文摘

我们观察到的影响endostar肺腺癌A549细胞的辐射敏感性,发现endostar抑制A549细胞生长在normoxia和缺氧时间和剂量依赖性的举止;的 0 和 值控制和endostar组(1.36和1.30)与(1.019和1.015)normoxia(1.693和1.39)和(2.453和1.026)在缺氧,分别;SER normoxia下是1.04和1.22在endostar缺氧组;normoxia下,细胞凋亡率控制、放疗、endostar组和组合 1 5 。 9 ± 0 。 5 7 %, 4 2 。 7 ± 0 。 3 7 %, 1 9 。 9 ± 0 。 4 8 %, 4 1 。 5 ± 0 。 3 8 %,分别组合和放疗组之间无显著差异;在G有显著差异2/ M期细胞之间的结合和放疗组( = 0 。 0 2 8 );根据缺氧,在四组细胞凋亡率 1 6 。 7 ± 0 。 6 7 %, 3 0 。 1 ± 0 。 9 5 %, 2 6 。 7 ± 0 。 6 2 %, 3 6 。 3 ± 0 。 7 1 %,分别组合和放疗组之间有显著性差异;G2/ M期细胞结合组高于放疗组( = 0 。 0 0 0 );G2/ M期细胞在低氧组合组高于常氧组(组合 = 0 。 0 0 3 )。基于这些结果,我们得出结论,在缺氧,endostar可以提高通过G A549细胞的辐射敏感性2/ M被捕。

1。介绍

肺癌是最常见的一种癌在中国。放射治疗是肺癌的主要治疗方法,尤其对局部晚期非小细胞肺癌(III期 一个 - - - - - - B )[1]。精确放射治疗被认为是放射治疗在21世纪的发展方向。然而,精确放射治疗未能改善恶性肿瘤患者的长期存活率。这可能是局部放射治疗不能控制肿瘤转移和复发,还有大量的抗放射性的细胞在肿瘤组织。因此,找到一个有效的辐射敏化剂来提高肿瘤放射治疗的疗效已成为一个焦点。目前,主要辐射敏化剂包括proelectronic辐射敏化剂,减少代理商,化疗、天然药物和分子靶向药物。多关注分子靶向药物、血管内皮抑制素(ES)。

血管内皮抑制素,天然蛋白质在动物,第一次得到的上层清液的小鼠血管内皮瘤细胞培养。血管内皮抑制素来自羧基末端的细胞外基质的水解胶原蛋白十八。血管内皮抑制素含有184个氨基酸的分子量20 KD。自然血管内皮抑制素是非常不稳定的半衰期较短,较低的生物活性。重组人血管内皮抑制素(rh endostar)通过添加9血管内皮抑制素的氨基酸。流值是稳定的较长的半衰期和更高的生物活性。大肠杆菌蛋白表达系统解决的问题在endostar包涵体复性。

许多临床研究表明endostar可以提高放射疗法的效果在许多恶性肿瘤(2,3),但其确切机制仍不清楚。耆那教(4]发现血管生成抑制剂能使血液肿瘤血管系统正常化,减轻肿瘤缺氧。温克勒et al。5)已经证实血液血管系统规范化的存在。然而,早期(6)最近报道,机体血管生成抑制剂的影响可能与血液血管系统规范化。为了进一步探索endostar对机体的影响及其机制,我们观察到的影响endostar在人肺腺癌A549细胞行normoxia体外缺氧,分别。

2。材料和方法

2.1。细胞系和试剂

人肺腺癌A549细胞行是购自中国科学院细胞银行(上海,中国)。Endostar是由南京先声药业有限公司。

2.2。细胞培养

A549细胞在DMEM培养补充10%的胎牛血清和100 u /毫升的青霉素和链霉素,分别在37°C的氛围中5%的股份有限公司2在无菌条件下与一段每2 - 3天。

2.3。细胞毒性Endostar对A549细胞的影响下Normoxia和缺氧

(1)A549细胞在记录阶段被镀成96孔板5.0×103每个细胞。当细胞被完全附着在24小时之后,文化的解决方案是,紧随其后的是添加endostar包括500 mg / L、200 mg / L, 100 mg / L, 50 mg / L, 10 mg / L, 5 mg / L, 1 mg / L和0 mg / L (0 mg / L只有包含0.1%的DMSO),分别对每组3井。同时,空白的控制和零位调整井集。这些细胞被孵化在37°C在饱和湿度5%的股份有限公司224 - 72小时,然后10 ul MTT(5毫克/毫升)添加到每个孵化为4 h删除中紧随其后。甲瓒解决方案(100 uL)添加到每个孵化为4 h,然后光显微镜显示所有甲瓒溶解。吸光度(A值)决定与ELISA 570海里。(2)在缺氧的体外细胞培养,A549细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM 37°C的氛围中5%的股份有限公司2,然后CoCl2添加模拟肿瘤缺氧微环境。最后CoCl的浓度2在DMEM调整150 umol / L(根据(7])。(3)CoCl2添加在缺氧组、空白控制和零位调整井,分别和CoCl的最终浓度2也调整为150 umol / L。其余的程序与步骤(1)相同。上述步骤(1)和(3)是重复三次,分别,结果表明平均价值。细胞生存的抑制率在不同的药物浓度是根据以下公式计算:抑制率=(值控制−测试的值)/的值控制×100%。细胞生长曲线与各种药物浓度为横坐标,绘制细胞生长抑制率为纵坐标。IC20计算根据细胞生长曲线。

2.4。克隆形成实验

胰酶消化后,准备成单细胞悬液,人肺腺癌A549细胞在日志相放入6-well板102-10年5每个细胞根据不同辐照剂量,随后轻轻摇板使细胞分布。这些细胞被孵化在37°C在饱和湿度5%的股份有限公司2为24小时。细胞贴壁后,文化解决办法是删除和细胞被分配成四组包括两个放射治疗组,分别在normoxia和缺氧,分别和两个组合组(endostar结合放疗)normoxia和缺氧,分别。每组分为5组根据不同辐照剂量(0、2、4、6和8 Gy)。结合组,endostar的最终浓度为300 mg / L normoxia和400 mg / L在缺氧。24小时孵化后,细胞与各种剂量的高能x射线辐照:0,2,4,6,8 Gy,分别在室温下切除上层清液和添加endostar-free新鲜培养液。细胞继续培养在37°C在饱和湿度5%的股份有限公司210 - 14 d和文化解决方案是改变根据PH值在10 - 14 d。细胞被孵化,直到50或更多的克隆形成。染色染色:(1)试剂1 3 - 5滴了一分钟快速覆盖细胞。(2)试剂2 6 - 10滴直接补充道,随后轻轻摇板使染色溶液充分混合5 - 8分钟,和(3)用水洗了30年代,和克隆 ≥ 0.2毫米直径的计算。实验重复两次。电镀效率(PE)和生存分数(SF)按照下列公式计算:PE =(克隆数/细胞计数)×100%,科幻小说=观察组(PE / PE在0 Gy集团)×100%。生存分数在不同剂量点计算。策划是通过曲线拟合与SigmaPlot软件根据single-hit多目标模型(SHMT) {年代= 1− ( 1 − e / 0 ) }。平均致死量( 0 ),quasi-threshold ( ),外推数(N),生存分数在辐照剂量的2 Gy(科幻小说2),和敏化增强比率(SER)计算每组,分别。

2.5。细胞凋亡与流式细胞分析仪检测

A549细胞在记录阶段接种与1.8×10 6-well板5每个细胞。四组(对照组,单独放疗组,endostar集团和组合组)被设置在normoxia和缺氧,分别。细胞培养24小时,附着;文化的解决方案是更换新鲜培养液。缺氧组,COCL2添加到每个调整最终浓度150 umol / L 24小时孵化紧随其后。细胞仅在放疗组和联合治疗组辐照(与6 mvx-ray,磁场等深点照射15厘米×15厘米和剂量的2 Gy)与线性加速器(西门子)24 h。使胰蛋白酶化和收获后,这些细胞被洗两次与PBS和resuspended绑定缓冲(预冷在4°C),其次是增加AnnexinV (5 uL)和π(2.5 uL)在黑暗中在室温下15分钟。绑定缓冲补充说,在接下来的一个小时,细胞凋亡与流式细胞分析仪评价。

2.6。用流式细胞分析仪细胞周期决定

A549细胞在记录阶段接种在6-well板1.8×105每个细胞。四组(对照组,单独放疗组,endostar集团和组合组)被设置在normoxia和缺氧,分别。治疗24小时后,细胞消化,离心机,用PBS两次洗净,与冰冷的乙醇固定12 h。细胞周期决定了流式细胞分析仪根据设备的指令。DNA分析、光散射分析与CellQuest和ModFit软件进行细胞。

2.7。统计分析

SPSS 13.0软件包用于统计分析。率的比较采用卡方检验。细胞存活曲线装有σ情节10.0软件基于single-hit目标方程。方差分析是用于比较变量。F以及用于对比多个组。比较两组进行t以及。 < 0 。 0 5 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。Endostar对A549细胞的生长抑制率下Normoxia和缺氧的文化

后A549细胞治疗endostar各种浓度不同时间下normoxia和缺氧,endostar显示抑制效应对A549细胞与对照组相比(表1和2)。A549细胞治疗endostar normoxia下的7个不同的浓度和缺氧,分别为24 - 72 h,然后细胞存活曲线是基于MTT比色试验结果分析。IC20是 3 3 0 。 3 4 ± 4 。 1 8 mg / L normoxia下 4 3 7 。 2 3 ± 3 。 3 2 mg / L在缺氧时A549细胞处理endostar 24 h。endostar的浓度并不高于IC20在未来的实验中,所以300 mg / L的endostar normoxia和400 mg / L endostar缺氧下采用在未来实验。

表1
endostar对A549细胞的生长抑制率的影响下normoxia (%)。
表2
endostar对A549细胞的生长抑制率的影响在缺氧(%)。
3.2。增强Endostar在A549细胞的辐射敏感性Normoxia和缺氧

normoxia下,后A549细胞服用300 mg / L endostar 24 h, A549细胞的辐射敏感性未能显著提高,细胞生存曲线组合和放疗组之间没有明显改变(图1),的值 0 和 结合1.30 Gy和1.015 Gy集团和1.36 Gy和1.019 Gy放射治疗组(表吗3)。在缺氧后A549细胞服用400 mg / L endostar 24 h, A549细胞的辐射敏感性强,细胞存活曲线组合组低于在放射治疗组(图2),的值 0 和 结合1.39 Gy和1.026 Gy集团和1.693 Gy和2.453 Gy放射治疗组(表吗3)。

表3
参数single-hit A549细胞在不同条件下多目标模型。

图1
normoxia下细胞A549细胞的生存曲线。

图2
细胞在缺氧A549细胞的生存曲线。
3.3。A549细胞凋亡诱导下Endostar Normoxia和缺氧

normoxia下,细胞凋亡率对照组,放射治疗组,endostar组和联合治疗组 1 5 。 9 ± 0 。 5 7 % , 4 2 。 7 ± 0 。 3 7 % , 1 9 。 9 ± 0 。 4 8 % , 4 1 。 5 ± 0 。 3 8 % 分别,没有统计学意义( = 1 。 2 2 , = 0 。 4 7 9 组和放射治疗组(表)之间的组合4和图3)。根据缺氧,在四组细胞凋亡率 1 6 。 7 ± 0 。 6 7 % , 3 0 。 1 ± 0 。 9 5 % , 2 6 。 7 ± 0 。 6 2 % , 3 6 。 3 ± 0 。 7 1 % 分别结合组和放射治疗组之间有统计学意义( = 3 。 3 4 , = 0 。 0 3 6 )(表4和图4)。

表4
在不同条件下A549细胞凋亡。
(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图3
在normoxia A549细胞凋亡。(一)对照组;(b)单独放疗组;(c) Endostar单独组;(d) Endostar +放疗。
(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图4
在缺氧A549细胞凋亡。(一)对照组;(b)单独放疗组;(c) endostar单独组;(d) endostar +放疗。
3.4。Endostar对A549细胞周期的影响下Normoxia和缺氧

根据normoxia,每个组都有不同数量的G2/ M期细胞( = 1 3 5 0 , = 0 。 0 ),组合和放疗组之间有显著性差异( = 0 。 0 2 8 ),这表明endostar normoxia下A549细胞周期分布的影响。在缺氧,每个组都有不同数量的G2/ M期细胞( = 4 9 3 , = 0 。 0 0 0 ),和G2/ M期细胞结合组高于放疗组( = 0 。 0 0 0 )。G2/ M期细胞在低氧组合组高于常氧组(组合 = 1 5 。 4 8 , = 0 。 0 0 3 )。上述结果表明,endostar允许A549细胞产生G2/ M逮捕,特别是在低氧条件下(表5和图5)。

表5
细胞周期在每个组normoxia和缺氧(%, − ± 年代 )。

图5
细胞周期的分布在normoxia和缺氧。(a1)——(a3):细胞周期的分布在对照组,放射治疗组和Endostar +放疗组normaxia之下。(b1)——(b3):细胞周期的分布在对照组,放射治疗在缺氧组和Endostar +放疗组。

4所示。讨论

我们的研究结果表明,endostar没有机体效应,未能normoxia下的细胞凋亡率增加,但在缺氧,endostar可以改善A549细胞辐射敏感性,增加A549细胞凋亡。Endostar允许A549细胞产生G2/ M期逮捕,尤其是在缺氧条件下。endostar机体效应的机理可能与G2/ M被捕。

肺癌的发病率和死亡率在恶性肿瘤中排名第一世界(8),其发病率正在增加,尤其是非小细胞肺癌(NSCLC)占80 - 89%的肺癌9]。放射治疗是肺癌的主要治疗方法,尤其对局部晚期非小细胞肺癌(1]。然而,部分肺癌细胞的放疗抵抗影响治疗效果,和放射治疗的5年生存率只有5% - -10%,80%的患者发生局部复发,转移发生在60%的病人(10]。因此,有必要找到一个有效的辐射敏化剂来提高肿瘤放射敏感性。

目前,还没有一个理想的辐射敏化剂在临床实践中。因此,重要的是要找到一个有效的辐射敏化剂在放射疗法。Endostar成为目前研究的热点。

1994年,O ' reilly医生在血管生成抑制素福克曼实验室发现血管内皮抑制素的发现,可以专门抑制血管内皮细胞生长。O ' reilly et al。11)发现血管内皮抑制素对内皮细胞增殖抑制活性牛毛细管和aortopulmonary。然而,天然血管内皮抑制素是非常不稳定,半衰期短,生物活性很低。这些限制在临床实践中的应用。Endostar是通过添加9氨基酸血管内皮抑制素,从而改变自然血管内皮抑制素的氨基酸序列。Endostar更稳定和更长的半衰期和更高的生物活性。

有没有endostar结合放疗的效果?许多临床研究表明endostar可以提高对多种恶性肿瘤放射疗法的影响,但机制尚不清楚。耆那教(12)和温克勒et al。13)发现血管生成抑制剂能使体内血液肿瘤血管系统正常化,减轻肿瘤缺氧。黄和陈14)也证实,endostar可以使血液肿瘤血管系统规范化在“时间窗”,减轻肿瘤缺氧。以上结果表明,endostar结合放疗的协同效应提高肿瘤组织缺氧有关。然而,在上述研究中,结果来源于直接endostar对内皮细胞的影响。它也一直不清楚endostar拥有机体对肿瘤细胞在体内或体外的影响。先前的研究表明,endostar专门作用于血管内皮细胞和肿瘤细胞没有影响。然而,最近的研究表明,抑制血管内皮抑制素不仅对内皮细胞的影响,但同样在舌鳞状细胞癌(7)和头颈部鳞状细胞癌(HNSCC) [15]。也有证据,证实人类血管内皮抑制素可以抑制膀胱癌细胞株EJ癌的增殖,促进其凋亡[16]。Dkhissi et al。17]还发现血管内皮抑制素能抑制结肠癌细胞株C51和HT29体外。

为了探索机制,我们观察到Endostar对A549细胞增殖的影响,辐射敏感度,细胞凋亡和细胞周期分布。

在这项研究中,endostar对A549细胞增殖有抑制作用在时间和concentration-dependant礼仪normoxia和缺氧。

在克隆形成试验endostar缺失的情况下,在缺氧存活分数是高于normoxia ( = 0 。 0 0 0 ),但它在低氧低endostar组比低氧组没有endostar ( = 0 。 0 0 0 ),证明endostar可以提高缺氧下A549细胞的辐射敏感性。的值 0 和 高比起normoxia缺氧下,这表明平均致死剂量高,亚致死损伤修复强,辐射敏感度在缺氧细胞比贫穷常氧细胞。endostar添加后的值 0 和 从1.693下降到1.39,从2.45到1.02,分别,这表明endostar可以减少平均致死剂量在缺氧细胞和亚致死损伤修复能力。endostar添加后,爵士1.22不止一个,证明endostar机体对A549细胞的影响。

在这项研究中,在低氧放射治疗组细胞凋亡率低于在常氧放射治疗组( = 1 0 。 8 2 2 , = 0 。 0 0 2 ),表明缺氧可以减少细胞凋亡。没有统计学差异在常氧的细胞凋亡率控制和endostar组和缺氧控制和endostar组( = 3 。 7 6 8 , = 0 。 1 4 8 ),这表明endostar仅对细胞凋亡的影响不显著。在细胞凋亡率没有显著差异常氧组和常氧放射治疗组( = 0 。 5 5 3 ),但有一个显著区别低氧组和低氧放射治疗组( = 0 。 0 0 0 ),这表明endostar只有在缺氧条件下促进细胞凋亡。我们的研究还发现,G2/ M期细胞在低氧放射治疗组低于在常氧放射治疗组( = 2 4 。 5 7 2 , = 0 。 0 0 0 ),显示缺氧细胞对放疗不敏感;G2/ M期细胞在低氧组合组高于常氧组(组合 = 1 5 。 4 8 , = 0 。 0 0 3 ),进一步证明endostar机体对A549细胞的影响只在缺氧的条件下与放疗相结合。机制可能是缺氧细胞周期变化。

我们的研究结果表明,endostar-combined放疗具有机体效应对人类肺腺癌A549细胞线在缺氧,而机体效应normoxia下没有找到。机制可能是endostar缺氧下细胞周期变化。我们的研究提供了实验依据endostar结合放疗的临床应用。肿瘤的起源和发展是一个复杂的过程。体外和体内环境之间存在差异,所以在体外和体内放射线增减的机制可能是不一样的。的确切分子机制还有待进一步研究。

承认

这项研究得到了江苏省自然科学基金(bk - 2009167)。