文摘

Dihydropyrimidinase (DHPase)是一个嘧啶降解的关键酶。DHPase包含一个双核的金属中心两个锌离子被转译后的桥接carbamylated赖氨酸。DHPase催化的水解dihydrouracilN[氨基甲酰-β丙氨酸。是否5-aminouracil (5-AU),胸腺嘧啶拮抗剂和抗癌药物可以阻止DNA合成和诱导复制的压力,可以与DHPase还有待调查。在这项研究中,我们确定的晶体结构铜绿假单胞菌2.1 DHPase (PaDHPase)包裹着5-AU决议(PDB项7 e3u)。这种复杂的结构显示,5-AU与锌α(3.2)、锌β(3.0),残留的主要链条Ser289(2.8)和Asn337(3.3)和残留的侧链Tyr155 (2.8)。这些残留物也称为substrate-binding DHPase的网站。动态循环我(氨基酸残基Pro65-Val70) PaDHPase没有参与5-AU的绑定。荧光猝灭分析和定点诱变是用来确认绑定模式揭示了复杂的晶体结构。PaDHPase 5-AU绑定模式,然而,不同于5 -氟尿嘧啶,最著名的fluoropyrimidine用于抗癌治疗。这些结果提供分子的见解,可能促进开发新抑制剂针对DHPase和构成5-AU interactome。

1。介绍

嘧啶基地至关重要遗传信息的复制、细胞代谢和细胞生长在所有生物系统(1]。尿嘧啶衍生物,尤其是5-substituted尿嘧啶,药理作用中发挥重要作用,如抗病毒(2),抗癌药物(3),抗菌4,抗炎5,6),和抗肿瘤的活动(7- - - - - -9]。例如,5 -氟尿嘧啶(研究者用)是一个fda批准的药物疗效显著的系统性治疗胃肠道癌,乳腺癌、头,脖子在诊所(8]。作为一个胸腺嘧啶拮抗剂具有抗癌活性,5-aminouracil (5-AU)可以阻止DNA合成和诱导复制压力(10,11]。此外,最近的研究表明,微生物群可以调节宿主应对这些化疗药物12]。因此,整个interactome这些five-substituted尿嘧啶药物应确定详细的临床药代动力学和毒性分析。

Dihydropyrimidinase (DHPase) [13]嘧啶降解的关键酶(图1(一))。DHPase包含一个双核的金属中心两个锌离子被转译后的桥接carbamylated赖氨酸(Kcx) [14- - - - - -18]。DHPase催化的水解dihydrouracil(东华大学)N[氨基甲酰-β丙氨酸。包括Kcx dimetal中心(锌α/锌β)DHPase由四个他和一个Asp。的守恒的底物结合位点DHPase Ser, Asn,酪氨酸(19]。这些残留物,爵士和Asn与衬底东华大学通过DHPase的支柱。尽管通过主链的相互作用,这些残留物突变还导致严重受损的酶(16]。锌的损失β离子导致Kcx不再carbamylated mono-Zn DHPase [14]。根据氨基酸序列的分析,DHPase被认为是环酰胺水解酶家族的成员(20.,21]。环酰胺水解酶家族还包括dihydroorotase [22- - - - - -28),尿囊素酶(28- - - - - -30.],hydantoinase [31日,32],imidase [33- - - - - -35]。这些metal-dependent酶催化环酰胺键的水解的嘌呤和嘧啶代谢的底物。有些酰胺水解酶已知抗癌(24,36- - - - - -38),抗菌16,27,39),和抗疟目标(40,41),因为他们的参与核苷酸合成的关键反应。因此,新的抑制剂应该发现,他们的绑定模式应该追究化疗药物开发。

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图1
PaDHPase与5-AU复合体的结构。(一)DHPase的生理反应。(b)与5-AU PaDHPase的复杂结构。单体的颜色不同。5-AU被发现只在单体而不是在单体b . (c) PaDHPase的活性部位。双核的金属残留His59中心聚集,His61, carbamylated Lys150 (Kcx150) His183, His239, Asp316 PaDHPase对催化活性至关重要。光橙色网2 fo-fc 5-AU色彩的电子密度图1所示σ1.6一个雕刻半径。两个锌离子参与绑定5-AU。

据报道[5-FU-associated毒性42]。治疗后的研究者用抗癌药物治疗无症状DHPase缺乏症患者患有严重的毒性,包括死亡(43]。最近的一份报告显示,DHPase是小说5-FU-binding蛋白(44]。是否和其他five-substituted尿嘧啶等药物5-AU可以绑定DHPase还有待阐明。在目前的研究中,我们发现5-AU可以绑定铜绿假单胞菌DHPase (PaDHPase)。我们确定PaDHPase复杂的晶体结构与5-AU 2.1决议(PDB项7 e3u)。鉴于研究者用和5-AU之间的结构相似,可以得出结论,研究者用模式受PaDHP必须5-AU相似。然而,我们发现他们的绑定模式是不同的。荧光猝灭法和定点诱变也被用来证实的绑定模式5-AU PaDHPase透露的复杂结构。我们认为这种复杂结构的测定可以扩展的知识5-AU interactome和抗癌的发展中获益。

2。材料和方法

2.1。PaDHPase表达和纯化

的表达载体pET21b-PaDHPase [16]变成了大肠杆菌BL21 (DE3)细胞和生长在LB培养基在37°C。1毫米的超表达是由孵化异丙thiogalactopyranoside 9 h。重组PaDHPase [36)是利用Ni可溶性上层清液的净化2 +亲和色谱法(HiTrap惠普;通用电气医疗集团生物科技)。重组蛋白筛选了一个线性咪唑梯度和透析对透析缓冲区(20毫米Tris-HCl和0.1 M氯化钠,pH值7.9;缓冲)。

2.2。制备Mono-Zn PaDHPase(锌α-PaDHPase)

的mono-Zn PaDHPase准备使用先前描述的协议(45]。纯化PaDHPase透析螯合缓冲区(50毫米MES、50 mM EDTA和15毫米8-HQSA, pH值6.5;缓冲B)在室温下为3天。合成的酶解当时透析对缓冲区。

2.3。定点诱变

PaDHPase突变体的生成根据QuikChange定点诱变工具包协议(Stratagene;美国拉霍亚,CA)。野生型质粒pET21b-PaDHPase用作模板(16]。突变的存在在每个构造是由DNA测序验证。重组突变体蛋白纯化使用协议的野生型PaDHPase倪2 +亲和色谱法(表1)。

表1
引物用于构建质粒。
2.4。晶体学

最佳的蛋白质浓度的结晶PaDHPase复杂,由测试前期结晶(汉普顿),10毫克/毫升。晶体生长在室温下的悬滴蒸汽扩散在16% PEG 8000,消息灵通的100毫米,200毫米醋酸钙,和200年μM 5-AU, pH值7.5。数据是使用一个收集ADSC量子- 315 r CCD探测器在SPXF beamline BL13C1国家同步辐射研究中心(NSRRC;新竹、台湾)。5-AU-PaDHPase复杂的结构解决了2.1决议与分子替换软件Phaser-MR [46使用PaDHPase] (PDB项5 e5c) (15(表)作为一个模型2)。数据索引和扩展使用hkl - 2000 (47]。模型构建和完善与凤凰48和傻瓜49]。协调和结构因子文件存入蛋白质数据库(PDB项7 e3u)。

表2
数据收集和细化统计数据。
2.5。离解常数的测定(Kd)

通过分析荧光猝灭,Kd纯化PaDHPase价值确定(44]。一个整除5-AU添加到解决方案包含PaDHPase (0.8μ7.0米)和50 mM消息灵通的pH值。减少的内在荧光PaDHPase测量在279 nm和336 nm激发态25°C荧光光谱仪(日立f - 2700;日立高新技术、日本)。的Kd获得使用方程:Δ吗F=ΔF马克斯−Kd(ΔF/ [5-AU])。

3所示。结果与讨论

3.1。PaDHPase-5-AU复杂的结晶

PaDHPase晶体可以通过悬滴蒸汽扩散在28% PEG 6000,玫瑰100毫米和200毫米醋酸锂在pH值7.5 [15]。浸泡和共结晶的PaDHPase 5-AU在这些条件下尝试,但没有成功。结晶筛选后,PaDHPase-5-AU复杂的晶体在室温下出现在16% PEG 8000,消息灵通的100毫米,200毫米醋酸钙,和200年μM 5-AU, pH值7.5。这些晶体是用于确定PaDHPase的复杂结构。

3.2。与5-AU PaDHPase结构复杂

5-AU-PaDHPase复杂的晶体属于空间群P3121与细胞的尺寸一个= 112.67,b= 112.67,c= 161.43。解决复杂晶体结构的PaDHPase 5-AU决心决议(表2.12)。两种单体PaDHPase在不对称单位(图中被发现1 (b))。一致,PaDHPase函数作为一个二聚体(15]。5-AU是定义良好的电子密度,表示存在的活性部位的5-AU PaDHPase(图1 (c))。的方向5-AU可以很容易被认出来的基础上取代基的位置。然而,只有一个5-AU分子的活性位点被发现PaDHPase二聚体之一。这也为研究者用绑定到PaDHPase [44]。绑定的5-AU并不影响PaDHPase的总体结构。类似于人群的形式,的全球架构5-AU-complexed PaDHPase单体(亚基)显示TIM-barrel结构嵌入催化dimetal中心(锌α和锌β)和一个β三明治域,由17α螺旋线,19β表2锌离子,和1 5-AU分子。两个5-AU锌离子参与绑定。PaDHPase-5-AU复杂dimetal中心由His59, His61, Kcx150, His183, His239, Asp316仍然魔法(图1 (c))。Lys150仍然carbamylated (Kcx150)无论5-AU绑定。

3.3。5-AU绑定模式

尿嘧啶衍生物具有许多化疗和药理活性11),5-AU被认定为配体受PaDHPase在这项研究中。PaDHPase 5-AU绑定模式是通过复杂的晶体结构。晶体分析的基础上,各种5-AU和PaDHPase检查(图之间的相互作用2(一个))。残留Tyr155、Ser289 Asn337 PaDHPase,底物结合的关键(17,19),也参与5-AU绑定(图2 (b))。5-AU与锌α(3.2)、锌β(3.0),残留的主要链条Ser289(2.8)和Asn337(3.3)和残留的侧链Tyr155 (2.8)。动态循环我(氨基酸残基Pro65-Val70) PaDHPase没有参与5-AU的绑定。

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图2
5-AU绑定模式。(a)与5-AU PaDHPase的交互。两个金属离子(黑色球体)和底物结合位点(灰色)PaDHPase参与5-AU(光橙色)绑定。动态循环的青色。5-AU互动与主链残留Ser289 Asn337和残留Tyr155的侧链。的距离在虚线所示。(b) 5-AU与锌α、锌β、Ser289 Asn337, Tyr155。残留物(His59、His61 Kcx150、His183 His239,和Asp316)金属绑定所需颜色的绿色。
3.4。结构比较活跃的站点之间5-AU束缚态和PaDHPase的研究者用绑定状态

最近,PaDHPase晶体结构的复杂与抗癌药物研究者用报道(44]。研究者用最著名fluoropyrimidine用于目标酶thymidylate合成酶在抗癌治疗(3,8]。考虑到结构5-AU和研究者用(图之间的相似度3(一个)),他们可能会得出这样的结论:一个由PaDHPase必须绑定模式是相似的。PaDHPase扩展的动态循环向活性部位当研究者用或5-AU绑定(图3 (b))。然而,我们发现5-AU和研究者用绑定对PaDHPase不同方向(图3 (b)残留物(图)和绑定3 (c))。侧链的残留Cys318 PaDHPase(图3 (d)参与绑定研究者用(2.9)但不是5-AU(图2)。此外,绑定PaDHPase金属离子的贡献是不同的。锌β没有参与绑定研究者用(44),而锌离子与5-AU(图2)。因此,我们得出结论,抗癌药物研究者用的绑定机制和5-AU PaDHPase是不同的。

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图3
5-AU和研究者用绑定模式之间的比较。(一)5-AU和研究者用的结构。(b)的叠加结构5-AU和研究者用绑定状态。动态循环在两个绑定的构象状态是相似的,但5-AU之间的取向和研究者用(粉红色)是不同的。(c)的交互PaDHPase研究者用。锌α和底物结合位点(灰色)PaDHPase参与研究者用绑定。动态循环的亮粉红色。研究者用互动与主链残留Ser289 Asn337和残基的侧链Tyr155 Cys318。的距离在虚线所示。(d)研究者用与锌α,Cys318 Ser289 Asn337, Tyr155。残留物(His59、His61 Kcx150、His183 His239,和Asp316)金属绑定所需颜色的绿色。
3.5。5-AU结合分析

在这项研究之前,5-AU是否可以绑定到DHPase仍然未知。确认如果PaDHPase能够绑定5-AU,我们使用了荧光猝灭法来确定绑定PaDHPase能力(图4)。淬火是一个复杂的形成过程,减少蛋白质的荧光强度。野生型的荧光发射光谱PaDHPase明显与5-AU淬火(图4(一))。PaDHPase显示强烈的内在荧光峰值波长为336 nm兴奋时279海里。5-AU滴定到PaDHPase解决方案时,内在的荧光蛋白质逐渐熄灭。在300年的μM 5-AU PaDHPase的固有荧光猝灭了87.3%。添加5-AU导致红移的PaDHPase发射波长(∼6.5 nm;λ马克斯从336.5到343海里)。这些观察表明,与5-AU PaDHPase可以形成一个稳定的复杂。通过滴定曲线确定,离解常数(Kd)PaDHPase绑定到5-AU是97.7±2.0μm .基于KdPaDHPase值绑定到研究者用(133.2±8.5μ米)(44),PaDHPase可能更喜欢绑定5-AU研究者用。

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荧光滴定与5-AU PaDHPase。(a)的荧光发射光谱PaDHPase 5-AU不同浓度(0 - 300μ米)。减少固有荧光的蛋白质为336 nm激发态荧光光谱仪在279海里。PaDHPase显著的荧光发射光谱强度与5-AU淬火。(b)的荧光发射光谱PaDHPase-Y155A 5-AU不同浓度(0 - 300μ米)。(c)与5-AU PaDHPase-S289A的荧光发射光谱。(d)与5-AU PaDHPase-N337A的荧光发射光谱。(e)和5-AU PaDHPase-C318A的荧光发射光谱。(f)锌的荧光发射光谱α-PaDHPase 5-AU。(g)整除的5-AU添加到酶解决方案确定K d。的K d获得了方程:ΔF=ΔF 马克斯−K d(ΔF/ [5-AU])。数据点平均2 - 3决定10%的误差范围内。
3.6。基于结构突变分析

解决复杂结构显示Tyr155 Ser289, Asn337 PaDHPase 5-AU结合位点(图2)。5-AU与残留的主要链条Ser289 Asn337和残留Tyr155的侧链。调查个别氨基酸残基的贡献5-AU绑定,丙氨酸替代突变体(表2)被荧光猝灭(构造和分析数据4 (b)- - - - - -4 (d))。我们发现300μM 5-AU淬火突变体的固有荧光Y155A, S289A, N337A 68.6%, 61.6%,和72.4%,分别。的KdY155A值、S289A N337A绑定到5-AU被减少到247.1±4.0,256.0±3.2,192.1±8.0μM,分别。因此,Ser289是最有效的一个残留5-AU绑定。

从结构上看,Cys318参与研究者用(44但不是5-AU。相比之下,C318A突变也分析了荧光猝灭(图4 (e))。我们发现300μM 5-AU淬火的内在荧光C318A 86.8%。的KdC318A价值被确定为103.3±3.1μm .野生型PaDHPase和C318A突变的能力来绑定5-AU大约相等。因此,对于5-AU Cys318不是至关重要的绑定。

3.7。锌的作用β离子在5-AU绑定

5-AU-PaDHPase的复杂结构的基础上,锌β离子是建议5-AU绑定(图的关键2)。确认锌的作用β在5-AU绑定和比较与其他突变蛋白(表绑定的贡献3),我们生产mono-Zn PaDHPase(锌α-PaDHPase)结合分析。我们的晶体结构此前透露,这mono-Zn酶(45只包含一个锌α离子PaDHPase的活性部位。绑定5-AU锌α-PaDHPase也分析了荧光猝灭法(图4 (f))。在300年的μM 5-AU,锌的固有荧光α-PaDHPase就熄了49.3%。的Kd锌的价值α-PaDHPase 5-AU绑定被计算为281.5±9.0μ从滴定曲线(图4 (g))。基于Kd价值观、复杂地层的强度与5-AU遵循以下顺序:野生型酶≈C318A > N337A > Y155A≈S289A >锌α-PaDHPase(表3)。

表3
绑定参数PaDHPase 5-AU。
3.8。5-AU结构Interactome

代谢重编程允许癌细胞迅速增殖,抵抗化疗,入侵,转移,生存在一个不肥沃的微环境(1]。许多尿嘧啶衍生品一直用于抗癌治疗,如研究者用,最常用的pyrimidine-based抗代谢物针对thymidylate合酶(3,8]。5-AU还拥有强有力的抗癌活性,可以阻止DNA合成和诱导复制压力(11]。5-AU可以显著诱导两相的interphase-mitotic (IM)细胞(10]。尽管5-AU和研究者用尿嘧啶衍生物类似,没有感应肠细胞的发现即使使用多余的研究者用(10]。因此,5-AU和研究者用可能会以某种方式诱导不同细胞的影响。在这项研究中,我们发现不同的绑定模式PaDHPase 5-AU和研究者用之间,以及不同的绑定模式是否可以产生不同的信号通路尚未阐明。我们注意到其他的酶也应对5-AU绑定和/或抑制。三5-AU-complexed蛋白质结构中可用的PDB比较:DHPase(本研究),uracil-DNA糖基化酶(PDB项4 ws6),和dihydroorotase (PDB项6 l0f)。这三种酶结合5-AU通过不同的绑定环境(图5)。例如,uracil-DNA糖基化酶结合5-AU通过Gln67 Tyr70, Phe81, Asn127, His191 [50]。Dihydroorotase结合5-AU通过Arg18 Asn43、Thr106 Lys230, Ala275 [25]。这些交互涉及5-AU绑定,包括PaDHPase-5-AU,是不同的。需要进一步的结构性的研究来理解5-AU绑定机制的建筑结构interactome详细临床药物动力学和毒性分析。

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图5
5-AU绑定模式。(a)与5-AU dihydroorotase的交互。两个金属离子(黑色球体)和结合位点(灰色)dihydroorotase参与5-AU(光橙色)绑定。(b)的交互uracil-DNA 5-AU糖基化酶。

4所示。结论

我们发现,PaDHPase可以绑定5-AU用Kd值为97.7μM(表3和图4)。PaDHPase 5-AU绑定模式,不同的研究者用,决心通过结构性的证据(图1(表)和突变分析3)。这种结构提供了分子见解PaDHPase dimetal中心如何绑定5-AU(图2)。进一步的研究可以直接关注回顾DHPase抗癌疗法的作用[42,43,51]。

数据可用性

原子坐标和相关结构因素与加入代码存入PDB 7 e3u。所有的数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究是由科学技术部支持,台湾109 - 2622(大多数E.S.L. - e - 025 - 006)和涌山医科大学(csmu C.Y.H. int - 110 - 01)。作者感谢实验设施和技术服务提供的同步加速器辐射蛋白质晶体学的生物技术国家核心设施项目,科技部,台湾。