软义齿衬垫内氧化铜纳米颗粒抗口腔病原体的抗菌和抗菌膜活性评价

摘要

目标．软义齿垫为微生物的粘附和定殖提供了良好的环境。本体外研究旨在观察不同浓度的氧化铜纳米颗粒(CuO NPs)掺入义齿软衬垫中对微生物生物膜形成的影响。方法．记录NPs的场发射扫描电子显微镜(FESEM)图像。CuO NPs对五种标准菌株的药敏试验白色念珠菌(cbs 10261,1905, 1912, 1949, 2730)，变形链球菌(ATCC35668),链球菌sobrinus(ATCC27607),唾液链球菌(ATCC9222)，采用微量肉汤稀释法，采用临床和实验室标准学会参考方法。用XTT法测定了CuO NPs在义齿软垫上的生物膜抑制率。结果．通过扫描电子显微镜(SEM)对所合成的CuO NPs进行表征，结果表明所合成的NPs具有合适的结构和尺寸，平均直径为18.3±9.1 nm。CuO NPs成功地抑制了标准菌株的生长白念珠菌的nd链球菌浓度在64到128之间µ克毫升⁻¹．实际上，CuO NPs的浓度为500µ克毫升⁻¹在软义齿衬垫中表现出显著的抑制活性(75%)白念珠菌．以剂量依赖性方式形成生物膜。生物膜的形成白念珠菌在CuO NPs存在的情况下链球菌sp.与对照组相比( ）.结论．CuO NPs的加入显著降低了口腔病原体的定植和斑块形成，特别是白念珠菌积累。这些NPs可能是一种很有前途的抗菌剂，用于软义齿衬垫材料的抗菌管理。

1.介绍

软义齿衬垫是一种弹性材料，在义齿下用作减震器，通过将负荷均匀地分布在义齿承载组织上，以减少承载粘膜的功能负荷[1］．这主要适用于牙槽嵴尖锐或萎缩的患者，对义齿施加的负荷耐受性较低。它们也通常用于调节由不合适的假牙引起的发炎组织。假牙软垫容易变质，增加表面粗糙度。它将导致对微生物定殖和生长的敏感性增加。研究表明，真菌和细菌微生物最初粘附在衬里表面，并在器具上积聚[2- - - - - -4］．在口腔内，大多数定殖和感染微生物不是单一的活细胞，而是结构复杂的微生物群落，通常封装在外聚合物材料的基质中，并附着在生物或非生物表面。这些群落被称为生物膜[5，6］．微生物生物膜是三维结构，已经获得了抵抗抗菌素和免疫细胞挑战的能力。值得注意的是，义齿下的环境条件和材料结构支持了这种微生物的生长，并在义齿相关的口腔炎中发挥了关键作用[7，8］．义齿口炎是义齿佩戴者的常见病(15-70%)，其主要原因是口腔黏膜炎假丝酵母细菌及口腔细菌[6，9］．另一方面，对于一些有一些身体和精神残疾的老年患者，传统的化学和机械清洁假牙程序具有挑战性[10］．

此外，上面提到的一些清洁方法也会损坏软假牙衬垫，导致更多微生物菌斑积聚[11，12］．一些研究人员已经将包括抗真菌药物、金属氧化物和草药在内的多种药物加入到软假牙垫中，作为克服假牙引起的口腔炎的可靠方法[13，14］．虽然这些改良的软义齿衬垫在抗微生物方面有很好的效果，但也有不同的缺点被报道。例如，评估的添加剂的有效剂量没有一定的耐久性和稳健性。有些软假牙垫只在短时间内有效(3-7天)[4，15］．其他一些研究表明，一些抗真菌添加剂会损害软假牙衬垫的力学性能[16，17］．虽然抗菌添加剂对义齿软衬垫的有益作用已被证明，但抗菌软衬垫尚未上市。纳米技术在牙科领域有许多现代应用，包括疾病诊断、治疗和预防。修复牙科、癌症诊断和治疗、种植牙科和分子成像是应用领域的一些例子[18］．纳米材料是天然或人造材料，含有1-100纳米大小的颗粒[19］．近年来，氧化铜纳米颗粒(CuO NPs)由于其良好的导热性、导电性和低成本，已被广泛应用于不同的科学技术领域[20.］．以往的研究表明，NPs在正畸托槽和海藻酸盐中的加入显著减少了微生物生物膜的数量[21，22］．最近，为了降低CuO NPs的成本和毒性，人们开始使用植物等生物来源来代替化学方法，而化学方法也显示出了额外的抗菌活性[23- - - - - -25］．

据我们所知，目前还没有关于不同浓度的CuO NPs加入软衬里的抗菌和抗菌膜活性的报道。因此，本研究旨在评估将CuO NPs纳入软衬里的有效性，并评估其对抗菌和抗菌膜的活性影响变形链球菌，sobrinus链球菌，唾液链球菌,白色念珠菌．

2.材料和方法

2．1．CuO NPs的合成与表征

简单地说，25 mL乙酸铜乙醇溶液(默克，德国，0.2 mol L⁻¹)与25ml氢氧化钠乙醇溶液(默克，德国，0.4 mol L⁻¹)，然后加入0.5克聚乙二醇(分子量，20000）(默克公司、德国)。然后将混合物回流25分钟。用无水乙醇和丙酮多次洗涤，得到棕色沉淀物。样品(CuO NPs)在室温下干燥。此外，还利用场发射扫描电子显微镜(FESEM)对NP进行了成像_年代使用TESCAN Mira 3-XMU(捷克共和国)记录。

2．2．含不同浓度CuO NPs树脂盘的制备

在本研究中，我们使用了自固化的丙烯酸基软衬垫(GC合作，东京，日本)，由粉末和液体组成。根据厂家说明书，制作10.0 × 3.0 mm的实验软义齿衬盘，分别为0、0.5、5、50、500µ克毫升⁻¹CuO NPs浓度。加入CuO NPs后，用超声波(sonipre -150，英格兰)将混合物分散3分钟。然后将粉末和液体混合放置在一个圆盘状的硅胶模具中，压在两块玻璃板之间，直到柔软的义齿衬垫固化，然后抛光。共制作80个椎间盘，分为5组(n= 16)根据CuO NPs的掺入浓度。然后，在一组中，每个应变组分配四个软义齿衬盘。

2．3.标本消毒

标本用2%戊二醛浸泡2 min消毒，用无菌水冲洗。

２.４.抗菌药物敏感性试验

研究了CuO NPs对五株标准菌株的抑菌活性白色念珠菌(cbs 10261,1905, 1912, 1949, 2730)，变形链球菌(ATCC35668),美国sobrinus(ATCC27607),唾液链球菌(ATCC9222)确定。标准菌株的细菌和白念珠菌分别接种于脑心灌注琼脂和Sabouraud葡萄糖琼脂(Merck, Germany)上。然后将培养板在35±2℃下孵育18 ~ 24 h。CuO NPs对标准菌株的最低抑菌浓度(MIC)白念珠菌为临床和实验室标准协会(CLSI)推荐的微量肉汤稀释法测定，范围为0.5μ克毫升⁻¹-512年μ克毫升⁻¹．

简单地说，rmi -1640培养基(有l -谷氨酰胺和酚红，不含碳酸氢盐，Sigma，美国)和0.165 mol 3-(N-morpholino)丙烷磺酸(MOPS)缓冲pH 7.0 (Sigma- aldrich, Steinheim，德国)。NPs的连续稀释(0.5至512µ克毫升⁻¹)，在96孔微量滴定盘中，使用MOPS缓冲的rmi -1640进行制备。将所检测的细菌的三个菌落悬浮在培养基上制备砧木接种白念珠菌在5ml无菌的0.85% NaCl中，并在530 nm波长将接种体的浊度调整到0.5麦克法兰标准(得到1-5 × 10的悬浮液)⁶细胞毫升⁻¹）.暂停工作白念珠菌菌体分别以培养液的1/1000和1/100稀释。后加入0.1 mL的白念珠菌并将细菌接种到孔中，托盘在30°C的潮湿气氛中培养24小时。未接种培养基作为不育对照(空白)。除生长对照外，还包括有接种但不含NPs的培养基。将每口井的生长情况与生长控制井的生长情况进行比较。MICs目测为完全抑制细菌标准菌株生长的最低NPs浓度白念珠菌［8］．

2．5．测定抗菌膜活性

2.5.1。生物膜的制备与生长

生物膜的发展白念珠菌(CBS 10261)菌株在德国默克公司的Sabouraud葡萄糖琼脂培养基中培养;变形链球菌(ATCC35668),美国sobrinus(ATCC27607),唾液链球菌(ATCC9222)在脑心灌注(BHI) (Merck, Germany)琼脂中培养。24小时后，循环一次白念珠菌和菌株菌落分别转移到20 mL Sabouraud葡萄糖和脑心灌注肉汤(默克，德国)，并在30°C的轨道摇床中培养过夜(以100 rpm摇晃)。白色念珠菌然后收集细菌细胞，在无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS, 0.8% w/v)、氯化钠(0.02% w/v，默克，德国)、KH中洗涤两次₂阿宝₄(0.31% w/v，默克，德国)，Na₂HPO₄.12H₂O (0.02% w/v，默克，德国)和KCl (Panreac，马德里，西班牙)。然后，在用MOPS [3-(N-morpholino)丙烷磺酸]缓冲的RPMI-1640培养基中制备各自的微生物悬浮体。白念珠菌用浆料在530 nm下制备出光密度为0.15的微生物悬浮液。浊度等于1 × 10⁵酵母毫升⁻¹．制备出530 nm光密度为0.1的细菌悬浮液。这个浊度等于1.5 × 10⁸CFU毫升⁻¹．将含不同浓度CuO NPs的软义齿垫片成对放置于无菌的12孔细胞培养板中。每孔加微生物悬液1 mL;然后在30℃下放置48 h，形成生物膜[26］．

2.5.2。评估生物膜的形成

生物膜的形成使用2,3-bis(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)- 2h -四唑-5-羧基苯胺(XTT, Sigma，美国)还原测定。XTT为饱和溶液，浓度为0.5 mg mL⁻¹林格氏乳酸。此溶液通过0.22过滤器消毒µm孔径过滤器，分成等价物，然后在-70°C保存。每次检测前，将XTT原液解冻，用甲萘醌亚硫酸氢钠(Sigma，美国，10 mmol L)处理⁻¹(在蒸馏水中制备)，得到最终浓度为1µ摩尔L⁻¹甲萘醌。48 h后，将培养皿从培养箱中取出，并将每孔中的内容物倒空。用PBS洗涤3次，将未附着的微生物从培养皿中提取。在接下来的阶段，亚克力圆盘被轻轻地转移到新的盘子上。一个500µ然后将XTT-甲萘醌加到每个预冲洗的生物膜和含有CuO NPs处理过的培养皿的孔中，在35°C黑暗中孵育4小时，以测量XTT背景水平。最后，将孔的含量转移到另一个板上，用多孔扫描分光光度计(德国北极星omega)评估570 nm波长下的光谱吸光度。所有试验都是重复进行的，以尽可能地减少错误率。以含软衬板井和无微生物培养基为阴性对照，含介质井和微生物井中的软衬板为阳性对照[26］．

2．6．统计分析

采用SPSS 11.0软件和Mann-Whitney软件进行统计学分析U用试验比较对照组和各检测浓度组之间的微生物生物膜形成情况。定量数据以均值、标准差和标准差表示值<0.05为显著性水平阈值。

3.结果

通过扫描电镜对CuO NPs进行表征，证实了合成的NPs具有合适的结构和尺寸。数字1显示了在不同放大率下记录的CuO NPs的FESEM图像。在低放大的图像中可以观察到粒子的团块，在高放大的图像中可以观察到CuO的粘附NPs。平均直径18.3±9.1 nm (n= 50)。

抗真菌和抗菌药物试验结果见表1．CuO NPs成功地抑制了标准菌株的生长白念珠菌细菌的浓度在64到128之间µ克毫升⁻¹(几何平均值= 84.44µ克毫升⁻¹）.

此外，生物膜的形成白念珠菌10261年(CBS)链球菌在含0.5、5、50和500 CuO NPs的情况下，sp. pµ克毫升⁻¹用XTT还原法定量测定，结果见表2．

结果表明，CuO NPs具有显著的抑制微生物生物膜形成的活性，且呈剂量依赖性，与未处理对照相比，其吸光度读数较低。事实上,假丝酵母当浓度为500时，生物膜的形成被抑制了75%µ克毫升⁻¹措NPs。生物膜的形成白念珠菌在CuO NPs存在时，显著低于链球菌具有统计学差异的生物膜形成情况( ）.

4.讨论

氧化铜是铜化合物家族中的一种，具有高温超导、电子相关效应和自旋动力学等有用的物理特性。它相对便宜，容易与极性液体和聚合物混合，在化学和物理活动方面相对稳定。值得注意的是，CuO NPs在以往的研究中取得了相当大的抗菌效果[27，28］．

软假牙衬垫内固有的多孔性使其容易被微生物定植。微生物与口腔组织接触时在义齿表面形成生物膜，并可能在软义齿衬垫准备的某些阶段出现裂缝和不规则。这些缺陷可以作为微生物粘附和定植的口腔水库，包括白念珠菌和链球菌物种特别S. mutans, S. sobrinus，和唾液链球菌［29，30.］．

白色念珠菌具有最重要和最主要的口腔真菌病原体。可在口腔内软硬组织表面粘附、增殖，形成生物膜。变形链球菌是蛀牙的主要病原体，会对戴假牙者造成严重的健康问题[26］．

由于直接使用NPs的一些缺点，包括一些添加剂的不良味道和频繁使用的必要性，需要耐心的合作[31本研究的目的是评估CuO NPs(平均直径18.3±9.1 nm)在义齿软垫中的抗菌和生物膜作用。

在本研究中，CuO NPs抑制了白念珠菌和口头链球菌在几何平均值84.44µ克毫升⁻¹．值得注意的是，NPs的抑菌效果取决于其浓度以及大小和形状。Khan等人发现CuO NPs在50μ克毫升⁻¹浓度显著地阻止了一些口腔细菌的生长[32]，本研究的MIC值与本研究具有可比性。Sathiyavimal等研究表明，无毒的壳聚糖包覆CuO NPs在浓度为20-80时，对革兰氏阴性菌的抑制效果较好，革兰氏阳性菌的抑制效果较差µ克毫升⁻¹［24］．

在本研究中，CuO NPs的抗菌膜活性对不同的微生物表现出不同的作用。在本研究中，将CuO NPs加入到软义齿衬垫样品中可以抑制生物膜的形成白念珠菌和口头链球菌以剂量依赖的方式。生物活性和生物膜形成白念珠菌和链球菌用XTT还原法测定，sp.随着CuO NPs浓度的增加而依次降低。MIC和生物膜形成的结果可能可以解释CuO NPs的抗粘附和随后的抗菌膜作用。

在0.5,5,50和500的四种浓度中µ克毫升⁻¹与对照组相比，在较低浓度(0.5和5)时，抗菌膜效应不显著µ克毫升⁻¹．

低浓度的CuO NPs可能不会释放并干扰粘附和生物膜的形成。根据我们的发现，有75%白念珠菌500时生物膜抑制μ克毫升⁻¹CuO NPs的浓度。这些发现与Sivaraj等人的发现一致[33］．

在细菌种类中，美国sobrinus生物膜形成率最低(37%)在500μ克毫升⁻¹，而变异链球菌和唾液链球菌对CuO NPs较敏感的物种(在500μ克毫升⁻¹分别)。

细胞壁的结构在微生物对金属NPs的耐受性或敏感性中起着重要的作用。根据之前的发现，链球菌革兰氏阳性菌具有较大的细胞壁，具有多层肽聚糖和其他保护性表面结构[34，35］．

根据目前的研究，义齿软衬分别为0.5、5、50μ克毫升⁻¹CuO NPs无显著影响链球菌。粘附及随后形成生物膜(值> 0.05)。这些发现与Eshed等的研究相反，表明低浓度的CuO NPs可阻止生物膜的形成变异链球菌［36］．这些差异的可能解释可能与生物膜形成分析有关。在本研究中，XTT方法被用作生物膜形成的定量测量。

该微生物试验的结果证实了该菌的敏感性白念珠菌对CuO NPs的测定结果表明，软义齿衬垫样品的含量高于口腔样品链球菌菌株。这些发现与Méndez-Serrano的研究一致[37］．

在另一项研究中candidal涂覆CuO NPs的牙齿上的生物膜形成显示生物膜形成减少了70%，这与本研究的结果一致[36］．Pugazhendhi等人的研究表明，掺杂铁的CuO具有很好的抗菌和抗生物膜活性金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌,白念珠菌。由于它的阳离子性质，它会促进容易的结合和渗透，从而导致杀真菌活性[38］．

另一项研究显示，与对照组相比，金属NPs涂层支架显示出显著的抗菌和抗菌膜效应[21］．CuO NPs的抗菌机制可能与微生物细胞壁附着有关，并引起结构变化，进而引发细胞内氧化应激。因此，它们降低了微生物细胞的重要活性，如渗透性，从而导致生物膜形成活性降低，最终导致病原体死亡。

在一项研究中，Tabrez Khan等人发现50μ克毫升⁻¹CuO NPs (40 nm)抑制口腔细菌的生长[39］．该研究的MIC值与我们的相当，尽管我们的NPs比他们的小(18 nm)。

建议进一步研究以评估含CuO NPs的义齿衬垫的生物相容性和力学性能，特别是在MIC浓度下。含CuO NPs的义齿垫的稳定性和有效性的持续时间需要评估。提示CuO NPs对不同菌种的抑菌作用机理有待进一步研究。

5.结论

综上所述，含CuO NPs的软义齿垫对于口腔微生物感染的义齿使用者来说是一种有效、实用且易于使用的选择。CuO NPs可能有潜力作为生物医学设备中的微生物耐药涂层，并限制一些致病微生物的传播。

数据可用性

所有用于支持本研究发现的数据均可根据要求从通讯作者处获得。

附加分

研究的科学依据:使用义齿软衬垫存在清洁困难、微生物定植等问题，导致义齿口炎。在老年患者中，清洁程序具有挑战性，使软衬垫容易积聚菌斑。为了减少这一问题，人们提出了一些解决方案，如添加NPs。主要发现:CuO NPs导致微生物生长显著减少，这些NPs在软义齿衬垫中的加入减少了生物膜的形成。实践意义:提出了用CuO NPs制成的义齿软衬垫作为预防义齿口炎的合适载体，并改善义齿的性能。

的利益冲突

作者声明他们在这篇论文的发表上没有利益冲突。

作者的贡献

K. Z.和E. A.构思了这些想法;n.s和H. H收集数据;Z. Z和E. a分析数据;K. Z.， E. A.和Z. Z.是写作的主角。

致谢

本研究由设拉子医学科学大学副校长资助(批准协议编号11571)。作者希望感谢Shiraz医学科学大学研究咨询中心(RCC)的Nasrin Shokrpour博士，感谢他在编辑这篇手稿时提供的宝贵帮助。

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