文摘

客观的。为了研究PM2.5对扩散的影响,细胞周期、细胞凋亡和潜在机制的人类角化细胞细胞系HaCaT。方法。HaCaT与不同浓度的PM2.5悬浮细胞治疗24小时。细胞生存能力是CCK-8检测到的方法。细胞周期分布和凋亡被流式细胞仪检测。微阵列分析被用来找出微阵列基因表达分析;数据处理包括基因富集和路径分析。免疫印迹进行验证的关键途径和监管机构的微阵列分析。结果。细胞活性降低,细胞周期与PM2.5浓度的增加显著地抑制。同时,进行基因表达微阵列分析,我们确定541年PM2.5-treated调节基因和935个表达下调基因HaCaT细胞。实时qPCR和免疫印迹证实,PM2.5治疗可能引起ABCA1的表达而抑制END1 CLDN1。结论。我们的研究结果表明,PM2.5可能通过调节细胞凋亡和细胞周期阻滞ABCA1, END1, ID1,人类HaCaT细胞和CLDN1-mediated通路,奠定了良好的基础为后续药物干预和药物开发对皮肤损伤造成的PM2.5曝光。

1。介绍

世界卫生组织(世卫组织)报告说,空气污染是一个世界上最大的环境健康风险因素。空气污染是一个异构的化学物质和固体颗粒的混合物。周围颗粒物质(pm)是空气污染的一个主要组成部分。经前综合症,特别是粒子在纳米尺度范围内,风险因素的主要原因(1]。2.5环境颗粒物(PM2.5)是空气污染物的主要组件之一,它可以吸收许多多环芳烃和金属(2]。

空气污染引起的呼吸道和心血管疾病的发病率和死亡率可以追溯到1950年代。长期接触PM2.5是一个潜在的危险因素各种疾病包括癌症和心血管和呼吸道疾病3- - - - - -7]。皮肤提供了一个防御的主要空气污染物(8,9),可引起人体皮肤损伤和加剧事先存在的皮肤疾病,如红斑、增生,皮肤老化,过敏性皮炎,致癌作用[10- - - - - -12]。然而,PM2.5的影响对人类皮肤的功能及其生物学意义仍在皮肤内稳态非决定性地理解。以前,我们演示了暴露PM2.5与皮肤损害像老年雀斑13]。在这项研究中,我们关注HaCaT细胞增殖和细胞凋亡在PM2.5的挑战和利用基因微阵列分析来确定上游监管者和发现与炎症反应相关的基因参与PM2.5-stimulated HaCaT细胞凋亡。

2。方法和材料

2.1。主要试剂和设备

HaCaT细胞(皮肤,北京大学人民医院,北京大学医学院第二临床学院),PMI1640介质(美国σ),胰蛋白酶(美国Gibco),胎牛血清(上海酶联生物科技有限公司),兔子反il - 1和il - 6的单克隆抗体,辣根peroxidase-labeled山羊anti-rabbit免疫球蛋白(美国CST)试剂盒试剂,用rt - pcr试剂盒(美国表达载体)。高速冷冻离心(美国贝克曼),恒温有限公司2孵化器和ABI7900实时PCR仪(美国ABI)。

2.2。方法
2.2.1。制备PM2.5浑浊的液体和颗粒治疗

交界处东二环路东三环路上,我们收集空气样本是20米的建筑冬季供暖期间(从12月到1月)。hy - 1000智能流量大TSP采样器(可选PM2.5铣刀,青岛恒源科技发展有限公司有限公司)是用于石英滤波器采样。平均流量被设定为1000升/分钟,每个样本连续收集了24小时。石英膜平衡在恒定的温度和湿度条件下了24小时。然后,过滤器是切成大约1厘米2消毒手术剪刀,沉浸在75%乙醇,紧随其后的是超声波震动在水浴60分钟洗提粒子,然后加了冰保持水温低于20°C。在生物安全柜,洗出液过滤成多元化与70年的玻璃碗μm过滤器、紫外灯是用于杀菌。大部分乙醇挥发性后,洗出液真空干燥24小时,之后样本的重量。无菌水被用来准备一个高浓度原液是储存在−20°C。上述过程处理毒理学房间的环境与健康相关产品安全研究所的中国疾病预防控制中心。

2.2.2。细胞培养和细胞计数Kit-8 (CCK-8)

HaCaT细胞培养在5%的股份有限公司2在37°C在常规杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)(英杰公司有限公司)包含1.8毫米Ca2 +或与DMEM (Gibco,生活技术,卡尔斯巴德、钙、美国)在低浓度的CA2 +(0.07毫米)。媒体都是补充heat-inactivated 10%胎牛血清,谷氨酰胺(2毫米),青霉素(100 U /毫升)(Euroclone)和链霉素(100毫克/毫升)(Euroclone)。细胞与不同浓度的PM2.5(50刺激μg / ml, 100μg / ml, 200μ克/毫升和400μg / ml)在HaCaT细胞24小时和48 h。在96孔板细胞被播种密度为2.0×103细胞每口井。每个样本重复五次。然后,细胞增殖测定使用CCK-8 (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)播种后5天。总之,CCK-8的解决方案是添加到每个在37°C和孵化4 h根据制造商的协议。这之后,光密度(OD)值在450 nm决心使用标(Tecan无限、Mannedorf、瑞士)。

2.2.3。微阵列分析

HaCaT细胞治疗200 ug /毫升PM2.5,收集和未经处理的HaCaT细胞微阵列分析,微阵列基因表达分析和数据处理。

(1)RNA制备及质量控制。从培养HaCaT细胞总RNA提取纯化试剂盒和使用RNeasy RNA提取工具。质量控制中提取RNA后来验证热Nanodrop 3000和安捷伦2100生物分析仪利用安捷伦RNA 6000纳米设备。总RNA将进行微阵列分析,直到符合下列标准:1.8 < A260 / A280由热Nanodrop 3000年< 2.0,RIN > = 7.0和28 s / 18岁> 0.75通过安捷伦2100生物分析仪。

(2)微阵列处理和数据分析。Affymetrix 6 GeneChip微阵列(901838)杂化了三双样品来确定基因表达谱的控制和治疗样本根据制造商的指示。最后,原始数据导入到R (http://www.r-project.org),并分析了Bioconductor affy包(http://www.bioconductor.org)。对数(基础2)强度RMA获得的措施。强度转换为nonlogarithmic价值观和新通过调整意味着强度在400年每个数组。单元文件和RMA值是沉积在基因表达综合(http://www.ncibi.nih.gov/geo/)。

(3)识别差异表达基因(度)。Limma包用于规范化芯片原始数据,和基因(log2fold变化)> = 2 表明两组之间存在统计上的显著差异。

(4)浓缩度的分析。在线功能注释工具,大卫(http://www.abcc.ncifcrf.gov),被用来执行度GO-BP功能富集分析,与阈值的 。通过使用KEGG(通路富集分析http://www.kegg.jp/Kegg/pathway.html)和Reactome (http://www.reactome.org)数据库。 被选为阈值。

(5)通路和网络分析。显著的过表达或表达下调基因的列表了Affymetrix探针组id,褶皱变化,p价值观上传到独创性通路分析(IPA)工具(http://www.ingenuity.com)。每个克隆标识符映射到相应的聪明才智通路中的基因对象知识库(IPKB)。这些关注基因被用于构建生物网络,使用“音标”核心分析功能。开始构建网络应用程序查询IPKB专注基因与其他基因之间的交互对象存储在知识库并生成一组网络。每个生成的基因相互作用都有支持网上文献的研究结果。音标然后计算得分为每个网络的适应用户的重要基因。比分是来自 价值,指出重点基因网络的可能性被发现一起由于随机的机会。分2表明,1 -在- 100有可能重点基因在一起网络中由于随机的机会。因此,分数2或更高版本至少有99.5%的信心不是由随机生成单独的机会。

2.2.4。免疫印迹

总蛋白从细胞中提取和量化。跨膜电泳后执行。与5%脱脂牛奶为1.5 h,阻塞后膜与初级孵化兔子反il - 1单克隆抗体,il - 6和GAPDH (1: 1000;猫号:# 12703,# 12153,# 8884;细胞信号技术,丹弗斯,美国马)一夜之间在4°C。洗后TBST三次,每次5分钟,膜与辣根孵化peroxidase-labeled山羊anti-rabbit二级多克隆抗体免疫球蛋白(1:2000;猫号:A0208 Beyotime生物技术,中国上海)在37°C 2 h。洗后用TBST三次,每次10 - 15分钟,颜色开发执行和信号检测。GAPDH作为内生控制。

2.2.5。实时聚合酶链反应

PCR反应是使用实时PCR反应系统的工具包执行10μl。PCR反应条件如下:95°C 10分钟,其次是35周期95°C的30年代,30年代59°C, 72°C 25。在这项研究中,罗氏384实时PCR扩增仪是用来进行实时荧光定量PCR反应与GAPDH内生控制。使用ΔΔCt数据处理方法,为每个样本和三个复制集。

2.2.6款。流式细胞术

使用流式细胞仪细胞周期和细胞凋亡测定。总之,细胞被播种在6厘米菜隔夜confluency 80%。然后,细胞使胰蛋白酶化,用预冷D-Hanks (pH = 7.2 - -7.4)缓冲区,在4°C和75%乙醇固定1 h。这后,细胞被沾propidium碘(π50 (PI)解决方案μ200 g / mL和核糖核酸酶μg / mL, Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)在RT在黑暗中30分钟,然后分析使用一个番石榴®easyCyte流式细胞分析仪(美国微孔,Billerica的)。每个实验进行了一式三份,计算平均值作为最终结果。

3所示。结果

3.1。PM2.5对细胞活力的影响,细胞周期和细胞因子的分泌

刺激与不同浓度的PM2.5(50微克/毫升,100 ug /毫升,200 ug /毫升,和400 ug /毫升)在24小时和48 h HaCaT细胞,细胞活性降低了PM2.5浓度的增加(图1(一))。刺激与不同浓度的PM2.5(50微克/毫升,100 ug /毫升,200 ug /毫升,和400 ug /毫升)在24小时和48 h HaCaT细胞,细胞周期与PM2.5浓度的增加显著抑制(数字1 (b)和1 (c))。细胞凋亡HaCaT细胞24小时和48 h PM2.5治疗后显微镜下观察(数字1 (d)和1 (e))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
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(e)
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(f)
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(g)
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图1
(a)刺激与不同浓度的PM2.5(50微克/毫升,100 ug /毫升,200 ug /毫升,和400 ug /毫升)在HaCaT细胞24小时和48 h,细胞活性降低了PM2.5浓度的增加。(中)与不同浓度的PM2.5刺激(50微克/毫升,100 ug /毫升,200 ug /毫升,和400 ug /毫升)在24小时和48 h HaCaT细胞,细胞周期与PM2.5浓度的增加显著地抑制。(f, g) HaCaT细胞24小时和48 h PM2.5治疗后显微镜下观察。 。
3.2。确定了PM2.5 HaCaT细胞差异表达基因

来解读机制PM2.5-induced HaCaT细胞周期阻滞和细胞凋亡,我们进行基因表达微阵列分析和识别1476个差异表达基因(度)在200年μg / ml PM2.5-treated HaCaT细胞和控制细胞。541年HaCaT 1476度调节细胞PM2.5刺激后,在935个基因表达下调(数字2(一个)和2 (b))。聪明才智典型路径分析表明炎症响应通路被管制的PM2.5-treated HaCaT细胞,如il - 10,引发和NF -κB信号(图2 (c))。选择不同治疗组的差异基因出来网格算法选择基因下游有明显变化(ABCA1、ACPP BBX, CD44,背景,到,CLDN1, CTNNB1, EDN1, ERBB3, FN1, F11R, GATA3, ID1、IFIT2, IFIT3, IGFBP3, IL1B, ITGA3, JAG1, MMP1、平台,PPARG, PSTPIP2, SERPINE1, SMAD6, SOCS2, sox9, STAT3,和TP53)和地图的基因网络,显示不同的治疗组之间的相互作用通过网格图(图的关系2 (d))。监管影响网络图展示了基因之间的相互作用和监管机构在数据集和函数。第一本条例监管网络效应分析表明,数据集可能是由于PLK2的规定,PLK4,小胡子,并通过ADM VGLL3, BASP1, CD44, CDH2, CITED2, COL12A1, CYP1B1, CYR61, EDN1, FN1, GADD45B, IFIT2, IL1B, MYOF, NAV3,平台,SERPINE1, SOX9、THBS1和其他基因对淋巴瘤有激活作用,发病率或死亡率,运动功能障碍,或运动障碍,抑制细胞的可行性肿瘤细胞系和微管动力学(图2 (e))。

(一)
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(b)
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(c)
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图2
(a, b) 541 1476度调节HaCaT细胞PM2.5刺激后,在935个基因表达下调。(c)独创性典型路径分析表明炎症响应通道管制在PM2.5-treated HaCaT细胞,如il - 10,引发和NF -κB信号。不同治疗组的差异基因选择出来网格算法选择基因下游明显变化。(d)基因网络,显示不同的治疗组之间的相互作用通过网格图的关系。(e)监管影响网络图展示了基因之间的相互作用和监管机构在数据集和函数。
3.3。验证PM2.5-Treated和控制HaCaT细胞之间的度

确定关键的监管机构在200年μg / ml PM2.5-treated HaCaT细胞,我们执行RT-qPCR验证差异表达基因。处理后200年μg / ml PM2.5, HaCaT细胞丰富的表达ITGA3, ABCA1, CD44, il - 1βMMP1、SERPINE1(图2(一个)),而EDN1和ID1(图的表达下调表达2 (b))。

3.4。度的PM2.5对表达的影响免疫印迹

我们进一步证实了度的表达在免疫印迹蛋白质水平。发现ABCA1的相对表达水平明显高于200年HaCaT细胞刺激μ24 h和g / ml PM2.5 ID1明显高于对照组(图3)。然而,留在END1的表达无显著差异,CLDN1, TP53 NRF2, il - 1β之间PM2.5-stimulated HaCaT细胞和对照组(图3)。

(一)
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(f)
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(h)
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图3
ABCA1 HaCaT细胞丰富的表达ITGA3, CD44, il - 1βMMP1、SERPINE1 EDN1和ID1的表达下调表达。

4所示。讨论

它已被广泛证明,PM2.5导致呼吸道疾病的发展(14]。然而,它对人体皮肤的影响尚未完全阐明。人们普遍认为有两个潜在通路PM2.5穿透皮肤表面:(1)通过毛囊或汗管和(2)穿过角质层15]。相信颗粒可以穿透barrier-disrupted皮肤(15,16]。即使在barrier-intact皮肤,PM2.5可以穿透几乎每个卵泡(图1)。此外,据报道,PM2.5降低皮肤屏障通过减少细胞角蛋白的水平,栏目,钙和紧密连接分子(12,17]。在barrier-disrupted皮肤,PM2.5可以穿透到皮肤层后重复应用(15]。然而,其生物学意义在皮肤内稳态并不完全理解(图4)。


图4
ABCA1的相对表达水平明显高于200年HaCaT细胞刺激μ24 h和g / ml PM2.5 ID1明显高于对照组(图所示4)。然而,留在END1的表达无显著差异,CLDN1, TP53 NRF2, il - 1β和对照组之间PM2.5-stimulated HaCaT细胞。

因为它的高表面积,PM2.5环境包含金属和多环芳烃(18]。多环芳烃可以激活芳基碳氢化合物受体(AhR),而金属可能产生ROS Fenton-like反应(19- - - - - -21]。Upregulation炎性细胞因子的细胞氧化应激增加的结果。之前的研究表明,治疗PM2.5上调il - 6的水平,il - 1α和肿瘤坏死因子-α角化细胞(mRNA生产22]。然而,准确的PM2.5对人类皮肤的功能的影响仍非决定性地理解。

长期高浓度的PM2.5可能导致毒性细胞并导致氧化应激,DNA损伤,突变,甚至癌症,而低浓度的PM2.5可能导致各种inflammatory-related基因的异常表达(1,23- - - - - -25]。有必要进一步探索遗传信息的改变,PM2.5通路细胞的刺激。我们收集PM2.5的供暖季节北京从2015年到2016年,准备暂停刺激HaCaT细胞。在随后的实验中,为了证明,即使在低剂量,我们仍然可以发现PM2.5的重大影响,我们用200 ug /毫升PM2.5治疗HaCaT细胞,然后进行了转录组分析细胞与PM2.5不治疗。我们发现许多基因如度、ITGA3, ABCA1, CD44, il - 1βMMP1、ACPP PSTPIP2、GATA3 SMAD6, EDN1, ID1、IGFBP3,平台统计上显著的微分表达式。这些基因在炎症和氧化应激等相关途径(26]。PM2.5可能影响细胞的功能,影响其他基因的表达,其中ABCA1是PM2.5密切相关。磷酸腺苷盒式A1 (ABCA1)主要的病原生物起源的一步讨论高密度脂蛋白(hdl) [27]。ABCA1的作用在其他系统中尚未报道。实际上,ABCA1据报道是一个在多个细胞通路激活炎症细胞和巨噬细胞等形成泡沫细胞(28]。内皮素1基因(EDN1)是一个家庭的三个内皮素,发挥他们的行动通过两个G-protein-coupled受体(29日]。作为著名的内皮中介,EDN1 vasoconstrictive行动和可能引起细胞增殖30.),而claudin 1 (CLDN1)与几位癌症的风险30.),这表明PM2.5可能影响船舶和癌症,但是这些基因和皮肤健康之间的机制需要进一步探索。

根据每个基因的差异表达转录组验证了芯片和蛋白质印迹,很明显,长期接触皮肤的PM2.5很容易产生各种基因的差异表达在其行动。异常表达不同的基因使细胞的微环境变化,促进细胞介导炎症变化,并进一步促进细胞癌症。同时,其分泌的细胞因子和炎症因子的边缘可能会影响周围的器官和组织由于表皮细胞损伤。定义每个基因的变化奠定了良好的基础为后续药物干预和药物开发。本研究的进一步应用提供策略对抗皮肤损伤造成的PM2.5曝光。

数据可用性

所有生成的数据或分析在这个研究包含在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

补充材料

补充图1。没有明显的PM2.5治疗后细胞周期的变化。(补充材料)