治疗。在目前的研究中,蛋白质组t . cruziepimastigotes受到热休克和epimastigotes增长通常是由二维凝胶电泳相比,其次是蛋白质质谱鉴定。确定了不同的丰富的24点。24的变化点,19显示更大的强度和五个低强度相对于控制。几个确定蛋白质测定的功能类别:新陈代谢、细胞防御,假想的蛋白质,蛋白质的命运,蛋白质合成、细胞运输和细胞周期。蛋白质参与与细胞环境的交互也发现,这些变化的影响进行了讨论。
1。介绍
恰加斯病的流行和被认为是一个主要卫生问题在许多拉美国家,据估计,大约有10 - 12几百万人在哪里受到这种情况的影响,造成每年15000人死亡(1,2]。这种疾病是由血鞭毛虫寄生虫引起的鲁兹锥体,一个复杂的生命周期,交替不同发展阶段(trypomastigotes epimastigotes,血液trypomastigotes和无鞭毛体)在两个不同的主机:昆虫向量(半翅类、家庭Reduviidae亚锥猎蝽亚科)和水库(许多脊椎动物(包括人)3]。因为digenetic生命周期的寄生虫,暴露于生长条件,无脊椎动物和脊椎动物宿主之间的显著差异,随着生理特征这两个东道主显然是异构的4]。这些差异中观察到温度、pH值、营养可用性、氧化还原电位,等等,每个代表一个细胞压力寄生虫(5,6]。此外,一旦在昆虫和脊椎动物寄生虫,它暴露在波动发生由于开关从细胞外到细胞内环境和宿主免疫反应(6]。在哺乳动物细胞中,这种寄生虫暴露在低pH值,随着时间的推移,由于parasitophorous泡酸化(7),以及自由基,这是防御机制的一部分,宿主细胞的发展(8]。消化管的昆虫向量,消化酶和溶血因素产生潜在的敌意环境寄生虫(9]。这些改变可能会导致细胞死亡,但是,像其他许多寄生虫,t . cruzi发展机制,允许它在波动的环境条件下生存和繁殖。这些适应性基因表达的改变调制由环境因素(6]。在t . cruzi压力的经历从一个宿主传播到另一个是通过接触温度突然变化,同时,在昆虫、寄生虫受到平均气温26°C,但是,一旦他们进入哺乳动物的主人,他们面临的高温37°C或更多,经历一个热休克10]。不致命的产生热休克时环境温度突然增加;它会导致特定的基因表达模式的改变和细胞功能的生物,产生细胞应激反应(11]。
在锥,所有蛋白质编码基因被组织成大型多顺反子转录单位(多个基因是由单个mRNA转录);因此,基因调控是控制的稳定性和/或特定mrna的翻译。此外,转译后的修改在调节蛋白质功能方面发挥重要作用[12]。因此,基因表达t . cruzi监管主要是在转录后的级别,像其他生物一样,有可怜的mRNA和蛋白表达水平之间的相关性。因此,蛋白质组学分析t . cruzi全球变化研究最重要的是在这种寄生虫基因表达在特定的生理条件。
描述的基因表达模式t . cruzi在压力条件下是至关重要的,因为细胞压力是寄生虫生命周期的一部分。期间重要的是识别哪些蛋白质是修改这个特殊现象为了更广泛地了解生物学的病原体。在这个时候,没有安全的化疗药物或有效的预防疫苗的寄生虫。识别潜在的治疗候选人,方法可用于研究大量的蛋白可能参与寄生虫生存后通过一个宿主传播到另一个。
在这项研究中,蛋白质组学分析t . cruzi寄生虫暴露在热休克。epimastigotes在正常生长条件下的蛋白质模式相比,该模式后热休克曝光,而且,第一次,24蛋白质之间有不同的丰度两个条件被确定。几组蛋白的重要角色,包括局部表面上。
2。材料和方法
2.1。寄生虫
t . cruzi应变Ninoa epimastigotes (MHOM / MX / 1994 / Ninoa) (13,14)经常保持在28°C肝灌注胰蛋白示(点燃)媒体补充10%胎牛血清和25μg / mL氯高铁血红素(13]。
2.2。热休克化验
文化是生长在25厘米2文化菜3×10的浓度6细胞/毫升的最后一卷10毫升新鲜点燃媒介。三天的孵化后28°C,这与指数增长阶段,当文化达到了25×10的密度6±5×106细胞/毫升,文化分为两个相等的部分。5毫升的文化是保持在28°C作为控制和其他5毫升受到突然的温度变化由孵化在37或42°C 3 h。对于每一个条件,在潜伏期后,文化被离心收获2500 g×10分钟在4°C和PBS洗了三次。最后,细胞的湿重按钮确定与蛋白分离之前。蛋白质提取之前,样品的固定和Giemsa-stained寄生虫。
2.3。蛋白质的提取
寄生虫的颗粒是resuspended裂解缓冲(7 M尿素,2 M硫脲,4%的皮套裤,0.0008 g / mL三羟甲基氨基甲烷(hydroxymethyl-aminomethane)液)和蛋白酶抑制剂(12毫米EDTA, 1毫米PMSF,抑肽素0.001毫米和0.1毫米亮抑酶肽)的比例3毫升裂解缓冲/ g的湿重。大力丸被搅拌3分钟,孵化在冰上和离心机离心10分钟12800 g×15分钟,然后是浮在表面的恢复(蛋白质提取)。蛋白质提取被保持在−70°C到使用,和蛋白质完整评估12% SDS-polyacrylamide凝胶电泳(页面)。蛋白质浓度测定使用2 d-quant工具包(Amersham生物科学),根据制造商的指示。
2.4。二维凝胶电泳(2 de)
等电点聚焦(IEF), 300整除μg蛋白的补液缓冲区(7 M尿素,2 M硫脲,4%的家伙,2% IPG缓冲区(pH值范围3 - 10),8毫克二硫苏糖醇(德勤),微量溴酚蓝)从控制或heat-shock-treated epimastigotes溶解产物应用于17厘米固定化pH梯度(IPG)凝胶贴片(Bio-Rad) 3 - 10的非线性(NL) pH值范围,为胶液样本补液,一夜之间。被集中在能源论坛千变万化的合作,细胞的蛋白质(Bio-Rad)使用以下协议:250 V, 20分钟,20°C;000 V, 2.5 h, 20°C;40 000 V / h、6 - 8 h, 20°C。在第二个维度之前,蛋白质减少(10毫克/毫升德勤)和烷基化碘乙酰胺(25毫克/毫升)平衡缓冲(6 M尿素,2% SDS, 0.05 Tris-HCl pH值8.8,30%的甘油,微量溴酚蓝)(15]。蛋白质分离在10% SDS - page凝胶使用二维垂直千变万化II XL系统(Bio-Rad)和标准三羟甲基氨基甲烷/甘氨酸/ SDS缓冲液与以下项目:16马,30分钟;24马,6 - 8 h。
2.5。凝胶染色法和图像分析
凝胶与硝酸银染色,根据以下协议:固定12 h在50%甲醇/ 10%乙醇;孵化1 h在5%甲醇/ 1%乙醇;在去离子水三洗5分钟;孵化0.02%硫代硫酸钠1.5分钟;三洗30年代在去离子水;与0.2%硝酸银染色40分钟;60年代的三个洗去离子水;可视化与发展中解决方案(6%的碳酸钠,0.05%甲醛、0.002%硫代硫酸钠);最后,添加6%乙酸(15]。观察到蛋白质π计算使用的图表Immobiline DryStrip pH值3 - 10问24厘米,pH值的函数距离20°C和8 M尿素(通用电气医疗集团)。根据蛋白质分子质量计算迁移距离(Rf)校准对银染色sds - page分子量标准混合物宽分子量标准(西格玛奥德里奇)。Silver-stained凝胶图像数字化使用Fluor-S多重图象(Bio-Rad)。使用一个2 d图像分析进行分析软件(Bio-Rad)。背景减法和噪音过滤后,斑点检测和量化。点测量的光学密度(OD),这是计算入射光强度除以的透射光强度和日志(基地10)的比率。OD值被分配到每个像素,每个OD的线性插值是用来表达量化。斑点显示改变至少1-fold强度之间的控制和heat-shock-treated样本(平均OD值控制/平均OD值热休克治疗)从三个凝胶复制被选为识别。
2.6。质谱分析
蛋白质提取物heat-shock-treatedt . cruzi的应变Ninoa受到2 d-page和银染色使用质谱的银吸附污渍工具包(皮尔斯),遵循制造商的指示。选定的地点从凝胶和手动切除被肽质量指纹(及)。短暂、蛋白质受到凝固态与胰蛋白酶消化(20 ng /μL)在一夜之间37°C。治疗后与碳酸氢铵,肽提取50%乙腈/ 5%甲酸和集中在真空中。生成的肽被纳入使用酸金属板α-cyano-4-hydroxycinnamico矩阵。肽混合物被电离的旅行者DE-PRO matrix-assisted激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)系统(美国应用生物系统公司)配备了氮在337 nm激光,和离子/ (m / z)或肽质量指纹。质谱是在反射模式和外部校准Sequazyme质量标准工具包(应用生物系统公司)。蛋白质被确定通过数据库搜索使用蛋白质的肽指纹勘探者数据库(http://prospector.ucsf.edu)和MS-Fit UniProt.2006.03.21 (http://www.pir.uniprot.org/),基于以下搜索参数:锥虫属物种的起源、π±0.1%,MW±2%宽容75 ppm,一个胰蛋白酶的乳沟小姐允许的,变量修改蛋氨酸(氧化),半胱氨酸(carbamidomethylation)和pyroglutamate形成肽的氨基端谷氨酰胺。
3所示。结果与讨论
在t . cruzi,热休克反应与热休克蛋白(休克)表达式4,10,16- - - - - -18),但其他蛋白质的身份参与这个过程并没有被报道。然而,由于生理变化在细胞受到热休克,预计一组不同的蛋白质和各种功能参与优化细胞的新陈代谢将被表达,热休克反应不会局限于生产的监护人(19- - - - - -21]。在这项研究中,我们发现,第一次点显示不同的丰度t . cruziepimastigotes受到热休克而控制寄生虫。这意味着这些斑点显示改变蛋白质的这种特殊形式的温度应力,表明热休克反应的潜在作用。在二维凝胶,我们可以衡量一个特定形式的一种蛋白质的数量在一个特定的生物情况和实验设置。我们观察的特殊形式的蛋白质可能结果,正如已经提到Jungblut等人于2008年,从成绩单无法区分基因,不容易区分的部分基因,或转译后的修改22]。
研究非杀伤性热休克反应t . cruziepimastigotes一直执行在不同生长温度从37到43°C (10]。反应观察在不同温度和不同的类型取决于应变。在以往的研究中,马拉凯应变暴露在42°C 4 h观察获得一个圆形4]。西尔维奥•X-10/4应变孵化温度相同的3 h没有显示这个变换(10]。德·卡瓦略et al。16)确定CL应变没有经典的应激反应在37°C。在另一项研究中使用t . cruziepimastigotes, HSP70的表达水平,大量增加的一个关键分子诱导热休克反应在许多生物体,只发生在42°C和3 h孵化后没有观察到相同的孵化时间后37岁或40°C (10]。在墨西哥,据报道,绝大多数的隔离分析属于离散输入单元(系统)的遗传组我,包括Ninoa应变,我们用于这项工作和一些相关的生物学特性的描述(13,14,23]。这是第一个研究执行热休克化验Ninoa应变,第一个目的是确定哪些温度适合热休克的生产。为此,两个非杀伤性的影响热休克温度测试的流动t . cruziepimastigotes,记住运动是一种间接参数的影响温度对寄生虫体内平衡。流动性的抑制曲线t . cruzi应变Ninoa孵化在37或42°C生成。如图1(一),实验温度37°C对寄生虫的流动没有任何影响,几乎保持不变而控制温度(28°C)。相比之下,孵化温度升高到42°C时,减少寄生虫的流动性被观察到,这是与时间有关的。同时,寄生虫在42°C显示轻微的形态变化3 h的孵化,他们中的一些人开始获得一个圆形(图1 (b))。基于先前的曲线和文献[10,16),寄生虫在42°C孵化3 h诱导热休克,导致约75%的移动速度和一些形态学变化。
(一)
(b)
蛋白质提取物控制和heat-shock-treated寄生虫受到二维凝胶电泳。图2显示二维凝胶代表三个独立的实验t . cruziepimastigotes的应变Ninoa控制在28°C (3 h)(图2(一个))和热休克(3 h 42°C)(图2 (b))条件下,与硝酸银染色。平均506±73点被发现在凝胶从寄生虫孵化28°C,而凝胶从heat-shock-treated寄生虫平均获得521±31点。蛋白质检测的数量相当于甚至高于先前报道Parodi-Talice等人,2004年的平均350点被发现使用蛋白质提取物epimastigotes pH值在同一范围内,运行在10%的聚丙烯酰胺凝胶,并与硝酸银染色(24]。蛋白质等电点的分布的分析(π)或分子量(MW)的条件下进行。摘录寄生虫在28°C或42°C显示一个正态分布的蛋白质建立基于π或兆瓦范围(数据未显示)。事实上,这两种情况都几乎相同的值分布;大部分的蛋白质有5.1 - -7.0π和31 - 70 kDa的分子量,以前报道的Parodi-Talice et al。24]。此外,正如前面是同一个作者的报道,大部分的蛋白质在酸性区域和局部,因此,解决低蛋白质的分离是在这一地区的凝胶比基本的区域(图2)。在不同的研究t . cruzi蛋白质组3 - 10的pH值范围内,有一个不断发现的酸性区域显示了低分辨率和蛋白质分子量高于90 kDa subrepresented [24,25]。可能的内在特点寄生虫蛋白质也参与这个特定的分布。
(一)
(b)
(c)
(d)
从控制和掌握凝胶heat-shock-treated寄生虫如图2 (c)和图2 (d)分别,其中包含所有的景点的凝胶中找到三个独立的实验。
然后,选择的蛋白质被女士,我们只考虑这些点之间有很多微分控制和实验条件(OD)的关系,始终在三个独立的实验中发现,在足够的浓度及鉴定。最终,我们获得的肽质量指纹为24点。分析的点表示女士的蛋白质组42°C(图2 (b)),每个数字对应表1列出,他们和他们的主要特征。十九24点对应于特定的蛋白质的价值三个独立实验的平均强度高于控制的地方,然而,在剩下的五个识别点,强度较低的热应力实验对控制斑点(表1)。这些点代表一个特定形式的鉴定蛋白质。
其他参数包括在表中1MOWSE得分,这是一个传统的测量验证肽被女士反映了匹配定位的理论和实验之间的质量决定,,最后,绝对的这场比赛是一个随机事件的概率。因此,得分最高的蛋白质是最可能的蛋白质(26]。覆盖率的百分比是指,候选人蛋白质序列的片段与生成的离子信号肽的质谱计。每个蛋白质的加入数字对应UniProt蛋白质条目。最后,丰富(折叠)的特殊形式相比,热休克蛋白相同的蛋白质在控制条件下的特殊形式计算。
24特定形式的识别蛋白质显示功能的变化,属于一些官能团的蛋白质被描述由热休克诱导许多生物体的蛋白质组学分析的方法。24特定形式的蛋白质识别是根据功能分为功能类别目录200427]。八个功能类别被分配和特定形式的蛋白质的比例确定,对应于每个类别确定:新陈代谢(25%)、细胞防御(16.66%),与细胞环境的交互(16.66%),假设的蛋白质(16.66%),蛋白质的命运(12.5%)、细胞运输(4.16%),蛋白质合成(4.16%),和细胞周期(4.16%)。六个特定形式的蛋白质有MOWSE得分低于67;因此,他们不是以后讨论。
特定形式的蛋白参与细胞代谢代表最大的集团,包括特定形式的蛋白质参与能源发电ATP酶和ATP合酶等。另一个酶被发现参与发电过程通过芳香族氨基酸的分解代谢,hydroxyacyl-alpha-L-aromatic脱氢酶(28]。同源蛋白质的丰度增加其他生物如细菌和植物在热应力下已确定在以前类似的蛋白质组学分析研究[19- - - - - -21]。在相同的功能类别的蛋白质,低强度的NAD / FAD-dependent脱氢酶,参与氧化磷酸化,热休克后观察。在小麦、减少观察ATP合酶的表达热休克后,这是表明这种酶会影响依赖资源过程中抵抗热冲击(19]。在t . cruzi,能源供应的下降也是一个营养的结果强调trypomastigotes [29日]。
有一些蛋白质组学研究,旨在研究病原生物体的细胞应激反应(30.];然而,有人建议,生理学和其他生物属性,包括致病性,受到环境的影响参数(31日]。其他特殊形式的蛋白质中确定本研究那些参与与手机的交互环境,其中包括一组特定形式的蛋白质发现寄生虫表面。有趣的是,在特定形式的表面蛋白显示增加强度由于压力治疗,一个mucin-associated表面蛋白(圣保罗)博物馆被发现,这是一个t . cruzi特殊蛋白质,直到最近未知函数(32),但最近,一位圣保罗与入侵过程([有关博物馆33从我们的实验室)]和未发表的数据。增加了大量的表面金属蛋白酶GP63也观察到,已经与毒性,宿主细胞的感染,和寄生虫表面蛋白的释放32]。附件的昆虫中肠被描述为一个至关重要的步骤,允许t . cruziepimastigotes继续他们的生命周期。对于这个过程,寄生虫表达不同的蛋白质,包括GP82和GP90表面糖蛋白,其外观寄生虫表面从epimastigotes伴随着形态分化成metacyclic形式(34]。也许热休克反应触发一个蛋白质表达模式非常相似,显示在trypomastigotes分化,感染性阶段,所显示Alcina et al。35]。为细菌,有人建议,毒力因素的合成受到的可用性营养,pH值、增长阶段,温度(30.]。
特定形式的蛋白参与细胞防御代表16.6%的特殊形式的蛋白质鉴定。HSP70和女伴DnaJ蛋白(HSP40)增加热休克后的强度。HSP70的增加(1.7倍),类似于以前类似的热应力实验报道了奥尔森et al。10观察),增长了2.5倍。这也支持一个真正的热休克反应诱导在我们的模型中。另外两个识别蛋白质,硫醇转移酶Tc-52 tryparedoxin过氧化物酶,已知参与应对氧化应激(36,37]。有报道称,热休克反应,生成氧化应激,这可能有几个原因。热应力后,许多蛋白质变性,包括抗氧化蛋白,导致活性氧的积累,有氧代谢的特点。它也表明,超氧化物的反应性增加温度(36,38]。
此外,一小部分的特定形式的蛋白质鉴定是蛋白质与蛋白质的命运,如修改和目的地。在真核细胞中,大多数的蛋白质在细胞核和细胞质中退化26 s蛋白酶体而非溶酶体,它是一个位于细胞质和核隔间multisubunit复杂。蛋白酶体蛋白水解途径控制各种细胞功能蛋白质的质量控制,其中包括突变或受损蛋白质的降解39]。Ubiquitin-conjugating酶E2执行第二步目标蛋白的泛素化反应通过蛋白酶体降解。为t . cruzi,蛋白酶体的一个重要的角色转换到不同的寄生虫阶段报告(40]。增加大量的蛋白酶体蛋白质在寄生虫metacyclogenesis和暴露于使用苄硝唑(41,42]。
特殊形式的蛋白参与细胞运输Rab6 GTPase——(guanosine-triphosphatase)激活的蛋白质,这是参与膜运输的规定t . brucei(43)被确认在这工作。还发现一种蛋白质逆转录转座子热点,与多态subtelomeric地区(44),在热应力的作用不能确定。
建议,尽管一些应激反应机制是高度保守的跨物种,其他人,像那些参与新陈代谢和细胞功能的优化或规定,不同生物有机体(21]。出于这个原因,我们将发现蛋白质和多种功能参与压力阻力。此外,的情况t . cruzi有大量的蛋白质与未知函数,这是更相关,因为潜在的这些蛋白可能参与这种寄生虫的生物学。的一些特殊形式的蛋白质识别在我们的研究已经发现在蛋白质组学研究的寄生虫受到不同的强调:营养压力,压力由接触使用苄硝唑和metacyclogenesis [41,42]。因此,我们建议一个收敛的耐药机制与其他压力,包括寄生虫转换从一个阶段到另一个。最后,因为增加的一些表面蛋白的丰度,这将是有趣的研究传染性寄生虫发生热应力之间存在确定的关系这反应和感染过程。
4所示。结论
总之,在这项研究中,t . cruziepimastigotes蛋白质组进行热休克了,特定形式的不同的蛋白质与不同的丰度及热休克后确定。据我们所知,这是第一次大量不同于热休克蛋白质被发现是不同的丰富的在热休克t . cruzi。
总的来说,这些发现所涉及的基本生理过程提供了新的视角t . cruzi热休克反应;这种反应对疟原虫的生存是至关重要的。
确认
作者感谢。马丁内斯和m . l . Martinez-Velasco技术援助。这项工作是支持格兰特DGAPA IN229209 PAPIIT,大学根据墨西哥(b·埃斯皮诺萨)。d . Perez-Morales和r . Martinez-Espinosa从CONACyT研究生的学生和奖学金,墨西哥。