提高抗体绑定活动主要组织相容性复合体类我Chain-Related基因通过噬菌体展示技术Cancer-Targeted疗法

文摘

主要组织相容性复合体类我chain-related基因(云母)是一个过度的NKG2D配体在细胞压力转换包括癌症和病毒感染。对癌症组织高表达的云母或病人的血清有助于癌症患者的预后或后续标记。在这项研究中,噬菌体展示技术是用来改善antigen-binding活动anti-MICA单克隆抗体(WW2G8, WW6B7, WW9B8)。12个氨基酸残基的互补决定区(CDRs) V域的重链CDR3上(HCDR3)这些anti-MICA抗体被PCR-random诱变改良,和噬菌体展示突变anti-MICA工厂被建造。七轮平移后,五个克隆噬菌体显示突变anti-MICA外事局3-7-folds展出高antigen-binding活动是孤立的。两个突变体的克隆(phage-displayed突变外事局WW9B8.1和phage-displayed突变Fab WW9B8.21)被证实antigen-binding通过流式细胞术对细胞表面特异性云母蛋白质。这些噬菌体克隆能够识别云母在原生形式根据间接ELISA阳性结果和流式细胞术。因此,这些噬菌体粒子可能会用于进一步开发的纳米专门针对癌细胞表达云母蛋白质。

1。介绍

在人类,NKG2D配体由两个家庭;MHC-class-I - chain-related蛋白质(云母和MICB) (1,2]和巨细胞病毒UL16-binding蛋白家族(ULBP1-6)或视黄酸早期记录1 (RAET1E G H,我N和RAET1L) (3,4)这是多态(5- - - - - -7]。信号通过NKG2D配体的接触需要适配器蛋白质在人类或DAP10/12 DAP10老鼠,细胞膜上形成一个hexameric复杂(8,9]。NKG2D配体主要是正常细胞不表达或表达特定的细胞在特定条件下处于非常低的水平,但调节细胞上的压力,如恶性肿瘤细胞或细菌/病毒感染细胞,并与自身免疫性疾病(10- - - - - -13]。因此,NKG2D配体的表达是重要的免疫反应(14,15]。

目前,单克隆抗体(mab)突破医学和有效的诊断产品,监控,和癌症的治疗,感染,和其他疾病。在癌症的情况下,许多种类的癌症细胞NKG2D配体表达,但他们可以逃避识别和破坏免疫系统的T细胞和NK细胞脱落的配体可溶性形式如可溶性麦克风。这些分子可以在病人的血液样本中发现。可溶性配体可以有效杀死肿瘤细胞的表达下调16]。麦克风脱落在癌症呈现麦克风的减少或低表达在细胞表面。因此,预测所需的高亲和力抗体与治疗癌症患者。

以前,我们已经生成几个单克隆抗体云母(17]。为了提高对云母绑定活动,这些抗体克隆并显示在丝状噬菌体在这项研究中。此外,在噬菌体抗体亲和力成熟的表达是由PCR-random诱变在互补决定区(CDRs) V域的重链CDR3上(HCDR3)。这一过程产生了克隆高anti-MICA活动特征。这些克隆高潜力开发靶向治疗对肿瘤细胞表达云母。

2。材料和方法

2.1。菌株

的大肠杆菌菌株XL1-Blue MRF′(Δ(mcrA)183年Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173年endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1虫胶[F′proAB ZΔM15Tn10()(美国Stratagene)用作phagemids的准备,主机由巴尔巴斯博士pComb3H-SS,请提供第三(18),作为辅助噬菌体的宿主,VCSM13(美国新泽西州通用电气医疗集团生物科学)。

2.2。质粒

pGEM-T简单向量(美国Promega)是用于克隆PCR产品,和pComb3H-SS phagemid向量用于工厂丝状噬菌体显示系统。

2.3。互补脱氧核糖核酸从Anti-MICA Monoclones

反- - - - - -云母monoclones;WW2G8、WW6B7 WW9B8以前生成的(17]。他们都与kappa IgG1链。提取总RNA和cDNA和合成低聚糖dT和随机六聚物引物根据制造商的指示使用RNA提取和互补脱氧核糖核酸合成工具(美国Promega)。这些互补脱氧核糖核酸样品用作进一步PCR扩增并克隆模板重型和轻型链phagemid, pComb3H-SS。

2.4。工厂的建设从Anti-MICA单克隆抗体

为了构建anti-MIC工厂,VH和六世的PCR基因放大cDNA anti-MIC monoclones (WW2G8, WW6B7, WW9B8)。重链反向引物;5′AGGCTTACTAGTACAATCCCTGGGCACAAT-3′(Spe我网站是下划线)和3重链可变正向引物;5′AGGTCCAGCTGCTCGA GTCTGG-3′, 5′AGGTCCAACTGCTCGAGTCTGG-3′, 5′gg TCCAACTGCTCGAGTCAGG-3′与Xho我网站强调被用来放大VH。kappa轻链反向引物;5′GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA-3′(Xba我网站是下划线)和5个轻链可变正向引物;5′CCAGTTCCGAGCTCGTGCTCACCCAGTCTCCA-3′, 5′CCAGTTCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCCA-3′, 5′CCAGATGTGAGCTCGTGATGACCCAGACTCCA-3′, 5′CCAGATGTGAGCTCGTCATGACCCAGTCTCCA-3′, 5′CCAGTTCCGAGCTCGTGATGACACAGTCTCCA-3′与囊我网站强调被用来放大六世的基因。结果PCR产品第一只克隆成pGEM-T简单向量,然后pComb3H-SS phagemid向量与重链作为融合分子机器(18]。克隆和噬菌体救援之后,所有克隆与云母,biopan和间接ELISA检测绑定(在下面描述)。直接测序的噬菌体克隆获得重和轻链序列是由1号基地实验室Sdn Bhd .、马来西亚、使用pComb3H-SS特定引物:pC3HSS2575s(六世):5′AAGACAGCTATCGCGATTGCAG3′(19),pelseq (VH): 5′ACCTATTGCCTACGGCAGCCG 3′和pComb3H-SS-specific反向引物:kpel(六世):5′CGGCTGCCGTAGGCAATAGGT 3′, gback (VH): 5′GCCCCCTTATTAGCGTTTGCCATC测序引物。分析了序列使用爆炸(IMGT,国际免疫遗传学信息系统http://www.imgt.org/)。

2.5。建设Phage-Displayed外事局HCDR3突变体

PCR-random诱变进行修改互补决定区(CDRs) V域的重链CDR3上(HCDR3)克隆使用诱变引物(表1)如前所述20.),和突变Fab噬菌体显示被重建。这些引物设计从克隆通过直接测序验证随机HCDR3地区12个氨基酸残基的anti-MICA抗体通过避免停止密码子。

2.6。生产of-Anti-MICA工厂显示和Anti-MICA-HCDR3突变外事局噬菌体显示

生产工厂噬菌体显示,XL-1Blue细胞窝藏phagemids增长到600年的50毫升的OD包含50磅肉汤培养基μg / mL羧苄青霉素(碳水化合物)和10μg / mL四环素(春节)和孵化在37°C在瓶。后,10¹²空斑形成单位(pfu)辅助噬菌体,VCSM13,被添加到文化和孵化为2小时37°C。后,70年μg / mL卡那霉素是添加到文化和孵化瓶一夜之间在37°C。15分钟在4000转离心后,上清液携带噬菌体被转移到一个干净的瓶子里,4% (w / v) peg - 8000和3% (w / v)添加了生理盐水,然后,放在瓶5分钟溶解和沉淀噬菌体在冰上30分钟。噬菌体粒子被孤立在9000转离心20分钟在4°C丢弃上层清液,让瓶子消耗纸巾10分钟去除尽可能多的解决方案挂钩。球,然后,在TBS resuspended / 1% BSA,解决方案是在14000转离心5分钟。离心后得到的上层清液包含anti-MIC外事局噬菌体显示储存在4°C到使用。

2.7。选择Phage-Displayed工厂和Phage-Displayed工厂HCDR3突变体对云母,biopan

准备一个ELISA板涂有云母抗原如前所述[17使用10μ5克,μg和0.5μg第一、第二和第三个平移,分别在涂料缓冲区(碳酸氢盐pH值9.6)一夜之间在4°C。涂层也可以进行1小时的37°C。然后,TBS的盘子洗2次/ 0.5%渐变(TBST)和被井完全填满5%脱脂牛奶在TBS 1小时在室温下(RT)。包含10后,phage-displayed工厂暂停¹²空斑形成单位共有100个μL是添加到每个在RT和孵化2小时,然后飘散的噬菌体被移除,盘子洗了TBS / 0.5%渐变(TBST)上下大力吸量,等待5分钟前删除TBST。在第一轮,飘散的噬菌体被移除后,然后用TBST板是洗一次。在第二轮盘子洗了5次,十倍在第三和随后的回合。亲和力成熟,,biopan十轮。通过添加50个噬菌体筛选了绑定μL洗脱缓冲(0.1 M盐酸与甘氨酸调整pH值2.2与BSA 1毫克/毫升)每10分钟RT孵化,移液上下大力紧随其后。3洗出液取出来中和μ每50 L 2 M Tris-baseμL洗出液(18]。

2.8。对噬菌体展示Anti-MICA工厂间接ELISA和流式细胞术

2.8.1发布。间接ELISA

ELISA井涂以可溶性云母抗原(5μ10 g)孵化了⁸或10¹²空斑形成单位噬菌体展示anti-MICA Fab悬挂在100μL为2小时沿三个洗TBST,绑定噬菌体是沾1:5000稀释辣根peroxidase-conjugated鼠标anti-M13单克隆抗体(美国新泽西州通用电气医疗集团生物科学)1小时在RT三洗紧随其后。结合噬菌体检测使用3,3′,5、5′-tetramethylbenzidine(三甲)(KPL,马里兰州)和测量光密度吸光度(OD),决定在450海里。

2.8.2。流式细胞术

293 t细胞(100细胞)表达云母孵化了μL的噬菌体展示anti-MICA工厂暂停(10¹¹空斑形成单位)1小时在冰上。细胞用1%牛血清白蛋白在1 xpbs沾5μL(异硫氰酸荧光素(FITC)标记anti-M13噬菌体衣壳G8P抗体(美国ABIN125966很多# 109131 antibodies-online GmbH)对冰1小时,其次是1 x用1%牛血清白蛋白在1 xpbs。细胞结合phage-displayed anti-MICA工厂被BD流式细胞仪分析第二章(美国BD)。293 t细胞(细胞)与VCSM13负控制孵化。

3所示。结果和讨论

3.1。工厂的建设从Anti-MICA Monoclones

VH和六世anti-MICA monoclones (WW2G8、WW6B7 WW9B8)被PCR克隆成pComb3H-SS放大。重型和轻型链片段是大约660个基点(图1)。这些克隆变成了大肠杆菌(Xl-1blue)标准热休克方法,辅助M13噬菌体所救,孤立,biopan对云母抗原。验证了这些克隆ELISA以确保他们携带Fab绑定云母。CDR3上序列来自WW2G8、WW6B7 WW9B8图所示2。CDR3上突变引物(表1根据这些序列)的设计。最后,这些克隆被用作模板HCDR3诱变。

3.2。亲和力成熟的噬菌体展示Anti-MICA绑定活动

十轮,biopan进行选择积极的噬菌体对云母与增加绑定活动。噬菌体Antigen-binding活动从第三到十轮平移被间接ELISA分析,显示绑定的浓缩活动表示更大的OD在平移周期。阳性克隆高活动明显成为主流的第七轮选择(图3)。显然,进一步轮,biopan没有多增加绑定活动。六十一克隆噬菌体展示抗体变异anti-MICA (WW9B8、WW6B7 WW2G8)被随机选择从池中噬菌体的第七轮选择和间接ELISA检测他们的云母绑定活动。其中,我们五个克隆3-7-folds展出获得更高antigen-binding活动表示OD(噬菌体展示突变Fab WW2G8.2,噬菌体展示突变Fab WW2G8.13,噬菌体展示突变Fab WW6B7.12,噬菌体展示突变Fab WW9B8.1,和噬菌体展示突变Fab WW9B8.21)(图4)。噬菌体展示工厂的比较活动WW9B8,噬菌体展示突变Fab WW9B8.1,噬菌体展示突变外事局WW9B8.21也由流式细胞术使用293 t细胞表达云母。所有三个噬菌体克隆可以检测云母蛋白质293 t。噬菌体展示突变Fab WW9B8.1和噬菌体展示活动对云母蛋白质突变Fab WW9B8.21已经高于原噬菌体展示工厂WW9B8(图5由间接ELISA)对应于他们的活动。这两个克隆噬菌体克隆OD的最高5孤立。

4所示。讨论

传统的杂种细胞的抗体生产方法是费时和费力。以前,我们还发现了一些单克隆抗体麦克风(17]。抗癌药物直接结合的抗体并不那么有效,只有数量有限的药物分子可以结合导致较低的药物载体。为了产生MICA-targeted抗癌药物,单克隆抗体云母在丝状噬菌体克隆并显示。与抗体药物共轭,大量的抗癌药物可以很容易地结合的化学连接pVIII存在2700册每一个噬菌体粒子(major-phage-coated蛋白质21]。Anticancer-drug-conjugated噬菌体已经被成功运用的电位器因素超过1000相比,免费药物(22]。噬菌体作为靶向药物载体的研究大多是在体外。的在活的有机体内研究只在一个小鼠模型(23]。免疫原性噬菌体的药品管理局将是一个挑战,需要进一步在活的有机体内研究中,特别是在人类。

NKG2D受体和配体的作用与癌症的免疫反应是建立和开发作为癌症的免疫治疗的方法。这些包括anti-MICA刺激抗肿瘤细胞毒性的感应24),治疗性dna疫苗NKG2D配体肿瘤抗原(25),T细胞的生成和嵌合NKG2D受体直接由配体激活参与(26,27]。然而,该方法采用药物共轭anti-NKG2D配体没有被报道。

显然,噬菌体展示的原有anti-MICA活动减少了检测云母单克隆抗体相比(图5)。已经表明,突变的HCDR3抗体可以改善结合活性和特异性抗体(21]。因此,我们执行在体外亲和力成熟的随机变异CDR3上是antigen-binding域之一,选择较高的噬菌体通过几轮,biopan活动。根据我们的数据,至少七轮的选择需要极大的提高。通常情况下,在其他研究的平移了只有3 - 5轮(18,28)导致一些积极的抗体克隆。额外的10轮轮平移不增加集体OD。61个体变异的克隆,克隆我们只获得5(8.19%),高绑定活动。两个突变克隆与最高的活动在流式细胞仪(图的特征5)和测序(数据没有显示)。这些噬菌体克隆能够识别云母在原生形式根据取得的积极成果间接ELISA和流式细胞术。进一步描述活动克隆高,竞争ELISA将被执行以及测试对等位基因的云母蛋白质来确定这些克隆是否有任何限制在检测不同云母等位基因。

总之,噬菌体展示技术是一种有效的方法来生成和隔离高亲和力的单克隆抗体特定的抗原。噬菌体展示anti-MICA高绑定活动已建立。通过结合抗癌药物如阿霉素或研究者用,这些试剂会有很高的潜在开发靶向治疗对肿瘤细胞表达云母蛋白质。

确认

这项工作是支持的高等教育研究推广和泰国国家研究型大学项目办公室的高等教育委员会,通过特定的健康问题的卓越中心的大湄公河次区域集群(SHeP-GMS),项目没有。NRU 542022和医疗诊断实验室的研究和发展中心(CMDL),孔敬大学(KKU)。a . Phumyen持有博士学位奖学金(h - 2533 -博士- 04)支持通过SHeP-GMS KKU。

引用

1. c . Leelayuwat特区汤恩说他m . A . Degli-Esposti l . j·亚伯拉罕和r·l·道金斯”一个新的多态和multicopy MHC基因与类相同我的家人,”免疫遗传学,40卷,不。5,339 - 351年,1994页。视图:谷歌学术搜索
2. 美国瓦m . Bresnahan d·e·格拉提神和t .间谍,”第二个哺乳动物的主要组织相容性复合体类的血统基因,”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷91,不。14日,第6263 - 6259页,1994年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. d . Cosman j . Mullberg c·l·萨瑟兰et al .,“ULBPs,小说类MHC我跟分子,结合巨细胞病毒糖蛋白UL16通过NKG2D受体刺激NK细胞毒性,”免疫力,14卷,不。2、123 - 133年,2001页。视图:谷歌学术搜索
4. m . Radosavljevic b . Cuillerier m·j·威尔逊et al。”一个集群的十类小说MHC我相关基因对人类染色体6 q24.2-q25.3,”基因组学,卷79,不。1,第123 - 114页,2001。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. a . v . Romphruk t . k . Naruse a Romphruk et al .,“多样性的云母(PERB11.1)和HLA单在泰国东北部,”组织抗原,卷。58岁的没有。2、83 - 89年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. a . v . Romphruk a . Romphruk t . k . Naruse et al .,“NKG2D配基的多态性:多样化RAET1 / ULBP基因在泰国东北部,”免疫遗传学,卷61,不。9日,第617 - 611页,2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. s . Rareongjai a . Romphruk a . v . Romphruk a . Sakuntabhai和c . Leelayuwat”在泰国多态RAET1基因的连锁不平衡,”组织抗原,卷76,不。3、230 - 235年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. j . Wu, y的歌,a . b . h . et al .,他“一个激活immunoreceptor复杂由NKG2D DAP10,”科学,卷285,不。5428年,第732 - 730页,1999年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. m . s . Gilfillan e . m . Ho内堂,w . m .横滨和m .报摊”NKG2D recriuts两个截然不同的适配器来触发NK细胞活化和聚集有关,”自然免疫学,3卷,不。12日,第1155 - 1150页,2002年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. 诉Groh r . Rhinehart h . Secrist鲍尔,k . h . Grabstein和t间谍”,由tumor-derived明显的肿瘤相关表达和识别γδT细胞的云母和MICB”,美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷96,不。12日,第6884 - 6879页,1999年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. 诉Groh r . Rhinehart j . Randolph-Habecker m . s . Topp s r·里德尔和t .间谍,”CD8的聚集有关αβ由麦克风诱导T细胞NKG2D通过接触感染病毒的细胞,”自然免疫学,卷2,不。3、255 - 260年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. 诉Groh h . Das, c . Kuijl et al ., "云母接触人类Vγ2 vδ2 T细胞增强其antigen-dependent效应器功能”,免疫力,15卷,不。1,第93 - 83页,2001。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. m . Champsaur l·l·尼尔,“NKG2D配体表达对宿主免疫反应的影响,“免疫学检查,卷235,不。1,第285 - 267页,2010。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. s . j·伯吉斯k . Maasho m . Masilamani s Narayanan f·博雷戈,和j·e . Coligan”NKG2D受体:免疫生物学和临床意义。”免疫研究,40卷,不。1、18 - 34岁的2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. r·a·鹰和j . Trowsdale“滥交和单一受体NKG2D,”自然评论免疫学,7卷,不。9日,第744 - 737页,2007年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. 诉Groh, j .吴绮,t .间谍,“肿瘤提取可溶性麦克风配体损害NKG2D的表达和激活t细胞,”自然,卷419,不。6908年,第738 - 734页,2002年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. w·Wongsena g . Sconocchia h·s·曹et al .,“生产和鉴定单克隆抗体主要组织相容性复合体类我chain-related基因,”组织抗原,卷72,不。5,431 - 440年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. c·f·巴尔巴斯III”,在噬菌体展示最新进展,”当前生物技术的观点,4卷,不。5,526 - 530年,1993页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. k .陪审团p . Sohnlein m·沃格尔和w·里希特,“隔离和功能描述重组GAD65自身抗体通过免疫球蛋白曲目克隆是从1型糖尿病患者,”糖尿病,50卷,不。9日,第1982 - 1976页,2001年。视图:谷歌学术搜索
20. a . Jumnainsong p . Jearanaikoon s Khahmahpahte et al .,”协会与宫颈癌在泰国东北部MICB:主要组织相容性复合体的识别类我chain-related基因B图案影响自然杀手细胞激活,“临床和实验免疫学,卷153,不。2、205 - 213年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. s . a .工头m . Tsuboi和g·j·托马斯Jr .)“亚基取向的丝状病毒Ff (fd, f1, M13)”分子生物学杂志,卷259,不。3、331 - 336年,1996页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. h .酒吧,即Yacoby, i Benhar“杀死癌细胞的靶向drug-carrying噬菌体纳米药物”,BMC生物技术第三十七条,卷。8日,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. l·卡拉,i Benhar。”在活的有机体内的特点有针对性的drug-carrying丝状噬菌体纳米药物。”《纳米生物第五十八条,卷。9日,2011年。视图:谷歌学术搜索
24. m . Jinushi f·s·Hodi, g . Dranoff”治疗导致MHC类我chain-related蛋白质抗体对抗免疫抑制和刺激抗肿瘤细胞毒性,”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷103,不。24日,第9195 - 9190页,2006年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. h . y .罗,j . f . Lo et al .,“激活先天和适应性抗肿瘤dna疫苗免疫通过NKG2D受体、”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷102,不。31日,第10851 - 10846页,2005年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. a . T . Zhang理发师,c . l . Sentman”一代的转基因抗肿瘤反应的主要人类T细胞NKG2D受体嵌合,”癌症研究,卷66,不。11日,第5933 - 5927页,2006年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. 答:理发师,t·张,c . l . Sentman“免疫疗法与NKG2D受体嵌合导致长期患肿瘤生存和发展宿主抗肿瘤免疫的小鼠卵巢癌症,”《免疫学,卷180,不。1,第78 - 72页,2008。视图:谷歌学术搜索
28. g·h·杨,s . o . Yoon m . h .张成泽和h . j .香港“亲和力成熟的anti-hepatitis B病毒PreS1人源化抗体通过噬菌体展示,”《微生物学,45卷,不。6,528 - 533年,2007页。视图:谷歌学术搜索

版权

版权©2012 Achara Phumyen等。这是一个开放的分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。