文摘
在这项研究中,银纳米粒子(AgNPs)使用水提物的合成荆芥deflersiana工厂。准备AgNPs (ND-AgNPs)检查通过紫外-可见光谱、傅里叶变换红外(FTIR)光谱、x射线衍射(XRD)、透射电子显微镜(TEM)、扫描电子显微镜(SEM)和能量色散谱(EDX)。不同特征的获得的结果显示,平均大小的合成AgNPs 33海里,在面心立方结构。ND-AgNPs的抗癌潜力研究对人宫颈癌细胞(海拉)。细胞毒性反应是评估3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT),中性红(NRU)化验,吸收和形态学变化。此外,细胞毒性的浓度的影响ND-AgNPs氧化应激标志物,活性氧(ROS)生成、线粒体膜电位(MMP),细胞周期阻滞和细胞凋亡/坏死进行了研究。观察到的细胞毒性反应浓度的方式。此外,结果还显示在活性氧显著增加,脂质过氧化(法律流程外包),以及降低MMP和谷胱甘肽(GSH)的水平。细胞周期和细胞凋亡/坏死试验数据分析展示ND-AgNPs-induced SubG1逮捕和凋亡/坏死细胞死亡。的biosynthesized AgNPs-induced细胞死亡在海拉细胞建议ND-AgNPs的抗癌潜力。 Therefore, they may be used to treat the cervical cancer cells.
1。介绍
诺贝尔金属纳米粒子吸引了科学界的兴趣由于他们迷人的应用领域的生物学、材料科学、医学等(1]。银纳米粒子特别是由于他们不同寻常的生化的[引起了公众的关注2(化学稳定性和导电性)和生物活性,如抗菌、抗真菌、抗炎、抗病毒、抗血管,抗癌,抗血小板的活动(3- - - - - -5]。此外,银纳米粒子已被用于服装(6),房间喷淋,洗衣粉,墙漆配方7,8),防晒霜,和化妆品9]。银纳米粒子也抑制hiv - 1病毒从绑定到宿主细胞在体外(10]。虽然各种各样的金属纳米粒子制备方法如紫外线辐射,激光消融,光刻,气溶胶技术、光化学还原是可用的(11- - - - - -13),重点是转向绿色合成的纳米粒子,利用细菌(14),酵母(15)、真菌(16)和植物(17]。绿色合成纳米颗粒的报告是干净的,无毒,成本效益和环保。在各种生物方法可用,microbe-mediated合成工业用有限的使用,因为他们需要杀菌条件。相反,植物提取物的使用纳米粒子合成有价值是因为易于扩大,减少biohazardous自然,避免了可怕的程序维护细胞系(18]。
癌症是一种威胁生命的疾病和全世界导致死亡的病例19]。根据世界卫生组织,每年癌症病例从1400万年的2012上升到2200万年的未来20年(20.]。因此,有效的发展和有效的抗肿瘤的药物是最说服目标之一。在各种方法中,天然产物的开发是最成功的方法来识别小说支安打,领导(21]。荆芥deflersianaSchweinf。(唇形科)是一种药用植物生长在沙特阿拉伯(22]。传统上n deflersiana被用作镇静剂;叶煎煮茶是在酒后释放胃和燃烧问题[23,24]。抗菌,抗癌,抗氧化活动n deflersiana记录(25]。最近,我们报道的积极作用n deflersiana对人类乳腺癌和肺癌细胞系(26]。然而,直到现在,没有公布的数据合成纳米粒子的使用上都是可用的n deflersiana工厂。在此,我们报告(i)首次合成银纳米粒子(ND-AgNPs)通过一个单步银离子还原n deflersiana植物提取物(图1)和(2)研究了抗癌活性biosynthesized银纳米粒子对人类宫颈癌(海拉)细胞。
2。材料和方法
2.1。植物材料、试剂和耗材
荆芥deflersiana(唇形科)植物从Shaza收集山脉,沙特阿拉伯。工厂的身份证实了雅各布·托马斯博士,已经和凭证标本(# 15797)存入标本。细胞培养基,antibiotics-antimycotic解决方案、胰蛋白酶和的边后卫从英杰公司采购,美国。塑料制品及其他耗材从Nunc,丹麦。其他化学物质/试剂用于本研究从σ,购买美国。
2.2。植物提取物的制备
的地上部分n deflersiana收集与蒸馏水洗几次除尘,干下阴凉处。脱水的植物被切割成小块,浸渍在蒸馏水中,过滤在重力和溶剂使用旋转蒸发器蒸发减少压力。干提取保持在4°C(图1)。
2.3。银纳米粒子的合成
的水提物n deflersiana(500毫克)溶解在100毫升蒸馏水。进一步10毫升以上提取加入90毫升0.1 AgNO3解决方案。24小时孵化后,溶液变成深棕色,这表明AgNPs的形成。然后将溶液转移到一个圆底烧瓶,加热连续搅拌在90°C。15分钟后,离心是在室温和9000 rpm的速度。用蒸馏水洗涤三次后获得的黑火药在烤箱干一夜之间在80°C。
2.4。合成银纳米粒子的表征
研究了绿色合成银纳米粒子的光学吸收利用红外光谱(日本岛津公司红外威望21)和紫外可见光谱分析(日本岛津公司紫外可见2550年,日本),分别。傅里叶红外(FTIR)光谱传输记录使用KBr颗粒在4000到400厘米−1。绿色合成的晶体性质AgNPs证实了x射线衍射模式。XRD数据记录使用PANalytical X 'Pert X射线衍射仪使用铜Kα(λ= 1.54056)。形态、大小和电子衍射模式是由扫描电镜检查(地产- 7600 f、日本)和TEM (jem - 2100 f,日本)电压200 kV,分别。EDX分析是用来证实在绿色合成AgNPs单质银的存在。
2.5。通过MTT细胞毒性试验
ND-AgNPs细胞毒性的研究利用MTT试验根据方法(27]。总之,海拉细胞获得美国类型文化收藏,美国被镀在96孔板的密度1 x 104细胞/。细胞暴露于1 - 100μg / ml ND-AgNPs 24 h。这后,MTT添加井,和盘子被进一步孵化4 h。反应混合物摄出来,200年µl /添加DMSO和混合几次上下吸量。板的吸光度测量在550海里。结果表示为比例控制。
2.6。细胞毒性的中性红吸收(NRU)测定
使用过程[执行由NRU细胞毒性试验27]。简单地说,海拉细胞处理1 - 100µg / ml ND-AgNPs 24 h。然后,细胞被洗两次与PBS和进一步孵化50µ克/毫升含有介质的中性红3 h。这些细胞被洗了一个解决方案(1% CaCl2和0.5%甲醛)。染料中提取1%醋酸和50%乙醇的混合物。板块在550纳米测量。结果表示为比例控制。
2.7。形态分析
形态学观察显微镜下的变化来确定变化引起ND-AgNPs在海拉细胞治疗1µ克/毫升到100µ克/毫升ND-AgNPs 24 h。细胞被抓住了20 x的图像通过使用相差倒置显微镜(美国奥林巴斯CKX 41)。
2.8。谷胱甘肽(GSH)的水平
谷胱甘肽的耗竭水平测量后协议(28]。总之,海拉细胞暴露于做µg / ml ND-AgNPs 24 h离心机,和细胞蛋白质沉淀在10%柠檬酸(1毫升)。这后,上层清液被离心10分钟。然后在3000 rpm, 2毫升三羟甲基氨基甲烷缓冲液(0.4米)与EDTA(0.02米)和0.01 5,5 ' -dithionitrobenzoic酸(DTNB)上层清液中加入。吸光度测量在412 nm孵化后10分钟37°C。
2.9。脂质过氧化(法律流程外包)
法律流程外包在ND-AgNPs-exposed海拉细胞测定方法(后28]。各自的治疗后,细胞在冷冻用1.15%的氯化钾溶液。离心后,1毫升的上层清液加入2毫升硫代巴比土酸溶液(柠檬酸(15%),稍后通知(0.7%)、盐酸和0.25 N)。最终的解决方案是然后在100°C煮15分钟,之后,在1000×10分钟的离心分离 ,吸光度测量550海里。
2.10。ROS生成
细胞内ROS生成测量使用2,7-dichlorodihydrofluorescein二乙酸(DCFH-DA)染料28]。总之,海拉细胞治疗与不同浓度(10 - 50µND-AgNPs 24 h g / ml)。细胞被DCFH-DA (5µ在37°C M) 1 h。细胞颗粒收集在PBS (500μl)在3000转离心5分钟。然后,细胞用流式细胞分析仪进行分析。
2.11。线粒体膜电位(MMP)
海拉细胞MMP的水平是衡量使用定义的方法Zhang et al。29日]。总之,海拉细胞治疗与10到50μ克/毫升ND-AgNPs 24 h。然后,处理和未经处理的细胞被孵化与罗丹明- 123 (5μg / ml) 1 h在37°C在黑暗。细胞被洗了两次,最后,细胞颗粒resuspended PBS (500μl)。MMP利用流式细胞分析仪测定。
2.12。细胞周期分析
ND-AgNPs-induced改变细胞周期测定使用的协议(30.]。总之,海拉细胞被暴露在10 - 50为24小时µ克/毫升ND-AgNPs。治疗后,细胞被固定在冷冻70%乙醇1 h。然后,细胞被离心洗两次,细胞被沾propidium碘60分钟在黑暗。染色细胞流式细胞分析仪获得的。
2.13。细胞凋亡检测
在海拉细胞凋亡/坏死引起ND-AgNPs分析使用Annexin-V和7-AAD工具包(贝克曼库尔特)遵循制造商的协议。细胞凋亡/坏死的治疗量海拉细胞被流式细胞术分析协议后(31日]。
2.14。统计分析
数据统计分析方差分析使用事后Dunnett的测试。价值被认为是一个重要的水平之间的接触和控制集。结果提出了三个实验的平均值±标准偏差。
3所示。结果和讨论
3.1。ND-AgNPs的合成和表征
植物提取物的n deflersiana是用于ND-AgNPs在温和的条件下合成的。无色的硝酸银溶液(图1)把深棕色表明银纳米粒子的形成(AgNPs)。棕色的发生可以归因于表面电浆子(32),价电子的集体振荡引起的入射辐射的电磁场。图2(一个)显示了UV-V光谱合成AgNPs,给等离子体共振在400海里。特征λ马克斯对AgNPs 400 - 500纳米的范围(33]。表面等离子体吸收的位置和形状取决于粒子的形状和大小,颗粒间的距离和周围介质的介电常数(34,35]。类似的观察报告(早些时候32,36]。红外光谱测量进行了识别各种官能团在生物分子负责银离子的还原AgNPs和限制/ AgNPs稳定。乐队在不同地区的光谱强度n deflersiana提取(图2 (b))和biosynthesized银纳米粒子(图2 (c))进行分析。两个红外光谱谱之间的相似之处,一些边际变化峰值明显指示植物提取物也作为覆盖剂。的n deflersiana植物提取物显示数量的峰值反映出复杂的植物提取物的性质。山峰的转变为3426厘米−1相应的酰胺NH伸展(II)乐队或切断拉伸或伸缩振动地牵连,他们组可能直接参与合成AgNPs的过程。此外,峰值变化从1689厘米−1到1608厘米−1表示可能参与C = O拉伸或碳氮酰胺基的弯曲。此外,1461厘米的峰值变化−1到1381厘米−1建议碳氢键的参与或地弯曲振动甲基、亚甲基、或酒精组在减少。此外,观察到山峰更黄酮类和萜类化合物的特征37中)荆芥物种(25,26]。可以推测,这些次生代谢物合成/ ND-AgNPs稳定负责。
(一)
(b)
(c)
(d)
绿色合成的晶体结构AgNPs由XRD技术决定。图2 (d)显示AgNPs合成的x射线衍射模式。布喇格反射与2θ值为37.89,44.23,64.26,和77.24对应(111),(200),(220)和(311)集的点阵平面,分别观察。这些可以被索引的面心立方(fcc)结构合成AgNPs。的晶体大小AgNPs使用粉末由方程(38]: 在哪里晶粒尺寸,x射线的波长(1.54056),然后呢是衍射峰的半最大值处全宽度(弧度)。
的平均晶粒尺寸由扩大(111)反射大约在33海里。(早些时候报告了类似的结果39]。属于以外没有任何反射银晶格清楚地表明,合成AgNPs晶格不受其他分子中提取的植物。扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)来研究合成AgNPs的形态和结构特征。SEM图像(图3(一个))表明,相对球面和均匀的纳米颗粒形成。一些较大的粒子可能是由于聚合的溶剂的蒸发引起的纳米颗粒在样品制备(40]。TEM图像(图3 (b))揭示了纳米粒子形成有一个狭窄的粒径分布。平均大小约33海里,进一步支持XRD的结果。此外,能量色散x射线能谱(EDX)研究是用来检测银元素的存在。图3 (c)显示了EDX的形象n deflersianaAgNPs合成。结果清楚地表明一个强烈的信号在大约2.98 KeV对应金属银纳米晶体的存在,由于发生表面等离子体共振(SPR) [41]。另一个强烈的信号在0.0至-0.5 Kev代表的特征吸收氧气和碳。这表明的存在n deflersiana植物提取物作为一种限制AgNPs表面配体。
(一)
(b)
(c)
3.2。细胞毒性的评估ND-AgNPs MTT和NRU化验
关键结果MTT和NRU化验的海拉细胞暴露于1µ克/毫升到100µg / ml总结了24小时的数据4(一)和4 (b)。结果表现出浓度依赖的减少在海拉细胞的可行性。细胞生存能力被记录在ND-AgNPs 2 86%和29%µg / ml和5µ克/毫升的浓度,分别;然而,最大的减少细胞生存能力测量每个10 9%,25日,50和100µ克/毫升ND-AgNPs(图4(一))。和MTT试验一样,浓度降低电池的可行性海拉细胞暴露于ND-AgNPs也是NRU试验观察到。细胞生存能力被记录在ND-AgNPs 2 87%和43%µg / ml和5µ克/毫升的浓度,分别;然而,最大的减少细胞生存能力测量为100 23%µ克/毫升ND-AgNPs(图4 (b))。在这项研究中,使用两个独立的细胞毒性进行评估端点(MTT和NRU)化验(42]。MTT比色测定,是基于可行的细胞的线粒体脱氢酶酶(43];然而,NRU分析是基于可行的细胞的溶酶体的完整性(44]。ND-AgNPs的细胞毒性反应,表明biosynthesized AgNPs可以提供替代化学治疗剂。我们的结果显示,超过50%的细胞死亡甚至在5µND-AgNPs g / ml。ND-AgNPs在低浓度引起的细胞毒性效应可能是由于工厂组件连接到AgNPs [45]。这个研究的结果也很好地支持各种证据的细胞毒性效应biosynthesized AgNPs使用番荔枝属squamosa叶提取物对乳腺癌MCF-7细胞系(46),Piper longum叶提取物对Hep-2癌症细胞系(47),而Morinda citrifolia对海拉细胞系(48]在体外。
(一)
(b)
(c)
3.3。在显微镜下的形态分析
海拉细胞形态学的观察到的改变对待ND-AgNPs 1 - 100µg / ml 24 h呈现在图4 (c)。没有显著改变控制海拉细胞的形态学观察。控制细胞出现在正常的形状和表面上了。然而,海拉细胞暴露于ND-AgNPs失去典型的形状和细胞粘附能力,缩水,并降低细胞密度。这种变化也被报道使用植物合成AgNPs不同癌症细胞系(46),这表明AgNPs合成的细胞毒性效应可能是由于抗肿瘤的性质和他们的能力通过无数的诱导细胞死亡的分子机制(45]。
3.4。谷胱甘肽耗竭和脂质过氧化水平
数据5(一个)和5 (b)总结了减少谷胱甘肽水平,增加脂质过氧化在海拉细胞暴露于ND-AgNPs做些μ克/毫升浓度24 h。结果表明浓度降低谷胱甘肽的水平。谷胱甘肽的耗竭是40%,55%,和69%在5、10和25μg / ml,分别与控制(图5(一个))。ND-AgNPs-induced的影响在海拉细胞脂质过氧化暴露24 h如图5 (b)。浓度显著增加法律流程外包水平也是海拉细胞中观察到。观察法律流程外包的增长水平为25%,56%,和65%在5、10和25μ克/毫升浓度分别为ND-AgNPs(图5 (b))。氧化应激是参与nanoparticles-induced细胞死亡(49]。在这项研究中观察到,减少谷胱甘肽水平和脂质过氧化水平的增加表明氧化应激的作用在海拉细胞死亡细胞系ND-AgNPs。我们的结果很好地支持以前的报告,减少谷胱甘肽水平和脂质过氧化水平的增加已经观察到由于接触纳米颗粒在不同细胞系(49,50]。
(一)
(b)
3.5。测定细胞内活性氧(ROS)
ROS生成的结果海拉细胞暴露于ND-AgNPs 24 h图所示6(一)和6 (b)。显著诱导的活性氧生成测量在海拉细胞暴露于ND-AgNPs 10、25、50µ克/毫升浓度。如数据所示6(一)和6 (b),比上年增长207%、167%和160%在ROS生成5,10,25岁μg / ml,分别比未经处理的控制。提出了纳米颗粒诱导其毒性通过氧化应激产生活性氧(ROS)参与各种不同的细胞过程,从细胞凋亡和坏死细胞增殖和致癌作用51]。它已经报道,纳米颗粒在细胞水平上增加活性氧的生成。调查的潜在作用ND-AgNPs海拉细胞中,细胞内ROS生成评估了HDCF-DA染料使用流式细胞分析仪。增加ROS水平观察到在这项研究中证实AgNPs诱导活性氧生成,导致氧化应激和细胞死亡。此外,与先前的报道一致,plant-synthesized AgNPs诱导活性氧生成能力,可能导致凋亡细胞死亡(52]。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.6。线粒体膜电位(MMP)
数据6 (c)和6 (d)说明MMP的变化水平。海拉细胞治疗24小时汽车销售µ合成ND-AgNPs g / ml。显著诱导MMP的水平在海拉细胞被发现。的诱导MMP的水平被发现109%,121%,和114%在5、10和25μ相比,g / ml,分别控制(数据集6 (c)和6 (d))。这项研究的结果表明,线粒体膜的完整性可能参与AgNPs-induced海拉细胞死亡。能够很好的证明,ROS生成高水平可以导致细胞损伤,导致线粒体膜损伤,从而引起毒性(53,54]。基于阳离子荧光探针Rh123染料,诱导MMP的水平表明活性氧生成和氧化应激的作用在AgNPs-induced海拉细胞死亡由于自由基的生成55]。
3.7。细胞周期分析
细胞周期分析的结果在海拉细胞暴露于ND-AgNPs 10 - 50µg / ml 24 h图表示7。流仪测量propidium iodide-stained控制和ND-AgNPs-treated海拉细胞显示凋亡增加SubG1高峰。显著增加SubG1逮捕是观察到50μ克/毫升的浓度ND-AgNPs-treated海拉细胞(图7)。人口的增加SubG1(凋亡)发现在这个研究表明ND-AgNPs-treated海拉细胞无法通过G2检查点;因此,G2 / M过渡被发现受到影响。由于存在细胞凋亡诱导SubG1高峰的过程中细胞周期表明早期和晚期凋亡/坏死的作用通路(56,57]。
(一)
(b)
3.8。细胞凋亡/坏死评估使用膜联蛋白V-PE 7-AAD
诱导细胞凋亡/坏死的结果在图中使用流式细胞仪进行了总结8。流式细胞仪数据清楚地表明,在海拉细胞ND-AgNPs诱导细胞死亡。基于膜联蛋白V-PE / 7-ADD染色,控制94.2%的海拉细胞被发现还活着值的0.56%,3.31%,和1.9%的细胞,正常细胞生长过程文化。海拉细胞暴露在ND-AgNPs显著增加晚期凋亡和坏死细胞比未经处理的控制。凋亡和坏死细胞的百分比的增加被发现之间的30.3 - -69.8%和18.8 - -25.3%的值10µ50 g / mlµ分别为g / ml ND-AgNPs浓度(图8)。即使在较低的浓度,即。,10µg / ml, ND-AgNPs发现诱导凋亡和坏死的细胞死亡。众所周知,高数量的ROS生成可能导致凋亡和坏死细胞死亡58]。过多的活性氧生成已与大量的DNA损伤和细胞凋亡/坏死(59]。我们的结果根据最近的报告显示凋亡细胞死亡,由于纳米颗粒的接触60),包括plant-synthesized银纳米颗粒的接触52]。
4所示。结论
这次调查证明了银纳米粒子的生物合成(AgNPs)首次通过单步还原银离子使用荆芥deflersiana植物和其抗癌潜力反对人类宫颈癌(海拉)细胞。我们的研究结果表明,biosynthesized AgNPs (ND-AgNPs)诱导浓度在海拉细胞细胞毒性。ND-AgNPs也发现诱导氧化应激所观察到的ROS和法律外包水平的增加和减少谷胱甘肽的水平。增加细胞内ROS生成最终被发现触发线粒体膜损伤和细胞周期的发展变化。这项研究还显示,ND-AgNPs诱导细胞凋亡和坏死细胞死亡有能力通过SubG1海拉细胞的细胞周期阻滞。因此,我们的研究结果建议的抗癌潜力biosynthesized ND-AgNPs对人宫颈癌细胞和可能发挥重要作用的发展新治疗剂治疗癌症。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这个研究项目的资助支持的“女性研究中心的科学和医学院校”,院长职科研、沙特国王大学。