Hg(II)与一些双胱氨酸四肽配合物的光谱和理论研究

摘要

合成了含有Cys-Gly-Cys基序和倾向于采用逆序结构的四肽来评估如何使用O-，N-，H和芳香π供体基团可能有助于汞(II)络合物的形成。四肽Xaa- cys - gly - cys，其中Xaa是甘氨酸，谷氨酸，组氨酸，或色氨酸，并与汞(II)氯反应。采用光谱法和计算模型研究了它们与汞(II)的络合作用。紫外可见研究证实，汞(II)结合到半胱氨酸硫代酸盐上，这是由双硫代S-Hg-S配合物的特征配体到金属的电荷转移转变所表明的，对应于1:1的汞-肽配合物形成。ESI-MS数据还显示，主要的1:1汞肽加合物与半胱氨酸硫醇双脱质子形成硫代酸盐一致。这些配合物在210 nm处表现出强烈的正圆二色带，在193 nm处表现出强烈的负圆二色带，表明这些肽段采用了aβ结合汞后的-turn结构(II)。理论研究证实了优化后的1:1汞-肽配合物的采用β由分子内氢键稳定。这些优化的结构也说明了它的特殊性N-末端侧链供体基团可以承担分子内相互作用，有助于复杂的稳定性。荧光猝灭结果为吲哚供体基团与配位汞相互作用提供了支持数据。这项研究的结果表明N含羧酸、咪唑或吲哚基团的端侧链残基可参与稳定二硫代汞(II)配合物。这些关于外周汞-肽相互作用的结构见解提供了对肽中侧链供体基团的汞化学(II)的额外理解。

1.介绍

双半胱氨酸序列存在于许多金属蛋白中，在金属解毒、调节、稳态或转运中发挥重要作用。Cys-Xaa-Cys和Cys-Xaa-Xaa-Cys序列在各种类型的金属结合蛋白中都有发现，如金属硫蛋白[1，2], MerP [3.]及MerA [4], HAH1 [5]，以及Atox [6］．在这些金属-蛋白质结合中，与半胱氨酸残基的配合占优势。因此，人们设计了包含这些基序的小肽模型，以了解它们在某些金属酶中的生物学作用，并合理设计作为金属螯合剂的肽模型系统。例如，在MerP蛋白中发现的含有Cys-Ala-Ala-Cys序列的寡肽，保留了其重金属结合活性[7］．受限制的四肽，如Cys-dPro-Pro-Cys，也被设计来预组织两个半胱氨酸残基，以便它们的硫醇供体基团被定位为汞(II)配位的“锚”[8］．

虽然在金属蛋白的一级金属配位上，金属配位基团/原子的排列或预排列是非常重要的，但它们的稳定性或功能通常也与它们所在的环境有关。这些特征已在过渡金属配合物结合和活化二氧模型系统的设计原则中得到证实。例如，Borovik和他的同事设计了各种三足配体，其中包含围绕过渡金属离子的局部分子内h键网络[9- - - - - -11］．

多肽的模块化特性使其在提供各种可能类型的非共价分子内局部相互作用方面具有广泛的用途，这可以增强金属-多肽结合的稳定性。因此，具有稳定局部环境或金属配位位点的侧链双半胱氨酸肽的分子设计可能具有有利的协同结合效应。序列类型为Xaa-Cys-Gly-Cys的双半胱氨酸四肽具有采用II型的内在倾向β词。在这类肽的反转结构中，它通常以甘氨酸作为从四肽主链的氨基末端的第三个残基;180°的转变涉及到第一个残基的羰基氧和第四个残基的氨基氢之间的氢键[12］．因此，四肽Xaa-Cys-Gly-Cys可以在空间上将半胱氨酸硫酸酯基团定位在肽turn结构的同侧，结合“软”金属离子，如汞(II)。它的N-末端残基提供了定位潜在供体基团的机会，如色氨酸的吲哚侧链，它既富电子又具有H供体(13］．有充分的证据表明，这种芳香π-基团可以参与各种类型的阳离子-π相互作用或屏蔽配体金属对抗配体交换或氧化[14- - - - - -20.］．另外，非质子化的咪唑N_即时通讯在组氨酸中是一种强金属配位配体，众所周知在锌的螯合中有“锌指”[21］．动态稳定的汞(II)配合物可用于各种应用，包括废水的有效处理、汞吸附剂的再生和汞螯合治疗。了解汞离子如何与含有辅助给体基团的半胱氨酸肽形成配合物，可以为最佳的汞固定化提供有用的见解。

之前，我们报道了三肽配体(Cys-Glu-Cys)中的谷氨酰基羧酸基团和五肽(Gly-Cys-Trp-Cys-Gly)中的色氨酸吲哚基团如何影响汞络合物的形成及其相对稳定性[22，23］．为了继续这项工作，这项研究的具体目的是了解如何接近N-端氨基酸侧链，由O-，N-，H,或π-供体，可能有助于包含Cys-Gly-Cys反转基序的四肽复合物的稳定性。因此，Xaa- cys - gly - cys四肽，其中Xaa是甘氨酸(控制肽)，谷氨酸，组氨酸，或色氨酸(图1)，并与氯化汞反应。采用光谱方法研究了与汞(II)相互作用后的配位性质和肽骨干折叠趋势。采用电喷雾质谱(ESI-MS)对离子态形成的配合物进行了化学计量学表征。通过分子建模比较了各二硫代汞(II)肽配合物的优化结构。用荧光光谱法研究了吲哚基与汞(II)配位的邻近性。这项研究的结果将提供一些见解，在捐赠团体(s)在N-末端残基可能参与汞(II)络合或整体络合物稳定。

2.材料和方法

2．1．材料

Fmoc- cys (Trt) (Wang Resin LL)-resin(其中Fmoc为芴甲基氧羰基，Trt为三苯基甲基)，1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAT)，O(7-azabenzotriazol-1-yl)N，N，N”,N' -六氟磷酸四甲基铵(HATU)和fmoc -氨基酸购自Novabiochem公司(San Diego, CA, USA)。乙酸乙酯(羟亚氨基)(Oxyma Pure)和Fmoc-His (Boc)购自CEM, Corporation (Matthews, NC, USA)。Collidine (2,4,6 -trimethylpyridine, TMP)，三异丙基硅烷(TIS)， 3,6 -二氧杂- 1,8 -辛二硫醇(DODT)，三氟乙酸(TFA)，二异丙基碳二亚胺(DIPCDI)，二氯甲烷(DCM)和氯化汞(II)从Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)获得。汞化合物是危险的，应在指定的化学废物容器中处理。HPLC级水和乙腈、无水醚和N, N-二甲基甲酰胺(DMF)购自Fisher Scientific公司(Pittsburgh, PA, USA)。分析和半制备反相C-18高效液相色谱柱(双子座:300 Å， 5µm)购自Phenomenex, Inc. (Torrance, CA, USA)。

2．2．四肽的制备

四肽(图1)通过微波辅助固相多肽合成，采用标准fmoc策略，使用CEM Discovery微波多肽合成器(CEM, Corp, Matthews, NC, USA)，正如我们的小组先前为类似多肽所描述的[22，24］．HPLC条件为0% B ~ 30% B，流速1 mL/min, 30 min，溶剂a为HPLC H₂O为0.1% TFA溶剂，B为0.08% TFA溶剂的乙腈。四肽的保留时间分别为9.7 min、10.9 min、9.6 min和21.9 min。通过半制备高效液相色谱纯化，这些肽在>纯度为95%，总收率分别为60%、58%、59%和43%。用ESI质谱对纯化的多肽GCGC(分子质量为338.07 g/mol)、ECGC (410.09 g/mol)、HCGC (418.11 g/mol)和WCGC (467.13 g/mol)进行了表征。它们的[M+H]观测到的质量⁺离子对应的计算值分别为339.08、411.10、419.11、468.14S1）.

2．3.紫外可见分光光度法

肽库存溶液制备在HPLC级水，先用氩气脱气和吹扫。肽浓度由214或280 nm的紫外吸光度测定[25］．每一种四肽溶液用盐酸滴定₂在pH为7的50mm磷酸钠中。在岛津UV- 2401pc系列双束紫外-可见分光光度计上获得了滴定反应混合物的紫外吸收光谱。在室温下用1cm径长的石英试管测量。由50或100组成的2.5毫升溶液µM肽用50 mM盐酸等量滴定₂在同一缓冲液中准备的备用溶液。将反应混合物搅拌1分钟，然后再进行2分钟的平衡。配体金属电荷转移(LCMT)带的形成与汞的结合^２＋对硫代酸盐在200 nm处进行测量。测量每个最终反应混合物的pH值，pH值在0.05 pH单位6.6以内。

２.４.LTQ轨道rap质谱分析

样品在Orbitrap仪器上进行分析，该仪器是Thermo Fisher Scientific LTQ Orbitrap XL质谱仪(Thermo Fisher, San Jose, CA)，如我们之前的研究所述[22］．多肽与Hg(II)的配合物是通过在5 mM甲酸铵，pH 7的摩尔比为1:1的多肽溶液样品进行反应的。Hg(II)和四肽的浓度固定在7.5 × 10⁻⁵M。在Hg(II)和peptide反应45 min后进行分析。MS扫描是通过m / z125 - 2000的范围。每次样品注射获得200次扫描。通过将基峰的相对丰度设置为100%，并通过标记标记来显示ESI-MS光谱m / z每个同位素簇中最强峰的值。

2．5．圆二色性

CD光谱测量是在Jasco J-815圆形二色谱光谱仪(Easton, MD, USA)上进行的，如前所述，该光谱仪配备Peltier温控电池架(PTC-423 S/C) [23］．在25°C条件下，使用0.1 cm路径长度的石英电池记录光谱，参数如下:标准灵敏度= 100 mdeg;50 nm/min连续扫描模式;带宽= 1.0 nm;响应= 4秒;数据间距= 0.1 nm。肽溶液在50µM在50毫米磷酸钠pH 7。

2．6．荧光

荧光猝灭测量是在配备Peltier温控电池支架(SGL-POS QNW W/CIR)的FluoroMax分光荧光仪(Horiba Scientific, NJ, USA)上进行的。色氨酸发射荧光在HgCl浓度增加的存在下被测量₂．荧光光谱用10µM肽溶液在一个3ml石英细胞，有一个路径长度1厘米。将5 mM的氯化汞原液加入肽中，加入50 mM的磷酸钠，pH为7。激发波长设置为280 nm，发射光谱记录在290 ~ 500 nm之间。激发和发射狭缝宽度固定在3 nm。扫描速率为1 nm/s。可变温度Stern-Volmer图分别在25°C、35°C和45°C进行。

2.7。计算模型

使用Macromodel 11.9中实现的system pseudo-Monte Carlo Multiple Minimum (SPMC)搜索方法探索每个Hg(II)-肽配合物的构像空间[26使用OPLS2005力场。OPLS2005分子力学力场中没有汞的参数(II)。锶(II)的参数可用于力场，并作为汞(II)的替代品进行了测试，因为电荷相同，尺寸相似。结果表明，力场生成的锶(II)结构与最终生成的汞(II)结构变化不大。因此，在构象搜索时，先用锶(II)代替汞(II)，然后在后续步骤中再用汞代替。每个配合物生成10万个构象并进行相似度测试。通过M06-2X/LANL2DZ单点真空能量计算，对OPLS2005最低能量在100 kJ/mol以内的结构进行了进一步评价。50个M06-2X/LANL2DZ能量最低的结构进入了几何优化阶段和高水平能量评估，如下所述。

采用M06-2X密度泛函理论方法结合6-31G (d, p)基础集的多肽原子和斯图加特/德累斯顿(SDD)基础集优化Hg(II)-多肽复合物的几何形状[27为汞原子的60个核心电子提供赝势。我们和其他人应用了M06-2X方法，获得了多肽和Hg(II)多肽配合物的质量几何形状[22，28，29］．与我们之前的研究一样，单点能量计算是使用MP2 (full)，在肽原子上以6-311G (d, p)为基础，在汞原子上以cc-pVDZ-PP为基础[22］．除了使用范德华球大小为2.34 Å的汞原子外，所有的计算都使用IEFPCM (SMD)溶剂化模型来模拟水环境。利用理论的几何优化水平确定振动频率，以确保所有优化的配合物在没有假想振动频率的情况下都是最小的。

利用溶液中的吉布斯能(G_溶液)用(1)，如前所述[23］．所有的M06-2X和MP2计算都使用了Gaussian09软件[30.］．

3.结果与讨论

3．1.双半胱氨酸四肽的设计与合成

双半胱氨酸四肽(图1)通过微波辐照固相多肽合成，遵循标准的fmoc策略，如前所述的类似化合物[22，24］．他们的序列被设计成具有采用共性的倾向β-转包含四种氨基酸[12］．谷氨酸、组氨酸或色氨酸，由O-，N-，H——或者π-供体分别被选为N终端的氨基酸。其甘氨酸类似物为评价这些供体基团如何参与肽转化结构和复合物的形成提供了参考化合物。粗肽经半制备高效液相色谱(HPLC)纯化至95%以上纯度，ESI-MS分析证实了预期的分子质量。

3．2．紫外可见分光光度法

通过监测中紫外能量范围内S—Hg键的配体-金属电荷转移(LMCT)跃迁，研究了汞(II)与各四肽之间络合物的形成。LMCT带是通过减去在没有汞的情况下肽的背景光谱(II)来测量的。数字2(一个)的吸收差谱GCGC随着摩尔当量的增加，滴定(II)。以约210和220 nm为中心的吸收带稳定增加，直至一个汞当量(II)，表明形成了一个与肽化学计量比为1:1的络合物。210 nm吸收差带的变化反映了肽酰胺吸收的变化(n来π ）随着肽主链结构的变化GCGC结合汞(II)。约220 nm吸收肩带的消光系数为11560 M⁻¹厘米⁻¹在1:1汞(II)至GCGC化学计量学(图2(一个)插图)。这与先前报道的线性双硫代汞配合物的值一致，该配合物在约220 nm处表现出高能LMCT波段的特征[8，23，31］．当汞(II)过量时，210和220 nm处消光系数的增加速率发生变化。这些新的转变可能表明多金属汞种类的形成，如我们以前的工作和其他人所指出的[8，23］．

与汞(II)的结合也观察到类似的趋势ECGC和HCGC．它们在约220 nm处有一个吸收带，消光系数为11560和11660 M⁻¹厘米⁻¹分别(图2 (b)和2 (c)）.相比之下，在220 nm处的消光系数WCGC显著降低(5780 M⁻¹厘米⁻¹)(图2 (d)）.随着汞(II)的增加，在~ 227 nm处出现了新的最大吸光度带。正如先前由其他人所建立的B_b色氨酸吲哚环在220 nm附近的吸收带减弱并发生红移π电子与阳离子相互作用[17，32，33］．例如，Okada和Miura报道了Ctr4NT (Ctr4的模型肽，裂变酵母的铜转运蛋白)在结合Cu(I)时的吸收光谱变化。他们注意到，Cu(I)结合肽谱减去自由肽谱在220/232 nm处有一对负/正峰，这是一个诊断红移B_b表示吲哚的带π阳离子相互作用[17］．的吸收差谱中WCGC(图2 (d))， 220/227 nm处的一对最小和最大吸收带与红移一致，表明其吲哚基团可能参与了某种类型的阳离子-π交互。我们以前曾报道过模型五肽的类似光谱变化，其色氨酸吲哚基团可以与汞(II)或铵离子相互作用[23］．

3．3.电喷雾电离质谱法

通过ESI-MS验证了汞-肽复合物的形成。分析了含等摩尔汞(II)与肽比的反应混合物。数字3.显示了四肽及其汞加合物的源光谱。四肽检测到的主要汞(II)配合物对应于1:1的汞肽配合物。数据3(一个)- - - - - -3 (d)插图显示，主要1:1汞肽加合物的实验汞同位素模式与计算的同位素模式吻合良好[34］．它们表现出标志性的同位素模式，这是一致的七个自然发生的同位素汞和它们的自然丰度。的m / z每一个1:1汞肽加合物的值对应于双去质子化，可能从两个硫醇基团形成硫代酸盐，然后作为配位给体基团形成各自的二硫代汞配合物。这些汞-肽配合物也与钠形成阳离子加合物⁺和/或K⁺．微量汞缩氨酸二聚体[1:2 Hg(缩氨酸)₂和2,2hg₂(肽)₂]和三聚体[3:3hg ._3.(肽)_3.也可检测为阳离子加合物。他们的m / z值也对应于与各自复合物相关联的每个汞的肽的双去质子化。

3．4．圆二色性

数据4(一)- - - - - -4 (d)显示了每一个四肽在0.2 mol / l的汞(II)滴定前后的CD光谱。免费的肽GCGC(图4(一)),ECGC(图4 (b)显示虚弱nπ -在约222 nm处有型过渡负带，在约200 nm处有弱正带，在约190 nm处有负带(ππ 转换)。数字4 (c)的CD谱HCGC，在230 nm和192 nm处出现两个低幅度的负波段。相对疏水性更强的肽，WCGC在约225 nm和197 nm处有两个正极带，在约214 nm处有一个负极带4 (d)）.这些CD波段强度相对较低(小于±2 × 10)⁴度米⁻¹厘米⁻¹)表明这些自由的四肽具有很少的二级结构，不形成任何占优势的预先组织的转折构象。但随着汞(II)浓度的增加，它们的CD光谱增强，在210 nm处出现正波段，在193 nm处出现负波段。这些CD谱类似于一个肽主链反转，对应于一个β-turn类型，使人联想到B级CD频谱[35］．伍迪等人的理论计算预测，这种转弯类型的特征是在200 - 210 nm之间有一个强烈的正带(nπ 转变)，以及180 ~ 190 nm的强负带(ππ 转换)35］．如图所示4(一)- - - - - -4 (d)，每个肽-汞复合物都表现出相应的强CD信号β词的类型。这个肽链的反转可以定位N-末端侧链基团靠近汞(II)配位，参与复杂稳定。

数字4在210 nm处的正椭圆度和193 nm处的负椭圆度均有所增加，这与溶液中汞(II)的浓度呈线性相关。这些光谱还在约200 nm处显示了一个等二色点，表明在与汞(II)滴定至1 - 1摩尔当量比后，转变为普通二级结构。然而，当汞(II)过量时，CD带的强度减弱。如在其相应的紫外光谱中观察到的3．2)，这可能是由于多金属物种的形成，导致结构完整性的丧失。

在等摩尔汞(II)存在下，WCGC约为235 nm的弱负带(图4 (d)底部插入显示放大视图)。Yorita等人早些时候报道了一个类似的发生在223 nm的负CD带，该带被描述为Cu(II)- trp阳离子的特征CD带π互动(36］．此前，我们也报道了Hg(II)-Trp相互作用的类似观察结果[23］．基于这些比较和吲哚的紫外光谱变化B_b过渡区间WCGC(部分3．2的吲哚组WCGC可能正在接受一个假期π相互作用，虽然它可能是一个微弱或短暂的相互作用，基于相对较小的负CD信号。

3．5．色氨酸荧光光谱

数字5的荧光发射光谱WCGC随后用汞滴定(II)。加入等量的汞(II)后，约70%的本征荧光被猝灭。色氨酸中吲哚基团的荧光对极性变化和非共价相互作用(如阳离子-)非常敏感π与金属或铵离子有关的缔合[18，37- - - - - -40］．它的荧光发射可以被汞(II)猝灭，通过形成络合物导致静态猝灭，或扩散碰撞导致动态猝灭[41］．动态淬火是一种扩散控制过程，由于扩散速度快，在较高的温度下会增加。相比之下，较高的温度通常会降低静态淬火，这是由于弱结合复合物的解离[42］．因此变温荧光猝灭WCGC由汞(II)可用于测量任何汞(II)-吲哚-的强度π交互。数字5(插图)为荧光猝灭的Stern-Volmer图WCGC通过汞(II)在25°C, 35°C，和45°C。这些图显示了向上的曲率，这是通过复杂的形成和扩散碰撞的荧光猝灭的特征。但温度依赖性猝灭程度较低，表明色氨酸吲哚参与阳离子-π与配位汞的相互作用。这种相互作用可以稳定汞-肽复合物，并可能为二硫代汞提供疏水屏蔽效应。

3.6。计算研究

为了理解N1: 1的汞(II)-多肽配合物在水溶液中的结构稳定性可能与-末端侧链基团有关，本文对1:1的汞(II)-多肽配合物的稳定性进行了优化和评价。数字6结果显示了M06-2X/6-31G (d, p)/SDD优化后的三个最稳定结构。所有四肽都处于两性质子化状态，半胱氨酸巯基和谷氨酸羧酸基被去质子化。表格1提供一些用于确定的热力学值G_溶液（1)为图中的每个复合6．坐标和选择高斯输出信息的所有结构在图中6的补充资料(表格S1）.

3.6.1。1:1 Hg(XCGC)配合物

稳定的1:1复合物(图6)是由两个S-Hg - s键(~ 2.40 Å)形成的，S-Hg - s键的角度是线性的(167°-178°)。配合物的另一个常见结构特征是第二肽羰基氧与二硫代汞之间的O- Hg相互作用(~ 2.7 Å)。所有这些优化的结构显示出aβ肽键之间以及肽键之间的分子内氢键也可以稳定N终端和铵C终端羧酸盐组。上述结构特征在每个络合物中都得到了很好的体现，尤其是Hg(GCGC)复合体没有N-末端氨基酸侧功能(图6(一)）.

表格1提供了溶液中的热力学值和吉布斯能(G_溶液)，如图所示6．由于计算的是相对能，而不是络合能，热力学比较仅限于优化的汞配合物与相同的肽。根据溶液吉布斯能，Hg(GCGC)-1比Hg(GCGC-2和3.3 kJ/mol / Hg(GCGC) 3。这个能量范围很小。当考虑电子MP2能量与零点振动能量(ZPVE)之和时(ΔH₀，用表中的数据计算0 K时的焓变1)、Hg (GCGC-2比Hg(GCGC)-1 × 78 kJ/mol和Hg(GCGC)-3比Hg(GCGC)-1 × 42 kJ/mol。Hg (GCGC-1的溶剂化吉布斯能最大为负，表明其稳定性主要来源于良好的溶剂化作用。内在的稳定性，通过ΔH₀Hg, (GCGC-2可能是由于两个氧原子C-末端羧酸盐参与分子内相互作用(O- Hg和O- HN)。

数字6 (b)显示了优化的Hg(ECGC)复合物。谷氨酰基在N-端，去质子化的谷氨酸基团对二硫代汞和铵基团具有亲和力。这种柔性侧链羧酸O给体与配合汞相互作用，在汞中O- Hg的距离为2.68 Å (ECGC)-1和2.54 Å (ECGC) 3。或者，氢键与N-末端铵基，使C-末端羧酸氧与硫代汞相互作用[Hg(ECGC) 2)。虽然O-供体对汞(II)的亲和力较低年代-供体，这些优化的结构表明它们可以提供辅助结合稳定硫代汞。根据溶液吉布斯能，Hg(ECGC)-1比Hg(ECGC)-2和6.0 kJ/mol / Hg(ECGC) 3。从ΔH₀Hg (ECGC)-1比Hg(ECGC)-2和27 kJ/mol / Hg(ECGC) 3。Hg(ECGC)配合物在谷氨酸羧酸盐与汞相互作用时最大。Hg (ECGC-1的溶剂化吉布斯能也最低，表明其稳定性主要来自谷氨酸羧酸盐与汞相互作用的强度。

Hg(HCGC)配合物如图所示6 (c)．这些结构表明N-末端组氨酸侧链基团也很灵活，通过N加强肽转结构，有助于复合物的稳定性_即时通讯-H- O的氢键C-端羧酸基[Hg(HCGC1)和Hg (HCGC) 2]。这个氢键和C-端羧酸氧比N_即时通讯-H与第一个肽键形成氢键，如Hg(HCGC) 3。这些结果表明N-末端组氨酸基残基可通过分子内氢键作用稳定肽链结构。根据溶液吉布斯能，Hg(HCGC)-1在Hg(HCGC)-2，比Hg(HCGC) 3。从ΔH₀Hg (HCGC-2在Hg(HCGC)-1和30 kJ/mol / Hg(HCGC) 3。当咪唑的N-H氢与氢键相互作用时，配合物的稳定性较好C端羧基。当N-H取代咪唑与N-terminal amide羰基氧(Hg(HCGC) 3)。

数字6 (d)显示肽的优化结构WCGC，含有吲哚π供体组。在复杂的Hg (WCGC)-1从吲哚苯并环中得到的半胱氨酸基β碳的氢为2.80 ÅWCGC) 3 .他们的差距是2.67 Å。这些C_β- h和吲哚-π相互作用使吲哚环屏蔽了配位位点的一端，而二硫代汞还被两个o给体稳定下来，一个是酰胺羰基和一个C终端羧酸盐。为了确定从观测到的C_β-H和吲哚相互作用，通过进行自然布居分析(NPA)预测原子电荷[41利用气相单点计算得到的MP2密度来计算这些汞配合物。半胱氨酸C_β指向吲哚环的-H键比另一个C键具有更强的极性_β- h键,C_β电荷为- 0.49,H电荷为+2.2。这表明观测到的C_β-H和吲哚相互作用与确定的极化C-H相互作用相似π相互作用，一种弱的类似氢键的相互作用，通常记录在蛋白质中[19，20.，并鉴定为金属配体阳离子-π某些金属蛋白的相互作用[43，44］．Hg (WCGC-2配合物中，吲哚环与汞的距离为3.27 Å，与环氮旁边的熔融碳的距离为3.27 Å。在这种情况下，吲哚环可以通过阳离子-参与稳定配合物π互动(14，15，如本节所述的光谱研究所示3．2，3．4,3．5．因此，可以认为汞(Hg)中柔性侧链吲哚基团WCGC)配合物可作为硫代汞的疏水屏蔽物。根据溶液吉布斯能，Hg(WCGC-1比Hg(WCGC-2和3.5 kJ/mol / Hg(WCGC) 3。使用H₀Hg (WCGC-2比Hg(WCGC-1和1 kJ/mol / Hg(WCGC) 3。该体系的吉布斯能范围很小(3.5 kJ/mol)，且每种结构的溶剂化吉布斯能相差几乎相同(1.3 kJ/mol)。吲哚环与N终端Cys-C_β-H和汞也具有几乎难以区分的固有稳定性。此外，涉及吲哚pi体系的电子相互作用影响了配合物的稳定性，因为它们存在于三个低能结构中的每一个。

4.结论

通过结合光谱和理论研究，我们对汞(II)与4个含Cys-Gly-Cys基序的四肽结合的结构有了一些了解O-，N-，H -或芳香π供体组。紫外-可见光谱和ESI-MS研究表明，汞(II)与这些肽的半胱氨酸硫代酸盐结合，形成主要的1:1二硫代汞配合物。CD谱数据表明，这些四肽不采用预组织的turn结构。然而，汞(II)结合容易诱导倒转的肽主链结构。色氨酸的紫外-可见吸收和荧光猝灭表明色氨酸的吲哚环WCGC能否参与汞阳离子-π交互。优化后的1:1汞化四肽的稳定结构证实了上述光谱结果，表明每个汞肽配合物都是由分子内氢键稳定的反向二级结构。他们还表明侧链供体组存在于N-末端残基具有柔性，可通过O- Hg、氢键、C-H-等方式稳定配位汞或其局部环境π，或汞阳离子π交互。此外，吲哚环可以作为配位汞的疏水屏蔽层。这项基于肽模型的研究表明，含有一个或多个供体基团的氨基酸侧链可以作为辅助结合基团，增强汞的固定化(II)。

数据可用性

用于支持本研究结果的质谱和计算数据包括在补充信息文件中。

的利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

作者的贡献

M. ng - schwemlein负责项目的概念化和管理、资金获取和原始草案的准备工作。梅尔负责计算工作，并为计算部分编写原始草案。J. Mazlo与M. nu - schwemlein共同进行了ESI-MS研究。E. Springfield在M. ngug - schwemlein的指导下完成了一些光谱研究。A. Willis在J. Merle的指导下从事计算机研究。

致谢

作者承认了来自格林斯伯勒北卡罗来纳大学三合质谱分析设施的丹尼尔·托德关于仪器设置的有益建议。美国国家科学基金会(批准号:CHE-1831020)支持这项工作。

补充材料

图S1:所有四肽的ESI-MS谱图。表S1:提供了建模研究中所有结构的笛卡尔坐标(Å)。（补充材料）

参考文献

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