文摘
两个遗传和环境交互影响系统性红斑狼疮(SLE)开发和发病机理。一个已知的遗传因素与红斑狼疮是一种单体型的干扰素调节因子5 (IRF5)基因。全球基因表达微阵列数据分析使用基因集富集分析确定多个干扰素和炎症相关的基因集单体型与细胞明显的过多风险。通路分析利用重要基因的表达基因集的影响IRF5风险单体型与干扰素通路显著相关,证实toll样受体通路,b细胞受体途径。系统性红斑狼疮患者的IRF5风险单体型已经加剧了干扰素签名,甚至在如果状态(),而患者IRF5保护单体型的B细胞干扰素的签名类似控制。这些结果确定多个基因功能IRF5基因型影响的重要途径。他们还建立IRF5风险单体型不仅干扰素反应的关键因素,也是其他b细胞通路参与系统性红斑狼疮。
1。介绍
系统性红斑狼疮是一种复杂的疾病多因子的病因和发病机理。对同卵双胞胎的研究表明,和谐狼疮大约是40%,表明强烈的但不是独家遗传因素(1,2]。最近的基因分析已经确定了三十多个候选基因与狼疮相关风险(3- - - - - -18]。IRF5被发现与红斑狼疮相关多个独立团体在不同的人群(10,13- - - - - -15,19,20.]。IRF5风险单体型可能函数在环境风险的十字路口,如病毒感染和细胞免疫反应。至少三个多态性IRF5已确定独立贡献狼疮的风险,共同构成了狼疮风险单体型10,21]。虽然大多数的多态性与狼疮nontranslated地区,他们可能影响的几个方面IRF5活动,包括拼接、RNA稳定,转录因子结合,细胞凋亡9,10,15,21,22]。
IRF5是重要的生产和应对干扰素α(干扰素吗α在狼疮),这是加剧。干扰素α是由树突细胞、巨噬细胞、B细胞和其他细胞类型,主要是为了应对病毒感染(23,24]。树突细胞已被证明产生干扰素α为了应对孵化与免疫complex-containing从系统性红斑狼疮患者血清25),尤其是患者的风险单体型IRF5(19]。此外,血清干扰素水平,以及干扰素反应签名,增加患者的风险单体型(19,26]。IRF5是一个特别有趣的候选人狼疮的遗传风险因素,因为它的作用通路控制的许多细胞和免疫反应的环境因素,如感染,这可能导致狼疮。
一个公认的环境与风险密切相关的代理狼疮是eb病毒(EBV)感染。狼疮之前已经与EBV感染在儿童和成人人口(27- - - - - -33]。EBV表达抗原与明显的红斑狼疮等自身抗原免疫交叉反应的Sm和nRNP34- - - - - -39]。然而,由于超过95%的成年人感染EBV,确定为什么EBV可能导致狼疮在某些人而不是其他人已被证明具有挑战性。的识别IRF5和其他遗传风险因子为狼疮开放的可能性lupus-associated遗传多态性在一个或多个这些基因工程与环境因素在增加观察红斑狼疮的发病风险。先前的工作表明,小儿狼疮患者已经扩大,更可交叉反应的体液免疫反应比控制(EBV40]。EBV也不是控制在狼疮患者在控制,病毒载量的增加和改变t细胞反应(41,42]。不同的病毒感染或遗传因素赋予的应对病毒感染等IRF5多态性可能部分解释这些观察。
由于B细胞的主要宿主细胞EBV感染,我们使用B细胞和EBV交互模型研究的影响IRF5基因型对下游b细胞反应。在这项研究中,我们研究了B细胞基因表达差异从个人与天真的B细胞IRF5风险单体型和保护或中性单基础水平和接触EBV之后。天真的B细胞被选择,因为他们是EBV建立潜伏感染的细胞类型(43]。我们发现多个网络的基因丰富的微分表达式,以及个体的基因表达差异。最重要的是,我们发现在狼疮患者不同干扰素反应基因的表达模式的基础上IRF5风险单体型。了解这些差异将会帮助确定通过赋予的遗传风险的机制IRF5风险单体型是体现。
2。材料和方法
2.1。研究参与者
基因型是以前收集的样本来自俄克拉荷马风湿性疾病核心资源中心(ORDRCC)在俄克拉荷马州医学研究基金会。以前注册受试者研究参与基于他们的联系IRF5使用单核苷酸多态性基因型风险和保护单体型rs2004640 rs10954213。五IRF5高风险(3控制,2例)和五个IRF5nonrisk(2控制,3例)性别和种族——匹配个人招募。这个研究机构审查委员会批准在OMRF OUHSC,和知情同意了所有科目的学习。
2.2。b细胞刺激
外周血单核细胞的密度梯度离心法分离外周血的志愿者。天真的B细胞分离使用mac天真的B细胞隔离设备II (Miltenyi研究公司)。没有天真的B细胞在孵化1:1 (v / v)比例与传染媒介或感染EBV 16小时。病毒制剂B95-8细胞培养上清液的形式。相同的上层清液制备用于所有化验。
2.3。基因表达分析
总细胞信使rna从感染和mock-infected细胞溶解产物纯化使用Ambion RNaqueous-Micro工具包(美国应用生物系统公司、奥斯汀、TX)根据制造商的协议和量化使用NanoDrop分光光度计(NanoDrop Technologies, Inc .)。cRNA放大,用生物素标记进行使用Illumina公司TotalPrep RNA扩增设备协议(美国Ambion、奥斯汀、TX)整除200 ng的总RNA。全基因组表达分析使用Illumina公司HumanRef-8 v。3gene expression chip (24,526 transcripts) following the Illumina Whole-Genome Expression Protocol.
2.4。统计和路径分析
微阵列数据分析了使用基因集富集分析和路径分析探讨基因网络的变化。这些分析是紧随其后的是比较个人的基因表达差异在这些网络。原始表达数据首次规范化使用MDAT工具箱(44]。基因集富集分析软件(分子特征数据库)是用来确定一个先天的功能定义的一组基因显示统计学意义,整合两个表型差异(IRF5风险和nonrisk单)45,46]。显著的基因集富集得分被确定,它反映一组基因的程度是过多的排名列表的顶部或底部的基因,和一个错误发现率(罗斯福)< 25%。我们关注我们的后续路径分析的子集丰富基因(从统计上显著的基因集。
生成路径分析是通过使用创新路径分析(智慧系统,http://www.ingenuity.com/)。一个数据集包含基因标识符和值在应用程序上传到相应的表达式。每个基因标识符映射到相应的聪明才智通路中的基因对象的知识库。输入表达式值的标准化日志(强度)值IRF5分别nonrisk和风险单体型的人。
规范化路径分析发现创造力通路的通路分析图书馆最重要的规范途径的数据集。数据集之间的关系的意义和规范化路径测量在两个方面:(1)的基因数量的比例从数据集映射到路径除以总数量的基因映射到规范的途径;(2)确切概率法用于计算值确定的概率之间的关系的基因数据集和规范化途径是解释的机会。支持所有关联的至少一个参考文献,从课本或规范的信息存储在独创性通路的知识库。人类和小鼠直接同源基因的聪明才智通路知识库中存储作为单独的对象,但网络中被表示为一个节点。热量地图创建与前面提到的表达式值Spotfire软件。
3所示。结果
3.1。浓缩IRF5 Lupus-Related基因集的风险单体型
使用现有的基因单核苷酸多态性rs2004640数据(T:风险,G:保护)和rs10954213 (一个:风险,G:保护)10,11,20.,21,47)风险的频率、保护和中立IRF5单在1390年研究系统性红斑狼疮患者和2039名对照参加欧洲美国女性群体的(EA)从狼疮系统性红斑狼疮患者家庭Registry and Repository (LFRR:http://lupus.omrf.org/)。显著富集的风险和风险中性单在狼疮患者被发现((表),如预期1)。使用这些结果,五个人风险或风险中性单和防护或protective-neutral单是从当地招募系统性红斑狼疮集合通过ORDRCC深造。其中包括两个系统性红斑狼疮患者和三个控制风险组,和三个系统性红斑狼疮患者和两个控制保护和protective-neutral单体型。为控制风险集团丰富,这样的影响IRF5单可以更好地研究缺乏潜在的混杂遗传影响或红斑狼疮相关因素。
总之,368个基因被发现显著()风险和nonrisk个体之间的差异表达。基因集富集分析被用来寻找基因通路过多当比较表达的数据风险单体型和保护单体型表型组或对照组分别。这种分析研究6769先天的定义功能基因集(46,48]。影响控制风险单体型,9基因集富集与错误发现率(罗斯福)< 25%(表2),19富含名义值< 0.01,但罗斯福> 25%(补充表2网上在doi: 10.1155 / 2011/594056)。红斑狼疮患者的风险基因单体型五集丰富罗斯福< 25%。然而,四个不同版本的α干扰素基因集。第五是lupus-related干扰素反应签名(表2)。七个基因集富集的名义值< 0.01,但罗斯福> 25%,系统性红斑狼疮风险单体型细胞,包括toll样受体(TLR)基因(补充表1)。
更少的基因集是高纯度的单体型保护细胞。没有显著的基因集富集在罗斯福水平< 25%,影响控制或红斑狼疮患者保护单体型。然而,基因集富集在39保护单体型的系统性红斑狼疮患者和35个基因集富集在水平的控制保护单体型(补充表3和图4)。
3.2。识别Lupus-Related通路不同影响IRF5单体型
基因从上述基因集富集也展示了不同的表达式在前面分析包含在一个全球通路分析使用创新路径分析系统。这种分析使用策划创新知识库将基因和表达数据集与建立基因通路。确切概率法被用来量化的程度与这些途径。当细胞与风险单体型(刺激和如果)没有什么单体型相比,三个规范通路被发现有统计学意义((图)协会:干扰素1),toll样受体(图2),b细胞受体(图3)的途径。有趣的是,所有这三个途径对红斑狼疮有显著的影响。这三个规范路径和相对变化表达式EBV曝光后在图表示1- - - - - -3和表3。
(一)
(b)
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(b)
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3.3。识别个体的基因差异表达IRF5单体型
几个干扰素通路中的基因表现出微分表达式之间的风险和保护单或EBV暴露和未曝光的条件。基因与微分表达式选择基于包含通路显著相关,平均一个条件表达式的值至少30,和微分表达式至少1.5倍。微分表达式进行比较,如果和EBV-infected州(表3)。几个基因差异表达干扰素通路,包括干扰素诱导的跨膜蛋白1 (IFITIM1),传感器信号和转录激活1 (STAT1)、干扰素α受体2 (IFNAR2),2′5′-oligoadenylate合成酶1 (OAS1),mx₁。这些基因的表达模式变化的基础上IRF5单体型和EBV感染状态(图1)。
IFITM1更强烈的表达在细胞比nonrisk风险如果条件差异(2.1倍)。细胞暴露于EBV时,这种差异消失了,结果是一个更大的表达式(4.8倍)增加nonrisk细胞比风险(2.8倍)。STAT1略underexpressed风险细胞比之前nonrisk EBV暴露(1.3倍),但在EBV暴露在风险细胞高表达(1.3倍)。IFNAR2采取相反的态度;表达风险更高的细胞如果条件(1.7倍),但高nonrisk细胞后EBV感染(1.3倍)。IFNAR2是一种干扰素受体,直接有助于应对干扰素,让这个基因非常有趣的上下文中的干扰素调控和响应能力。OAS1在风险中细胞相比nonrisk细胞如果和EBV-exposed条件(1.5倍和2.2倍,分别地。),是吗mx₁(1.6——1.8倍)。
TLR通路还包含一些基因差异表达之间的风险和保护haplotype-containing细胞(图2)。安全系数和骨髓分化主要响应基因88 (MyD88)都是在表达的细胞相比,如果风险nonrisk(2.2和1.8倍,分别地。)。这两个基因开关之前从细胞中表达下调风险EBV EBV曝光后风险暴露在调节细胞(1.3和1.2倍,分别地。)。另一个非常有趣的TLR通路中的差异表达基因是肿瘤坏死因子全身的蛋白3 (TNFAIP3)。所表达的是在1.3倍风险细胞静息状态。EBV曝光后,表达更不平衡,与1.9倍风险表达细胞。感兴趣的基因细胞中过表达的风险没有EBV暴露包括TLR通路CD14(3.2倍),淋巴细胞抗原96 (LY96,或MD-2)(2.3倍)TLR1(1.7倍)。
b细胞受体(BCR)通路基因表达的差异由于展出IRF5风险单体型(图3)。
CD79A和CD79B一起构成BCR的一部分,都是表达下调2.2倍的风险未感染的细胞,但这种差异EBV感染后消失。Ras-related C3肉毒杆菌毒素基质1 (RAC1),一个基因参与淋巴细胞分化和生存49),在风险中细胞在所有情况下(在模拟感染细胞,1.5倍1.7倍EBV感染细胞)。信号蛋白的表达AKT1和转录因子NFκB2与EBV感染细胞表达下调吗IRF5风险单体型(1.9和3.4倍,分别地。)。在其他三个基因,磷脂酰肌醇3激酶催化亚基α(PIK3CA),核转录因子激活T细胞5 (NFAT5),糖原合成酶激酶3β(GSK3B),单体型有1.5 - 1.8倍的风险增加的表情。然而,当EBV在场,风险单体型显示减少的1.6 - 1.9倍的相同的基因。
3.4。干扰素反应患者签名取决于单体型
狼疮患者外周血的干扰素反应加剧签名(50- - - - - -52]。这个签名是可遗传的,是相关的IRF5风险单体型19,26]。当我们检查基因中干扰素反应签名,我们发现一个有趣的联系IRF5风险单体型。细胞从风险的系统性红斑狼疮患者单体型有干扰素反应签名在所有情况下,是否暴露于EBV。然而,从系统性红斑狼疮患者的细胞保护单体型不表现出一种干扰素签名没有EBV感染。干扰素应答的差异表达基因之间如果病人风险,如果患者保护性细胞是统计学意义()(图4)。风险单体型细胞来源于控制个人没有提高基线干扰素反应基因的表达。EBV暴露后,这些细胞产生干扰素反应签名是类似于基线和EBV-infected risk-haplotype狼疮病人。有趣的是,保护患者单体型没有出现强烈的干扰素反应签名即使暴露在EBV,指示IRF5保护单体型抑制干扰素的响应相比风险单体型(图4)。
(一)患者
(b) IRF5风险单体型
4所示。讨论
的IRF5基因与患狼疮有关。这些发现表明,lupus-associated多态性IRF5基因b细胞对感染的反应有深远的影响。风险的基因集富集单包括interferon-related集,这是令人鼓舞的考虑到被检查的基因型IRF5。多个基因集,红斑狼疮相关丰富的细胞单风险,包括干扰素α集、白介素- 6 (IL)炎症扩散,单核细胞和树突细胞基因,除了SLE-related干扰素基因集。发现这些基因集最强烈丰富的单体型表明风险IRF5风险单体型有很强的影响干扰素信号和炎症,系统性红斑狼疮的核心流程。发现最丰富的基因集与干扰素和狼疮也表明,有关这些结果不太可能获得的假阳性的机会,因为研究的变量是一个interferon-affecting基因。
基因集富集分析技术的使用不仅是有价值的因为他们识别单个基因,但也强烈通路包括这些基因和它们之间的交互是受实验条件的影响。这允许一个更广泛的研究基因网络比只看个人的基因。这些研究指出IRF5风险单体型有广泛影响干扰素和炎症。未来的调查结果确定目标的功能IRF5以及其他基因多态性对红斑狼疮的影响。
的基因集富集分析,识别的干扰素和toll样受体通路通过Illumina公司通路分析表明结果强劲,因为这些途径将会被底层调制IRF5单体型的捐献者。干扰素α是一个极其重要的狼疮细胞因子(53]。这些研究表明,α干扰素通路由遗传变异的强烈影响IRF5基因,显示多个基因可能的目标理解干扰素在狼疮或潜在的治疗靶点。toll样受体参与应对感染通过其分子的识别模式。此外,toll样受体在红斑狼疮的发病机制是重要的。他们有能力识别内源性核酸在狼疮患者血清中发现的免疫复合物,从而刺激树突状细胞成熟和干扰素α生产(25,54- - - - - -60),这一过程也涉及到IRF5本身(25]。IRF5是一个非常有趣的转录监管机构,它充当一个活化剂时激活结伴和块二聚化IRF7(61年,62年]。这种机制的行动可能有助于解释这些通路如何根据差别表现出相对upregulation或对这些细胞的其他条件。
本研究的更多意想不到的发现之一是调制的b细胞受体途径IRF5单体型。B细胞受体的识别是重要的抗原和生存,成熟,B细胞的增殖。B细胞产生自身抗体参与狼疮,作为重要的抗原加工、表示和t细胞活化。激活阈值或其他影响的差异可能与B细胞受体基因表达改变可能是非常重要的B细胞生物学的打破自我耐受性或其他方面参与系统性红斑狼疮。在这方面特别感兴趣的是最近的发现IRF5控制转向IgG2A抗体类,允许lupus-like自身免疫小鼠(63年]。b细胞受体和toll样受体通路参与抗体类开关,和基因调节的IRF5变化在这个研究可以代表的机制IRF5风险单体型可能导致类开关或其他类似人类的变化。
干扰素反应签名已被确认为狼疮的共同特征。这些研究调查的多态性IRF5基因影响干扰素反应签名在病人和控制。有趣的是,系统性红斑狼疮患者的风险单体型已经展示了干扰素签名在感染和未感染的细胞,而强烈的干扰素反应并不是没有风险的患者中发现单体型即使刺激EBV曝光。与风险控制单体型缺乏干扰素反应签名的基础状态,但发达后接触EBV,正如所预期的那样。这些发现表明,IRF5风险单体型是干扰素反应积分签名在病人和控制。他们还表明,其他因素在狼疮患者基底干扰素反应,自IRF5风险单体型没有足够的签名出现在如果的响应控制细胞,因为它是在患者单体型的风险。
细胞被感染EBV的原因有两个。首先是识别基因表达模式的差异与生物相关的细胞被刺激时触发干扰素生产。第二个原因是识别领域,可能会解释的差异在狼疮EBV感染和响应。基因表达是研究基因的三个途径发现重大创新分析。在一些情况下,(IFITM1、IFNAR2 LY96, PIK3CA NFAT5,和GSK3B)的基线水平基因表达是风险较高的细胞,但在EBV感染,保护细胞的基因表达相对增加。在其他基因,包括CD79A、CD79B STAT1、MyD88和安全系数,细胞表达较低风险但区别减弱或逆转后EBV感染。的一个基因的表达,TNFAIP3在保护风险低于单体型主题如果EBV感染后细胞相对减少进一步。这些差异表明,一些地区的调查了解狼疮B细胞生物学的差异和显示IRF5单体型影响多种基因与EBV感染和响应。
虽然详细分析每个基因参与这些途径是超出了本文的范围,风险和保护之间的基因表达差异单是暗示在几个实例。其中一个基因与承诺影响狼疮TNFAIP3。这个基因是一个转录因子在炎症反应产生。它已被证明是由终止NF限制炎症的关键κB反应(64年]。变体最近与红斑狼疮等自身免疫和炎性疾病的风险(65年- - - - - -71年),经常在肿瘤抑制,特别是淋巴瘤(66年,72年,73年]。这些实验包括其他承诺基因识别STAT4,IFITM1,IFNAR2,这些都是对干扰素参与反应,和几个B细胞信号传导的基因,包括NFAT5,GSK3B,NFκB2。
尽管EBV用于模拟B细胞的感染状态,一部分EBV本身可以参与红斑狼疮的病因影响几个途径。所涉及的三个途径确认都是EBV感染。EBV可能刺激这些通路通过几种机制,包括病毒的感染和绑定受体参与这些途径。虽然EBV感染的效果有点变量,基因差异表达的许多基因检查在这项研究中有过度风险细胞,后来EBV感染后减弱。这种模式,以及与干扰素反应看到签名,表明IRF5风险单体型使这些细胞出现更多的激活休眠状态。因为这个高度激活状态,减少不同风险应对EBV感染细胞,nonrisk细胞经常追赶或传递风险细胞在病毒感染后几个基因的表达。一个激活基底状态可能会促进不恰当的自体抗原细胞反应和可能的高度敏感性,包括那些被通常。
这些研究结果确定几个关键路径的影响IRF5风险单体型和参与B细胞抗原刺激和病毒感染。许多基因参与这些途径已经明确的潜在改变响应EBV感染和影响狼疮的发展。这些值得进一步调查。由于所有这些途径可能参与了红斑狼疮的发展,进一步比较这些途径的其他细胞类型,如血浆树突细胞将有利于理解起源和红斑狼疮的发病机制。它也将是有益的检查更仔细地EBV的作用在调节这些基因的表达,通过使用EBV突变体,并解剖的角色IRF5在每个通路和基因集。
确认
这项工作是由美国国立卫生研究院拨款P30 AR053483 (j·詹姆斯和j . Guthridge), P20 RR015577 (j . James), N01 AI50026 (j·詹姆斯和j . Guthridge) R01 AI063274和R01 AR056360 (p . Gaffney) R3724717 (j .哈利)AR042460 (j .哈利)P01 AI083194 (j .哈利),P20 RR020143 (p . Gaffney) R01 DE018209 (j .哈利),和人类研究奖没有办公室。hr08 - 037从俄克拉荷马中心科技促进会(j . Guthridge)。
补充材料
补充数据包含基因集系统性红斑狼疮风险或保护等位基因群体,在p < 0.01,大大丰富了但没有交叉阈值25%的罗斯福(表1和2)。表3和4包括基因集丰富的风险相比没有什么细胞细胞。还包括补充表中所有基因集,大大丰富了EBV感染后每组(表5)。