抽象的

我们描述了一种新的快速有效的聚合酶链反应（PCR）定向的诱变方法。该过程对任何质粒都是有效的，并且使用四个寡核苷酸引物。一个引物包含所需的突变，第二个引物是朝相反的方向定向（这两个引物之一应被磷酸化），第三和第四应该以互补的方式编码，以在非必需区域中引入独特的限制位点。该方法由两个同时的PCR反应组成。PCR产物是用识别新引入的独特限制位点的酶消化的，然后结扎并用于转化有效的细菌。此外，使用DPN我促进消除模板DNA。新引入的限制性位点对于在两个PCR产品的正确方向结扎至关重要，并进一步用于突变筛选。由此产生的质粒带有新的限制位点和所需的突变。使用此方法，已经生成了20多个突变体（使用两种不同类型的模板）；将所有这些突变体测序以进行所需的突变并转染到ATT-20细胞中，并分析了由载体编码的表达突变蛋白。