文摘

如何积极目标肿瘤站点操作封装抗癌药物的可控释放和敏化协同抗癌药物治疗仍然是一个巨大的挑战。在这项研究中,一个癌症cell-targeted,近红外(NIR)光触发和抗癌药物脂质体加载系统(LPs)为协同开发癌症治疗。光敏剂吲哚菁绿(协调小组)和化疗药物姜黄素(坏蛋)coencapsulated脂质体,紧随其后的表面接合GE11肽对表皮生长因子受体(EGFR)针对癌症细胞表面。严格控制通过近红外光线,GE11肽修改和坏蛋/ ICG-loaded有限合伙人(GE11-CUR / ICG-LPs)可以介绍高热A549肿瘤细胞中EGFR过表达的光热光谱分析药物治疗,也可以触发增加了增强癌细胞抑制释放坏蛋。GE11-CUR / ICG-LPs主体性光化学疗法可以诱导活性氧(ROS)生成和细胞骨架破坏激活凋亡信号事件比光照治疗或化疗仅通过调节伯灵顿/ bcl - 2和PI3K / AKT通路。这个EGFR-targeted药物运输综合与近红外光谱敏感性可能提供更有效的抗癌疗法的脱靶效应降低。

1。介绍

癌症死亡的主要原因之一,占全球每年数百万人死亡(1]。尽管最近的治疗技术的快速进步,化疗仍是主要的癌症治疗方法在诊所。姜黄素(坏蛋)已被广泛研究的抗癌特性和证明优秀的抗癌作用在几个临床试验(2]。不幸的是,低癌症靶向效应,生物利用度低,水溶性差,和快速的新陈代谢仍限制坏蛋的抗癌效应,进一步阻碍了其临床使用。因此,如何提高抗癌效果的坏蛋一些新奇的策略仍然是最紧迫的挑战为其进一步临床应用。

基于纳米药物传输系统,如微乳液(3,4),胶束(5,6),纳米凝胶(7,8[],树枝状化合物9,10),已经设计和开发潜在克服低抗癌药物的影响。由于迷人的物理和化学性质,脂质体(LPs)被广泛用于提高溶解度和生物利用度的坏蛋,吸引了大量的注意力在过去几十年(11]。聚(乙二醇)聚合物(挂钩)修改使脂质体能够有效地逃避免疫识别和清除血液中,从而极大地提高其稳定性和延长血液循环时间12]。然而,聚乙二醇脂质体仍很难具体积聚在肿瘤部位由于缺少活跃的肿瘤的效果。因此,无数的研究工作一直致力于构建功能有限合伙人与特定的表面修饰,如叶酸(13),抗体(14),透明质酸(15],cRGD [16为活跃的癌细胞靶向。我们和其他团体的工作已经证明,合成12个氨基酸肽GE11, Y-H-W-Y-G-Y-T-P-Q-N-V-I序列,是一个有效的表皮生长因子受体(EGFR)针对癌症细胞中EGFR过表达的肽(17- - - - - -19]。与GE11肽修改后,获得的有限合伙人将选择性地提供药物加载到癌细胞,增强抗癌治疗。然而,典型的人们总是释放药物被动和不完整的版本控制不好在目标网站(20.),敦促我们与按需发展纳米系统释放特性所需的地点更有效的抗癌治疗。

在过去的几年中,light-responsive [21- - - - - -23)和其他刺激响应性(24- - - - - -26)药物传输人们广泛开发引发药物释放,这无疑提供了一个可行的策略,最大限度地提高药物浓度在肿瘤站点和减少非标靶药物暴露。近红外(NIR) laser-sensitive人们,在近红外区域中表现出很强的吸收(700 - 900海里),收到了广泛的关注(21]。热转换的近红外光谱吸收光能量不仅可以摧毁人们对药物破裂释放强劲但切除癌细胞,这是强调作为癌症治疗的一个有前途的战略。虽然黄金或无机nanoparticle-based光触发纳米系统已经广泛报道(27,28各组织],其潜在毒性进行进一步的临床应用仍是一个大问题。相比之下,吲哚菁绿(ICG)临床使用的NIR光敏剂经美国食品和药物管理局(FDA),提出了作为小说光疗剂因其生物相容性和非凡的近红外光学特性(29日]。近年来,人们预计将提高协调小组的缺点分子,如短血半场和更有效的光疗的不稳定,也使更有效的癌症抑制通过近红外光线照射。

在这项研究中,我们制作一个近红外光谱光触发药物释放综合的组合照片,和化疗的基础上我们的纳米技术专家(19,30.- - - - - -33]。光敏剂协调小组和化疗药物CUR coencapsulated脂质体,其表面与GE11肽(GE11-CUR / ICG-LPs)进一步修改,赋予它向EGFR-positive-expressed癌细胞靶向效果。在808 nm近红外激光照射,GE11-CUR / ICG-LPs可能被高热后由协调小组释放封装CUR GE11肽靶向到肿瘤部位。这部小说综合可以通过高热切除肿瘤,和坏蛋的近红外触发释放将进一步消除残余癌细胞,从而实现协同作用的抗癌效果。这项工作提出了一种新颖的策略结合照片由可控nanodelivery系统化疗,它显示了强劲的潜力更有效的抗癌治疗。

2。材料和方法

2.1。材料

(3)- 4 5-dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)获得西格玛奥德里奇(美国)。杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM),胎牛血清的边后卫,trypsin-EDTA (0.05%)、penicillin-streptomycin (P / S), PBS, calcein-AM,增强化学发光(ECL)免疫印迹检测试剂购自热费希尔科学(美国)。GE11多肽是购自GL生物化学有限公司(上海,中国)。Radioimmunoprecipitation化验(里帕)裂解缓冲的主要抗体anti-PI3K(4292年代),anti-p-PI3K(4228年代),anti-Akt(9272年代),anti-p-Akt(4060年代),anti-Bcl-2(3498年代),和anti-Bax(5023年代),购买从细胞信号技术(美国)。Bio-Rad蛋白质化验设备和30%的丙烯酰胺/ bissolutionandpolyvinylidene二氟化物(PVDF)膜获得Bio-Rad(美国)。膜联蛋白V-FITC /π凋亡检测装备,活性氧(ROS)检测装备,多聚甲醛,4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)和Tubulin-Tracker从Beyotime购买生物技术研究所(上海,中国)。

2.2。的制备和表征GE11-CUR / ICG-LPs

脂质体含有CUR /协调小组(CUR / ICG-LPs)准备采用薄膜分散法膜挤压紧随其后。短暂,混合磷脂(SPC、胆固醇、DSPE-PEG2000和DSPE-PEG2000-MAL (60: 20: 10: 10 w / w)和0.5毫克CUR溶解在混合溶液(甲醇:氯仿= 1,v / v)和蒸发形成脂质薄膜在圆底烧瓶用旋转蒸发器。然后,干燥器内的电影vacuum-dried一夜之间消除残余的解决方案。这部电影是水化PBS溶液包含协调小组(0.4毫克)声波降解法在水浴中超过10分钟。随后,受到乳化混合物使用一个在50 W的功率超声发生器10分钟(5 s开始,5 s停止),其次是挤压通过一系列的聚碳酸酯膜的孔隙大小从400纳米到100纳米的两代情miniextruder(微孔)。之后,自由协调小组和坏蛋被离心分离脂质体在20000 g 30分钟的超滤管(30 kD,微孔)。

获得GE11-CUR / ICG-LPs CUR / ICG-LPs 1-ethyl-3喜忧参半——[3-dimethylaminopropyl]碳化二亚胺盐酸盐(EDC, 0.4 M)和N-hydroxysuccinimide (NHS, 0.1米)然后保存3个小时在4°C。GE11肽(18.6毫克)然后添加到混合物和孵化在黑暗中在室温下过夜。使用超滤管的非结合的GE11被蒸馏水。获得CUR-loaded有限合伙人(GE11-CUR-LPs)或ICG-loaded有限合伙人(GE11-ICG-LPs),制备过程都是相似的,除了协调小组解决方案或坏蛋的解决方案是不添加到混合物。

2.3。描述和GE11-CUR / ICG-LPs的稳定

坏蛋的封装效率(EE)和协调小组在GE11-LPs UV / vis光谱法在探测到416和790海里根据标准曲线,分别。EE (%) = ((Mt - Mul) / Mt)×100% (Mt:坏蛋或协调小组制定的总量;Mul:卸载CUR或协调小组)的数量。颗粒大小、粒径分布、ζ可能性,形态进一步确定使用莫尔文Zetasizer Nano ZS90仪器(英国莫尔文莫尔文仪器有限公司)和透射电子显微镜(TEM),分别。光学特性测量使用紫外可见(紫外光谱(PerkinElmer沃尔瑟姆,MA)和傅里叶变换红外光谱(红外光谱,力量TENSOR27,德国)。的吸收和荧光稳定性评估在预定的时间使用UV / vis和荧光光谱法。

光热光谱分析属性被监视温度的变化进一步调查。短暂、石英比色皿包含免费的坏蛋/协调小组,坏蛋/ ICG-LPs, GE11-CUR / ICG-LPs 1 Wcm对待⁻²波长808纳米的激光照射5分钟。激光是调整以确保辐照点可以覆盖整个表面的样品,和温度记录使用一个红外摄像机(FLIR Pro)。为进一步比较自由坏蛋之间的耐光性/协调小组和GE11-CUR / ICG-LPs,四个周期的样本辐照激光波长808纳米的激光辐照开/关。此外,辐照样品的粒度分布是过去的近红外光谱辐照后检验。

2.4。药物释放GE11-CUR / ICG-LPs的属性

坏蛋释放行为从GE11-CUR / ICG-LPs有或没有近红外光谱辐照在1 Wcm(808海里)⁻²5分钟在PBS采用透析法。简而言之,GE11-CUR / ICG-LPs装入透析袋过滤器(MWCO: 8000 Da)紧密密封,然后沉浸到30毫升发布媒体有轻微摇晃50 rpm。近红外光谱辐照,GE11-CUR / ICG-LPs的透析袋和近红外激光辐照的808海里。辐照后,样品被推迟到透析袋继续释放研究。在预定的时间间隔,0.3 mL版本中取样,取而代之的是同等体积的新鲜释放介质。CUR发布概要文件的浓度测定的吸光强度在416 nm,使用一个标准的校准曲线。

2.5。细胞培养

A549 nonsmall细胞肺癌细胞,海拉人类宫颈癌细胞和人类正常肝LO2细胞从美国购买类型文化集合(写明ATCC,美国)。包含10%的细胞在DMEM培养基培养的边后卫,100 U·毫升⁻¹青霉素,100μg·毫升⁻¹链霉素在37°C和湿润孵化器有限公司调整到5%₂。

2.6。细胞内的吸收和Light-Simulated药物释放GE11-CUR / ICG-LPs

A549和LO2细胞被播种(3×10⁵细胞/)和孵化在盖玻片6-well板24 h,然后接受包含免费的新鲜培养基CUR /协调小组,坏蛋/ ICG-LPs, GE11-CUR / ICG-LPs(坏蛋:12.5μg·毫升⁻¹,协调小组:10μg·毫升⁻¹)。孵化4 h后,细胞与PBS洗3次,与4%多聚甲醛固定,与DAPI染色(5μg / ml)最后在徕卡SP8共焦显微镜观察配备40×油浸物镜(德国徕卡)。

为了探测光触发释放行为的GE11-CUR / ICG-LPs A549细胞使用GE11-CUR / ICG-LPs(坏蛋:12.5μg·毫升⁻¹,协调小组:10μg·毫升⁻¹)为4 h,紧随其后的是与808 nm近红外激光(1 Wcm辐照⁻²)为0、5、10分钟。之后,这些细胞被洗、固定、染色,然后在徕卡SP8共焦显微镜(德国徕卡)。

2.7。免疫印迹分析

蛋白质电晕特点是使用钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)方法。GE11-LPs在培养基孵化12 h和离心收集GE11-LPs含有蛋白质电晕,然后反复洗冷PBS去除游离蛋白质。布拉德福德的蛋白质进行鉴定清洗解决方案,以确保没有额外的蛋白质从GE11-LPs筛选了。GE11-LPs不孵化培养基受到相同的程序控制来验证蛋白质电晕的缺失。所有的样品都与加载缓冲区(5倍)和混合加热到100°C 10分钟。之后,相同的卷(20μl)的每个示例加载10% sds - page凝胶和运行在100 V 150分钟。蛋白质被沾Commassie蓝色2 h和成像洗后24 h。免疫印迹分析,治疗细胞收获和细胞溶解在4°C•瑞帕裂解缓冲含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂,持续15分钟。离心后(12000 rpm, 15分钟)在4°C,上层清液的收集的细胞溶解产物蛋白质含量分析,布拉德福德蛋白质分析。等价的蛋白质(30μ从每个样本进行sds - page g),然后转移到PVDF膜(0.2μ米)。与5% BSA阻塞后,PVDF膜与以下主要孵化抗体(1:1000):表皮生长因子受体,PI3K, p-PI3K, Akt, p-Akt,β肌动蛋白、bcl - 2、Bax一夜之间在4°C。广泛洗后,膜进一步孵化与二次抗体(1:5000)为4 h然后可视化ECL试剂。

2.8。ROS生成分析

细胞内活性氧(ROS)检测使用ROS探针(DCFH-DA)。短暂,A549细胞生长在盖玻片是生长在一个全新的媒介包含免费的坏蛋/协调小组,坏蛋/ ICG-LPs, GE11-CUR / ICG-LPs(坏蛋:12.5μg·毫升⁻¹,协调小组:10μg·毫升⁻¹)12 h,其次是808海里照射治疗(1 W·厘米⁻²,5分钟)。之后,细胞与PBS洗两次,无血清培养系统,包含40µM DCFH-DA 30分钟。最后,这些细胞被观察到在徕卡SP8共焦显微镜(德国徕卡)。

2.9。表皮生长因子受体的免疫荧光分析

海拉、A549和LO2细胞用PBS PFA 15分钟,然后固定在4%,其次是透化作用与0.1% Triton x - 100在PBS为10分钟。样品被封锁3% BSA 1 h,孵化一夜之间在4°C EGFR抗体(1:100),然后洗孵化与二次抗体(Alexa萤石488山羊anti-rabbit,表达载体,1:200)2 h。最后,这些细胞被观察到在徕卡SP8共焦显微镜(德国徕卡)。

2.10。细胞内Microtubulin分布分析

A549细胞生长在盖玻片处理自由CUR /协调小组,坏蛋/ ICG-LPs, GE11-CUR / ICG-LPs(坏蛋:12.5μg·毫升⁻¹,协调小组:10μg·毫升⁻¹)12 h,其次是808海里照射治疗(1 W·厘米⁻²,5分钟)。之后,这些细胞被孵化Tubulin-Tracker红色(1:100)在室温下1小时,然后用PBS。整个核与DAPI染色(5μg / ml),持续15分钟。与PBS广泛冲洗后,这些细胞被观察到在徕卡SP8共焦显微镜(德国徕卡)。

2.11。细胞生存能力分析

A549细胞(8×10³细胞/)被播种到96孔板,然后接受包含免费的新鲜培养基CUR /协调小组,坏蛋/ ICG-LPs, GE11-CUR / ICG-LPs(坏蛋:15μg·毫升⁻¹协调小组:12μg·毫升⁻¹)12 h,其次是治疗有或没有808海里辐照(1 W·厘米⁻²,5分钟)。激光点面积≈1厘米⁻²,这是足以支付的底部在96孔板。经过进一步孵化12 h,据报道方法MTT试验进行(34]。MTT测定,介质被新鲜培养基(100所取代μL)包含MTT(0.5毫克/毫升)和孵化3 h。在那之后,中被删除,取而代之的是150年μL二甲亚砜(DMSO)。甲瓒的吸光度为每个在520海里被SpectraMax范式测量多模标仪(美国分子器件、桑尼维尔CA)决定细胞生存能力。每个样本的相对细胞生存能力(%)提出了相对于控制细胞。

chemophotothermal联合治疗的效果与不同浓度也被评估。A549细胞受到新鲜培养基包含免费的坏蛋/协调小组,坏蛋/ ICG-LPs, GE11-CUR / ICG-LPs与不同浓度(坏蛋:5、10、15、20、25μg·毫升⁻¹对应于协调小组:4、8、12、16、20μg·毫升⁻¹)12 h,其次是治疗有或没有808海里辐照(1 W·厘米⁻²,5分钟)。经过进一步孵化12 h,细胞生存能力决定了MTT测定如上所述。

对于calcein-AM染色,包含calcein-AM介质被替换为新的介质。孵化后30分钟在室温下在黑暗中,与新鲜培养基,细胞再次冲洗和活细胞观察奥林巴斯IX71显微镜。

2.12。Caspase-3活动分析

caspase-3的活动是由荧光定量根据制造商的指示(Beyotime生物技术研究所,中国)。简单,细胞被孵化与自由CUR /协调小组,坏蛋/ ICG-LPs和GE11-CUR / ICG-LPs 12 h,紧随其后的是808海里照射治疗(1 W·厘米⁻²刮,5分钟),那么收获,终于在裂解缓冲细胞溶解,离心去除细胞碎片。上层清液立即被测量蛋白质浓度和半胱天冬酶的活动。细胞溶解产物被孵化与特定caspase-3衬底(Ac-DEVD-pNA)反应缓冲2 h在37°C。吸光度在405纳米测量使用标仪(美国分子设备)。

2.13。统计分析

所有实验进行了至少一式三份,所有数据被当作平均数±标准差。使用方差分析的统计数据进行分析(应用分析了两组以上)和t(应用只是分析了两组) 认为是具有统计学意义。

3所示。结果与讨论

3.1。的制备和表征GE11-CUR / ICG-LPs

这里,光敏剂协调小组和化学治疗剂CUR coencapsulated到脂质体通过电影水合作用,其次是与GE11肽共轭EGFR-positive A549肿瘤细胞定位。动态光散射(DLS)测量表明,有限合伙人∼220纳米球形颗粒均匀分布(图1 (b)),这是适合的被动靶向肿瘤通过EPR的效果35]。结合GE11肽略增加有限合伙人大小∼250海里,表明成功的靶向配体的表面装饰有限合伙人,有限合伙人的粒径增加。然而,没有明显颗粒大小的变化协调小组和坏蛋coencapsulated GE11-LPs(数据1(一)和1 (c))。两种纳米粒子分散均匀,多分散性指数(PDI)值小于0.3。和坏蛋的大小/ ICG-LPs GE11-CUR / ICG-LPs PBS几乎不变的存储(图5天内1 (e)),表明获得的高稳定性的综合。

电动电势的纳米颗粒配方是负数,而GE11-CUR / ICG-LPs是最带负电系统电动电势的−19.0 mV(图1 (d))。此外,疏水性CUR可以封装成脂质体的疏水性层封装效率高(85.3%),显著提高了坏蛋的溶解度和稳定性。GE11-CUR的载药能力/协调小组和坏蛋ICG-LPs配方是5.70%和7.12%,分别。

包含DSPE-PEG2000-MAL的脂质体可以共价结合羧基组GE11-LPs GE11肽的形式。GE11共轭有限合伙人的化学结构由红外光谱进一步验证。如图1 (f)的特征峰GE11-LPs 1086厘米⁻¹是由于C-O-C的伸缩振动,这是类似于挂钩的特定吸收段在1095厘米吗⁻¹。吸光度达到1679厘米⁻¹的伸缩振动可以归因于C = O - n,这是类似于特定的吸收GE11肽在1672厘米吗⁻¹,证实的成功结合GE11肽在有限合伙人。通过修改GE11肽,有限合伙人和改善抗癌药物的治疗指数增加药物生物利用度和目标。然而,蛋白质的形成电晕在很大程度上影响生物的命运,药物动力学,纳米材料与细胞的相互作用。接下来,我们调查了生理变化发生在GE11-LPs电晕后蛋白质的形成。如图1 (b),GE11-LPs小均匀分散在PBS大小,而规模相对较大的颗粒大小与异构分布观察与培养基孵化后,这可能归因于蛋白质形成电晕。进一步证明蛋白质电晕的存在,吸附蛋白质被SDS PAGE GE11-LPs分离和识别。结果表明,蛋白质成分的培养基在GE11-LPs保留,但没有蛋白质的信号中检测出裸体GE11-LPs(图1 (g)),进一步表明蛋白质的保留表面电晕GE11-LPs。

紫外可见吸收光谱GE11-CUR / ICG-LPs(图2(一个))展览两个特征吸收峰。在416纳米是一个特征吸收峰吸收坏蛋和第二吸收峰∼770海里是协调小组的特征吸收,表明成功coencapsulation GE11-LPs协调小组和坏蛋。相比免费的协调小组,协调小组的吸收或发射峰CUR / ICG-LPs和GE11-CUR / ICG-LPs被26∼∼20 nm红移,分别(图2 (b)),可能是由于分子构象的变化由协调小组和坏蛋之间的相互作用引起的。吸收峰红移近808海里将有利于GE11-CUR / ICG-LPs应用于NIR-mediated光疗。自由协调小组在水溶液中聚合形成二聚体和低聚物,从而导致荧光自灭(36]。有趣的是,没有明显的荧光或吸光度变化的GE11-CUR / ICG-LPs 37°C / 8天,而免费的坏蛋/协调小组几乎完全退化显示只有38.2%的初始荧光强度和69.6%的初始吸收强度后8天(数字2 (c)和2 (d))。这些结果表明优秀的光学稳定性GE11-CUR / ICG-LPs,由隔离有助于稳定协调小组从总量,因此减少协调小组淬火。

3.2。光热光谱分析性能及光触发GE11-CUR / ICG-LPs的药物释放

由于强烈的吸收近红外光谱区域的协调小组,自由坏蛋的光热光谱分析能力/协调小组,坏蛋/ ICG-LPs, GE11-CUR / ICG-LPs评估通过监测温度变化时使用一个红外热成像相机。在808纳米激光辐照后(1.0 W·厘米⁻²)5分钟,PBS的温度稍微增加到28.7°C,而免费的坏蛋/协调小组,坏蛋/ ICG-LPs和GE11-CUR / ICG-LPs显示快速增加趋势最大温度为54.9°C, 58.1°C,分别为60.2°C(图3(一个))。也很容易发现坏蛋/ ICG-LPs和GE11-CUR / ICG-LPs配方显示光照效率略高于自由CUR /协调小组在激光辐照下,可能主要归因于减少散热受到脂质影响膜的保护和增强激光能量吸收红移造成的吸收峰。此外,探索自由的光照稳定性CUR /协调小组和GE11-CUR / ICG-LPs,四个周期和波长808纳米的激光辐照激光开/关(1.0 W·厘米⁻²)进行。如图3 (b),温度高度自由的坏蛋/协调小组与重复辐照周期逐渐减少。然而,GE11-CUR / ICG-LPs显示温度变化超过四个周期一致,表明更好的耐光性GE11-CUR / ICG-LPs超出了免费的坏蛋/协调小组。在一起,这样优秀的光热光谱分析的效率和耐光性使发展潜力GE11-CUR / ICG-LPs进一步光照疗法。

此外,我们进一步研究了坏蛋的释放行为从GE11-CUR / ICG-LPs之前和之后的近红外光谱辐射。如图3 (c)GE11-CUR / ICG-LPs没有激光照射被释放的总释放缓慢,坏蛋只在48小时达到了21.51%,这表明GE11-LPs可以有效阻碍泄漏封装坏蛋。然而,当暴露在近红外激光照射,释放CUR GE11-LPs加快至40.8% 4 h,最终提高到52.0%在48 h,这表明,药物释放GE11-CUR / ICG-LPs可以由激光辐照引起的。因此,基于这些结果,我们认为GE11-CUR / ICG-LPs系统可能被产生的高热协调小组在近红外光谱辐照下,导致破裂释放裹入坏蛋。大小分布不均的GE11-CUR / ICG-LPs激光辐照后进一步证实了假设的热破坏GE11-CUR / ICG-LPs协调小组高热引起的(图3 (d))。这些结果共同表明,坏蛋释放GE11-CUR / ICG-LPs可以通过近红外激光照射,可控强调GE11-CUR / ICG-LPs作为一种NIR-sensitive药物释放综合。

3.3。细胞吸收和GE11-CUR / ICG-LPs光触发细胞内药物释放

表皮生长因子受体(EGFR)是在nonsmall细胞肺癌,因此被广泛作为一个重要的治疗目标,在癌症治疗(吸引了巨大的利益37,38]。我们和其他团体的作品介绍GE11肽作为癌症靶向配体特异性针对EGFR蛋白(19,39,40]。通过接合GE11肽表面上的有限合伙人,有限合伙人将会获得积极的目标EGFR-high表达肿瘤细胞和同步逃避EGFR-low表示正常细胞增强抗癌效果和减少非目标效应。首先,我们调查了表皮生长因子受体在海拉细胞与正常控制LO2细胞A549细胞。结果表明,表皮生长因子受体表达最强烈和至少在LO2细胞A549细胞,免疫荧光染色(图如图所示4(一)(图)和免疫印迹分析4 (b))。因此,EGFR高表达A549细胞选择进一步检查的具体目标GE11-LPs由GE11肽的影响。如数据所示4 (c)和4 (d)A549细胞治疗GE11-ICG-LPs显示更强的荧光比对待自由协调小组或ICG-LPs,这表明GE11-ICG-LPs更容易引导和被EGFR过表达A549细胞由于援助GE11肽靶向效果。

进一步验证GE11肽的吸收的贡献GE11-ICG-LPs, A549细胞的试验进行竞争。细胞被使用过度的GE11肽或anti-EGFR抗体阻止特定GE11-ICG-LPs的绑定。GE11-ICG-LPs的吸收明显抑制在某种程度上类似于通过ICG-LPs来实现。更值得注意的是,anti-EGFR抗体阻断GE11-ICG-LPs还导致了降低目标的影响,这也进一步表明,GE11-ICG-LPs的靶向吸收过程主要是由EGFR-targeted GE11肽。在一起,这些结果证实GE11修改有限合伙人可以明确,积极目标EGFR-positive A549肿瘤细胞。运输效率高的GE11-LPs内容将有助于增加药物在肿瘤部位,从而提高抗肿瘤效果和减少潜在的副作用。

我们进一步评估光触发释放GE11-CUR / ICG-LPs在肿瘤细胞的行为。细胞培养与GE11-CUR / ICG-LPs暴露在波长808纳米的激光辐照(1 W·厘米⁻²不同的时间);之后,荧光信号的坏蛋释放GE11-CUR用共焦显微镜观察/ ICG-LPs。展示图4 (e)之前,坏蛋的荧光强度相对较低的辐照与辐照时间延长而逐渐增加。这些结果表明,类似于近红外光谱辐照引发CUR释放GE11-CUR / ICG-LPs PBS,激光辐照也显著地增加了坏蛋的释放率从GE11-CUR / ICG-LPs内癌细胞。这些结果进一步表明,热量由协调小组分解快速释放的胞内GE11-LPs系统在激光辐照CUR,,因此,潜在的光照疗法和化疗结合增强抗癌治疗。

3.4。体外细胞毒性和GE11-CUR / ICG-LPs的光毒性

的治疗潜力GE11-CUR / ICG-LPs对A549细胞MTT试验进一步验证和calcein-AM染色化验。没有近红外光谱辐射,增强细胞活力抑制比免费GE11-CUR / ICG-LPs CUR /协调小组或坏蛋/ ICG-LPs可能归因于提高胞内积累的曲率,从而导致更有效的细胞毒性(图5(一个))。辐照后,细胞的增长趋势是相似的细胞没有照射治疗。细胞治疗的可行性与自由CUR /协调小组或坏蛋/ ICG-LPs治疗(25μg·毫升⁻¹坏蛋和20μg·毫升⁻¹协调小组)下降到52.0%或35.2%,分别,而GE11-CUR / ICG-LPs显著降低细胞的生存能力(图的12%5 (b)),显示较强的细胞毒性,光毒性GE11-CUR / ICG-LPs攻击癌细胞。

值得注意的是,GE11-CUR / ICG-LPs显示细胞毒性高于CUR / ICG-LPs几乎所有评估的浓度,这可能是由于其较强的细胞A549细胞内化的GE11针对针对表皮生长因子受体的影响。进一步证实治疗结果,calcein-AM染色用于可视化活细胞有不同的治疗方法。与MTT结果一致,进一步证明了细胞治疗GE11-CUR / ICG-LPs +近红外感应最强的癌细胞杀死影响而其他组表现出相对较低的细胞毒性(图5 (c))。

检查光化学疗法综合治疗的协同效应,我们探索GE11-ICG-LPs的抗癌效应,GE11-CUR-LPs和GE11-CUR / ICG-LPs曝光。正如所料,结合GE11-CUR / ICG-LPs和激光辐照产生较强的细胞毒性比GE11-ICG-LPs或GE11-CUR-LPs治疗(图5 (d))。因此,我们推断出近红外光控GE11-CUR / ICG-LPs可以产生足够的热能光照疗法,从而加速释放CUR化疗相结合,实现激励协同作用的抑制癌细胞。严格控制生产和坏蛋释放的热量近红外光谱光,大大减少非标靶药物暴露。此外,没有显著差异GE11-CUR-LPs治疗细胞辐照之前或之后,指示协调小组介导光疗的重要角色。综上所述,这些光控EGFR-targeted人们将是一个有前途的战略结合chemophotothermal治疗协同作用的癌症造成较低的副作用。

3.5。癌细胞GE11-CUR / ICG-LPs诱导细胞凋亡

细胞凋亡被认为是最重要的一个细胞死亡机制(41]。还存在家庭凋亡过程中起着核心作用,被广泛用作指标监控细胞凋亡(42]。来验证是否引起的细胞凋亡导致了A549细胞增殖抑制GE11-CUR / ICG-LPs caspase-3是近红外光谱辐照后的活动。见图6(一),caspase-3 A549细胞的活动增加了控制细胞从0.98至1.94,3.48,4.18,近红外光谱辐照免费CUR /协调小组,坏蛋/ ICG-LPs和GE11-CUR / ICG-LPs治疗细胞,分别显示,GE11-CUR / ICG-LPs +近红外光谱可以显著caspase-dependent方式诱导细胞凋亡。因此,这些结果,与MTT结果一致,进一步表明coencapsulation协调小组和坏蛋GE11涂层有限合伙人可以实现更强大的细胞凋亡由于目标交付和协同效应的坏蛋和协调小组GE11-CUR / ICG-LPs系统。

细胞内ROS水平被认为是氧化应激的可靠指标,而对细胞凋亡诱导至关重要(43]。因此,A549细胞的活性氧水平处理各自的配方在激光辐照进一步评估。如图6 (b)观察,没有显著增加活性氧生成控制细胞,进一步表明光热光谱分析辐照在未经处理的细胞不会造成明显的损害。此外,免费的坏蛋/协调小组治疗稍微增加细胞内ROS水平,而有显著增加细胞内ROS生成处理GE11-CUR / ICG-LPs,表明活性氧的生产过剩是GE11-CUR / ICG-LPs + NIR诱导细胞凋亡密切相关。

细胞凋亡总是伴随着细胞形态学变化。因此,我们试图通过免疫荧光分析可视化微管骨架的变化。如图6 (c)未经处理的细胞显示,细长的轮廓和集成微管纤维,然而,免费CUR /协调小组和坏蛋/ ICG-LPs治疗在近红外光谱辐照诱导类似损伤细胞内的微管结构,形如纤维逐渐减少在细胞质中。此外,细胞的形态学处理GE11-CUR / ICG-LPs成为大大缩小和微管碎片消失,进一步表明优秀的细胞毒性引起GE11-CUR / ICG-LPs和近红外光谱辐照。

对细胞凋亡的潜在机制进行进一步的探索,bcl - 2家族蛋白质免疫印迹分析探测到。bcl - 2被普遍认为是一个至关重要的凋亡分子签名,而伯灵顿是视为一个重要proapoptotic分子签名,这中扮演着重要的角色在凋亡信号通路的调节和控制44,45]。如图7(一)治疗后,伯灵顿的表达蛋白显著增加与坏蛋/ ICG-LPs和GE11-CUR / ICG-LPs配方与近红外光谱辐照超出免费CUR /协调小组与近红外光谱辐射,而相反的趋势在bcl - 2的表达。GE11-CUR / ICG-LPs +近红外光谱辐照组表现出∼相比,伯灵顿/ bcl - 2比例增长了1.6倍的坏蛋/ ICG-LPs +近红外光谱辐照组,和一个∼增长了2.3倍而自由协调小组/近红外照射组(图7 (b))。优越的抗癌效果GE11-CUR / ICG-LPs可能归因于高细胞内药物浓度和优秀的光热光谱分析效率。

EGFR-downstream PI3K / AKT信号通路可能是一个最重要的途径影响许多细胞过程包括生长、增殖,新陈代谢,和自噬46]。PI3K / AKT信号通路的调节与保护密切相关的细胞对凋亡[47]。因此,我们下决定是否GE11-CUR / ICG-LPs +近红外光谱辐射可能会影响在A549细胞PI3K / AKT信号。在数据显示7 (c)和7 (d),虽然没有明显的PI3K和AKT表达水平的变化,PI3K和AKT的磷酸化水平下调显然治疗后免费CUR /协调小组,坏蛋/ ICG-LPs, GE11-CUR / ICG-LPs近红外光谱辐照紧随其后。GE11-CUR / ICG-LPs +近红外光谱治疗显示最强的抑制PI3K和AKT的磷酸化水平与其他治疗方法相比。因此,这些结果进一步证实GE11-CUR / ICG-LPs可以把chemophotothermal治疗诱导增强癌细胞凋亡通过凋亡信号通路的激活和抑制EGFR-mediated PI3K / AKT途径。

4所示。结论

总之,NIR-sensitive和EGFR-targeted GE11-CUR / ICG-LPs开发这项工作通过coencapsulation协调小组和坏蛋GE11肽共轭脂质体chemophototherapy的协同组合。拟议中的GE11-CUR / ICG-LPs不仅可以积极目标肿瘤细胞中EGFR过表达的也使选择性药物释放控制的近红外光谱光,显著提高药物浓度在肿瘤站点,可以显著降低坏蛋的脱靶效应。在808 nm近红外激光辐照产生的高热协调小组可以切除肿瘤强劲;,另一方面,也可以触发释放CUR GE11-CUR / ICG-LPs根除残余癌细胞,从而实现协同作用的抗肿瘤作用。我们的结果也表明了,GE11-CUR / ICG-LPs与近红外光谱辐照能诱导癌细胞凋亡促进活性氧的生成和细胞骨架破坏通过凋亡信号通路的激活和抑制EGFR-mediated PI3K / AKT途径。综上所述,这近红外光谱对照GE11-CUR / ICG-LPs和癌症有针对性的设计综合了小说chemohyperthermic抗癌治疗的策略。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者真诚地感谢小明朱博士从澳门科技大学的支持。这项工作得到了澳门科学技术发展基金(项目号028/2014 / A1)和广东省自然科学基金(2018号a0303130002)。