评价抗菌和伤口愈合的影响金纳米粒子现esculentus(l)水提物

文摘

背景。伤口愈合是一个复杂的过程取代坏死细胞与健康细胞和组织结构和组织。纳米技术已经越来越多地提出了小说作为一个平台来治疗伤口和皮肤再生。本研究的目的是评估抗菌、抗氧化、细胞毒性、皮肤伤口愈合phytosynthesized盟NPs使用活动现esculentus(秋葵)和合成非盟NPs使用柠檬酸合成方法。Ok盟NPs使用紫外可见吸收光谱等各种技术,红外光谱、x射线衍射(XRD)和透射电子显微镜(TEM)。皮肤的伤口上创建30大鼠,随机分为三组:治疗,两组治疗与Ch盟NPs盟NPs和Ok。每天的治疗进行了12天。峰值特征Ok盟NPs在538 nm紫外可见光谱。基于红外光谱的结果,各种功能等含氧集团羟基、羧基和含氮的组织观察。XRD证实了晶体性质的纳米粒子。好的非盟NPs的TEM图像显示一个球形形状和大小范围的75海里。非盟NPs潜力DPPH测试显示出类似的抗氧化剂。非盟NPs显示细胞生存方式存在剂量依赖的相关性,和这种技术被发现无毒。 Agar well diffusion, which is the method to determine antibacterial characteristics of Au NPs, showed a significant beneficial effect against a variety of bacterial species. In addition, histopathological results showed that Au NPs could accelerate wound closure. Therefore, Au NPs could be suitable for wound healing applications.

1。介绍

皮肤是身体最大的器官,作为第一个有效的防御外部环境。皮肤保护身体免受外源性生物和物质。皮肤伤口发生时,一系列积极的事件开始迅速,导致重大变化在免疫系统1- - - - - -3]。因此,理想的最重要的特征之一,伤口敷料从外源性生物消毒皮肤。在过去的20年里,各种新的伤口敷料含有抗菌药物开发。这些高级调料可以积极消除病原体感染的伤口,减少细菌的微生物污染水平,抑制再感染在治疗和外科敷料。有必要提到高微生物负载导致相当大的延迟伤口愈合和细菌生物膜发展的重要介质之一在慢性伤口4]。

近年来,很多注意力都集中在纳米科学和纳米技术。纳米技术涉及纳米尺度的可视化、处理和生产物质(5]。纳米粒子与不同大小、形状、化学成分有不同范围的应用程序(6]。各种方法,包括物理(脉冲,脉冲激光烧蚀、球磨方法,机械化学合成、和机械/高球磨技术)、化学(微乳液/胶体技术、化学还原法、电化学方法,solvothermal分解,和化学技术),和生物技术(植物提取、细菌、真菌和酵母)已经被用于合成纳米颗粒(7,8]。

在大多数的物理技术用于合成纳米颗粒,经验在还原剂的存在因素控制调节纳米颗粒组成和特征没有污染。金属离子的化学还原解决方案是最简单和常见方法用于他们的合成9]。物理技术的应用需要高成本,压力,温度。另一方面,大多数化学技术利用有毒和危险化学品危害生物系统和环境。生产的有毒产品的另一个问题是使用的化学技术。因此,似乎有必要找到一种非常有效和廉价的技术没有毒素和环境危害7]。

由于它的简单性、无毒性和成本效益,生物法合成纳米粒子被认为是最好的技术(10]。等化合物在植物提取物,植物化学物质,如类黄酮、酚醛树脂、维生素、氨基酸、多糖和减少代理,可能会形成纳米颗粒。纳米粒子合成的草药提取物不产生有害的化学物质。因此,他们可以广泛用于医学11,12]。纳米技术,纳米材料的功能打开了小说在伤口愈合阶段治疗建议的解决方案提高伤口愈合的速度(13]。两个主要的纳米颗粒通常用于伤口愈合:纳米粒子,具有基本特征帮助伤口关闭和纳米粒子作为药物运送路线。第一种纳米材料可分为金属和非金属纳米材料14]。金属纳米材料是目前纳米科学家产生更大的兴趣应用,如诊断和成像、药物传输、光动力治疗,组织工程,由于结构性质,他们的大小和形状,其抗氧化功能(15- - - - - -18]。

金纳米粒子(Au NPs)研究了伤口愈合等医学应用由于其化学性质,光学稳定性和表面易于修改。金纳米粒子、融合或伤口愈合之前需要与其他生物分子表面改性应用。例如,添加多糖肽盟NPs增强他们的力量来提高治疗(19]。

金纳米粒子作为抗氧化剂通过抑制自由基,如羟基、一氧化氮和过氧化氢20.]。黄金纳米粒子应用在皮肤伤口增加了检验,VEGF,胶原蛋白表达和降低MMP和TGF -β1水平[21]。金纳米粒子应用于癌症治疗,若,基因、药物输送、成像和生物相容性22]。此外,antibiotic-coated金纳米粒子掺杂PCL /明胶纳米纤维毡在全层伤口感染检查。它表现出减少细菌负荷和促进愈合23]。

纳米颗粒可以治疗伤口感染的应用由于其独特的性质。因此,研究人员试图发现一种替代治疗方法使用更安全的绿色植物等选项。植物性的合成纳米粒子稳定、快速、经济。此外,这些纳米颗粒可以合成不同形状和大小(24]。

现esculentus(秋葵)属于(l)锦葵科家庭,开花植物。它是一种草药用于治疗伤口愈合与各种有利的特性,包括抗氧化、抗菌、抗糖尿病的,antiplasmodial,镇痛,抗癌,止泻剂和抗炎属性(25]。秋葵果化学成分,包括皂苷、丹宁酸、生物碱和黄酮类。此外,秋葵水果槲皮素,作为一种抗氧化剂和抗肿瘤剂。它的抗氧化特性是通过抑制内皮细胞的迁移26]。皂苷是另一种活性剂在秋葵水果,发挥抗菌活性也刺激血管生成。此外,它表明,类黄酮,中介的III型胶原合成,作为抗炎剂,调节中性粒细胞的氧化破裂,充当一个磷脂酶抑制剂(27]。黄酮类化合物也减少活性氧(ROS)。因此,它可以加强伤口愈合(28]。在这项研究中,我们旨在合成和表征盟NPs使用秋葵提取和演示的皮肤伤口愈合效果非盟NPs(图1)。我们所知,没有报告应用绿色好盟NPs伤口愈合的目的就是这项工作的新颖性。

2。实验部分

2.1。材料

磷酸缓冲溶液(PBS),杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM) penicillin-streptomycin解决方案,胎牛血清,二甲亚砜(DMSO)和2 2 diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)获得Sigma-Aldrich(美国纽约)分析年级最大的纯度。新鲜的答:esculentus水果获得从山上科曼莎省(伊朗以西)。

2.1.1。植物提取物的制备

新鲜的秋葵与去离子水冲洗3次,干在烤箱30°C,由砂浆粉,然后获得粉1克是200毫升的水里煮20分钟,直到溶液颜色变成淡黄色。提取是通过绘画纸过滤器过滤。1。

2.1.2。生物合成的金纳米粒子

对于一个典型的实验中,新鲜的秋葵提取物(5毫升)的混合水溶液中HAuCl(1毫米)₄×H₂在室温下O(95毫升)。光的紫罗兰颜色出现5分钟,表明非盟NPs的形成。的解决方案是搅拌1 h,在12000转离心10分钟,从上层阶段完成还原过程。获得好的盟NPs与去离子水清洗三次。然后他们被干在烤箱50°C。

2.1.3。化学合成的金纳米粒子

Ch盟NPs是通过5个步骤合成的。(1)水(3盐酸:1 hno₃是刚做好的烧杯罩下。磁力搅拌棒、two-neck 200毫升瓶,塞,电容器在水浸泡了15分钟。然后,玻璃器皿与去离子水清洗3次。(2)HAuCl₄解决方案,2毫升的50 mM,加入98毫升水微孔进入two-neck烧瓶。(3)电容器连接到一个颈瓶,塞放在其他的脖子,和瓶在热板回流,搅拌。(4)随着回流,塞被移除,立即10毫升的38.8毫米添加柠檬酸钠,和塞替换。颜色由黄色变为深红色在1分钟。系统又回流20分钟和5分钟(29日]。

2.2。抗氧化试验

2.2.1。测量的抗氧化特性的生化盟NPs DPPH

确定捕获潜在的1,1 diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH),不同浓度的非盟NPs是准备使用一个水提物秋葵和柠檬酸钠混合3毫升0.004 DPPH的解决方案。控制解决方案包含1毫升DPPH和3毫升甲醇。获得的解决方案被动摇,然后在室温下保持在黑暗中30分钟。最后,每个样品的吸收率测量在517海里。所有的测试都是一式三份。抗坏血酸作为标准的抗氧化剂。此外,DPPH清除活动的百分比计算(30.]。

2.3。评价细胞毒性试验

2.3.1。细胞培养

HDF细胞系得到牧场研究所的德黑兰(伊朗)。细胞系的边后卫在DMEM培养,并配以10%和1% penicillin-streptomycin [31日]。

2.3.2。MTT试验

盟NPs的影响细胞的生存能力是衡量使用MTT (3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴)试验(32]。confluency 80%,细胞与不同浓度的盟暴露NPs(0、7.5、15、30、60、100、150年和200年μg / mL) 24 h。然后,20μL / MTT(5毫克/毫升)是添加到每个在37°C,孵化4 h。最后,100年μL DMSO溶液添加到井。570纳米的吸光度测定ELISA读者。

2.4。抗菌活性

麦克风测试进行无菌96 -细胞板使用CLSI标准采用药敏测试方法和欧洲委员会(EUCAST)。评价抗菌活性,四个细菌物种大肠杆菌写明ATCC 11775,肺炎克雷伯菌写明ATCC 13883(革兰氏阴性菌),金黄色葡萄球菌写明ATCC 33591和枯草芽孢杆菌写明ATCC 6051人购自波斯文化集合类型。仅培养基中含有细菌没有测试化合物被用作控制。在有氧条件下细菌培养了在37°C与胎牛血清脑心浸液中补充(的边后卫2毫升/升)从σ,购买英国。对于每一个实验,细菌生长在有氧条件下(如前所述)(33]。氯霉素和四环素30µg /毫升的浓度作为控制。样板是重达0.35毫克。提到提取物的抗菌作用与氯霉素和四环素。细菌细胞悬液被调整至0.5麦克法兰的浊度标准(浊度=麦克法兰硫酸钡标准0.5)。5毫克/毫升的浓度MTT准备在PBS (pH值7.2)从σ和购买用于细菌生长测试溶液浓度(指标)34]。二十μl (MTT的解决方案是添加到每一个,和96 -微量滴定板是孵化为30分钟28°C。为了避免失去甲瓒形成颗粒,肝癌和80%的解决方案是小心地删除。不溶性紫色甲瓒颗粒与MTT细胞溶解可溶性缓冲区(0.5%十二烷基硫酸钠、HCl 36毫米,和异丙醇酸),和吸光度测量在540海里。优化的孵化时间细菌悬液与MTT方法,数次孵化(15 - 30分钟)进行了测试。最终的吸光度为每个计算如下:Ab(540海里)的样本−Ab(540海里)的控制。

2.5。好扩散法

另一种方法,通过创建一个培养基的无菌吸管(吸管5号和深度4毫米),细菌悬液的浓度相当于一半麦克法兰在培养基表面的扩散交换。所有的麦克风和MBC分析2复制。SPSS软件(版本20)被用来分析数据,和单向方差分析(方差分析)是用于分析不同治疗之间的区别。统计分析结果显示显著水平为研究纳米颗粒(p< 0.05),因此,研究纳米颗粒对微生物有致命的影响。下面的方程被用来衡量增长抑制值(结果表示为均值±SD) (35]:增长抑制=(控制OD−示例OD) /控制OD×100。

2.6。体内研究

成年男性斯普拉格Dawley大鼠(n= 30,体重:200 - 250 g)被用来评估伤口愈合的位置。所有实验的动物保健和使用协议科曼莎大学医学科学(伊朗)和伦理委员会批准的科曼莎大学医学科学(没有批准。443)。

根据赫尔辛基协议(芬兰赫尔辛基,1975)。老鼠被关在单独的笼子里20±2°C的12 h / 12 h光/暗周期和免费的食物和水。动物是由肌肉麻醉管理ip 50毫克/公斤体重的氯胺酮。麻醉诱导后,动物的头发被剃使用电子剃须刀,暴露在外的皮肤用70%乙醇洗净。全层皮肤切除伤口(直径2厘米)。在创建了皮肤的伤口,动物被随机分为三组(每组10动物);治疗组,治疗组0.1毫升的好盟NPs胶体溶液,和Ch治疗组盟NPs胶体溶液。伤口的治疗进行顺向12日天。数字测径器是用来测量伤口面积直径(毫米)的变化。组织学检查,所有动物实施安乐死的第12天手术。 The wound and the surrounding skin were thoroughly removed for histopathological staining. The samples were fixed with 10% formalin, dehydrated with different graded alcohol concentrations, cleared with xylene, and embedded in paraffin. The sections of 5 μm是准备与马森的三色的(MT)和圆)法和光学显微镜调查的组织学变化(奥林巴斯)。

2.7。统计分析

分析的数据使用SPSS软件包v22单向方差分析。P< 0.01是意义的限制。

3所示。结果和讨论

3.1。紫外可见

首先,非盟NPs合成解决方案和表面等离子体共振(SPR高峰)和大小被证实使用紫外可见分光光度计(优秀的,λ25)在200到700纳米的范围。曲线(a)在图3显示了秋葵提取的光谱。图中曲线(b)3显示绿色的频谱合成非盟NPs(好盟NPs)包含一个非常尖锐和强劲的峰值在538海里,有强度的增加到5分钟作为时间的函数没有任何变化的峰值波长表示非盟NPs(∼55海里)的存在。最后,图中曲线(c)3显示了化学合成的光谱非盟NPs (Ch盟NPs)。高峰在516 nm证明非盟NPs (10 nm)的解决方案,数字3。这两个锋利的乐队的存在是由于非盟的SPR NPs (36]。形状和大小SPR乐队可能导致其发展过程中生成的非盟NPs (37]。这也可以验证了棒状和球形盟NPs的发展。饱和的bio-reduction盟的成就₃+也可能参与其中。一般来说,之间存在着正相关的金离子还原盟NPs和SPR峰的强度。完整的金离子还原盟NPs显示通过开发一个稳定的深紫色颜色反应混合物在5分钟(38]。

3.2。红外光谱

秋葵提取的光谱图4(一)显示了峰值为3344厘米⁻¹(地),2926厘米⁻¹(碳氢键),1612厘米⁻¹(C = O拉伸),1444厘米⁻¹(碳碳拉伸),1045厘米⁻¹(氮)。图4 (b)绿色合成盟NPs,显示了峰值为34415厘米⁻¹(地),2924 - 2854厘米⁻¹(碳氢键),1618厘米⁻¹(C = O拉伸),1458厘米⁻¹,1379厘米⁻¹(碳碳拉伸),1163厘米⁻¹(氮)。图4 (c)为化学合成盟NPs,显示了峰值为3414厘米⁻¹(地),2954 - 2924厘米⁻¹(碳氢键),1618厘米⁻¹(C = O拉伸),1458厘米⁻¹,1379厘米⁻¹(碳碳拉伸),1165厘米⁻¹(氮)。因此,一个乐队在540厘米⁻¹消失了,另一个新乐队在476厘米了⁻¹(图4 (b)),474厘米⁻¹(图4 (c))相应的h组蛋白质和金属盟NPs峰的形成。红外光谱结果表明,提取含有羟基官能团可能结合,降低金属离子的金属纳米颗粒,表明金离子的还原机制金纳米粒子(37]。

另一方面,红外光谱分析显示,减少纳米颗粒水提物的生物分子出现在秋葵会负责绑定到黄金表面的粒子稳定。

3.3。XRD

的结构合成好的盟NPs决心使用XRD分析和X′Pert公关仪器代理40千伏的电压和电流30 MA CUK辐射。衍射峰出现在38.3,44.44,64.72,77.66,2ɵ范围0 - 80。这些山峰(111)、(200)、(220)和(311)面,面心立方晶体结构(JCPDS里没有。004 - 0784)。因此,准备盟NPs的晶体结构与秋葵提取确认(图5)。我们已经计算出的平均大小非盟NPs根据XRD数据和谢勒方程,这是77.58海里。

3.4。TEM

好的非盟NPs的大小和形状是由透射电子显微镜(TEM)决定的。TEM图像获得的蔡司- em10c - 100 KV仪器如图6与不同的决议。它表明,金纳米粒子几乎没有聚集的球形形貌。我们的结果是一致的形状SPR乐队在450海里的胶体。最初的TEM,如图6,使用MATLAB数字处理39]。该方法用于处理图像是基于局部阈值,这有助于我们在粒子计数、平均直径测量,获得粒度分布图表。数字图像处理的输出数据所示6和6 (c)。输出确认的586 NPs平均直径75纳米。

3.5。抗氧化活性

最近,药用植物具有抗氧化和抗炎活动中的应用增加了。减少自由基抗氧化化合物在伤口面积,提高伤口愈合40]。金属纳米粒子有效抗氧化性能对DPPH自由基清除(41]。在伤口面积,减少自由基的抗氧化化合物有助于治愈伤口。其他研究已经表明,药用植物富含抗氧化剂和抗炎化合物改善伤口愈合7,40]。DPPH自由基清除效果好的盟NPs和Ch盟NPs在五个不同浓度相比,C(图7)。有人建议,Ch自由基清除活性的非盟NPs和好的盟NPs与非盟的浓度的增加增强NPs在20 - 100µg /毫升。我们的研究结果表明,Ch盟NPs好盟NPs,和维生素C有抗氧化剂的活动。然而,在这项研究中,非盟NPs拥有合适的伤口愈合活动(图7)。

3.6。细胞毒性的调查

盟NPs的细胞毒性的潜力以不同浓度(0、7.5、15、30、60、100、150年和200年μg / mL)对HDF细胞系使用MTT测定24 h(图8)。此外,吸光率为570 nm,显示良好的生存能力在一个正常的HDF细胞浓度高达200μ非盟NPs g / ml。另外,我们观察到非盟NPs没有造成大的细胞毒性的浓度用于MTT试验(图7)。

符合我们的研究中,哈默尔等人报道,当植物化合物与金盐混合,其细胞毒性是消除41]。Bartczark等人研究了黄金空心球的细胞毒性,金团簇,核/壳二氧化硅/金纳米晶对内皮细胞,发现noncytotoxic效应(42]。

3.7。抗菌活性

麦克风的值大肠杆菌,肺炎克雷伯菌,金黄色葡萄球菌,枯草芽孢杆菌是10.75,13.80,10.83,9.90μg / mL, 9.57, 10.58, 10.21, 8.95好盟NPs和Ch盟NPs,分别。不过,MBC的值是22.01,21.75,21.65,19.80μg / mL, 19.35, 20.50, 20.25, 17.45μg / mL好盟NPs和Ch盟NPs(表1)。表的结果1显示,合成好的盟NPs和Ch盟NPs阻止了表明细菌的生长。增加非盟NPs扩大了抑菌圈的浓度。麦克风:最小抑制浓度;MBC:最小杀菌浓度;C:浓度;ZOI:抑制区。

纳米颗粒有显著的抗菌效应,这种效应加剧增加纳米粒子的浓度。对抗生素耐药性的机制不会导致抗抗菌化合物纳米粒子。关于抗菌机制的纳米颗粒的性质,这是说,纳米离子与活细菌酶和反应活性。作为催化剂,它将氧活化氧气(包括羟基自由基)。这个反应是由光能量在空气中或H₂O和只在极地表面;因此,活性氧可以抑制细菌的生长(43]。应该注意的是,纳米粒子与直接接触的细菌,它们的大小应该是1 - 10纳米。在这项研究中,纳米颗粒的平均尺寸是40纳米,而最大的抗菌效果。在纳米颗粒的存在,微生物失去复制的能力,和细胞蛋白质是灭活(44]。因此,细菌抵抗抗生素化学与这些纳米颗粒不交叉作用。这一点希望使用抗菌化合物的纳米颗粒治疗感染,特别是感染耐药性细菌(45]。

3.8。体内研究

本研究显示一个增强的伤口关闭和直径的比例伤口区域(数据9和10)。如图9和10、治疗与好的盟NPs改善伤口面积直径的大小和比例的伤口闭合,这是与之前的报道相一致38]。伤口缝合的比例=(1−(伤口区)/(原来的伤口面积)×100)。

3.8.1。组织病理学

评估皮肤的组织学变化,苏木精和伊红())和马森的三色的(MT)染色进行健康和伤口组织样本。在健康的皮肤,的地层表皮真皮(结缔组织与皮肤附属物)和真皮观察(图11)。广泛坏死组织表面观察伤口治疗组的一部分由于受伤。在坏死组织,与血液细胞的分泌炎性细胞。在这个组织,在细胞外基质胶原纤维太节离散和不规则的。组中获得好的盟NPs Ch盟NPs,炎性细胞的聚集和分散胶原纤维形成的上皮组织(图中观察12)。在治疗组与非盟NPs上皮形成大规模。此外,还有组织真皮的胶原纤维和血管;同时,聚合的自然观察细胞在伤口面积。在这一组,太部分显示大量的胶原蛋白。一般来说,治疗组,形成上皮组织是厚的比正常老鼠,和皮肤附属物(图中没有观察到12)。同意上述发现,非盟NPs减少伤口愈合的组织病理学变化条件可能通过不同的机制,如血管生成途径,改变膜电位和触发最佳细胞内ROS,酶和ATP合酶(38]。

4所示。结论

本研究表明,合成非盟NPs使用水秋葵提取物是一种环保、简单和有用的方法。紫外线/六世年代光谱、红外光谱、XRD和TEM技术被用来描述好盟NPs合成。此外,良好的绿色合成的抗菌和抗氧化活动盟NPs可能是一个安全有效的辅助伤口愈合。因此,好的盟NPs可能是理想的候选人未来的研究发现它们的治疗和制药应用。

数据可用性

与本研究相关的原始数据可从作者在一个合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Shahla Korani和Khodabakhsh Rashidi这项研究同样起到了推波助澜的作用。

确认

金融支持研究中心的油脂,科曼莎大学医学科学(咕)。

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