Co(II)在原核锌指结构域中的配位

摘要

Co(II)电子构型可作为紫外-可见光谱探针，用于表征锌结合蛋白功能结构中必不可少的金属配位球，并评估这些蛋白的金属离子亲和力。在这里，利用原核锌指的能力，利用不同的残基组合来适当地协调结构金属离子，我们提供了Co(II)添加到Ros87及其突变体Ros87_C27D的紫外-可见表征，该突变体具有不寻常的CysAspHis₂协调球体。锌指部位只含有一个半胱氨酸的情况很少被发现。我们展示了CysAspHis₂协调的激烈d-d过渡带，相对于Cys蓝移₂他的₂球体。这些数据与核磁共振和CD数据相辅相成，表明在单半胱氨酸配位球的情况下，金属位点的四面体几何形状也被保留。

1.介绍

蛋白质复合物中的金属离子发挥许多基本的生物学功能，从简单的结构作用到直接参与催化活动[1，2］.事实上，金属蛋白非常丰富，许多生物金属都有d轨道电子，允许它们经历不同的氧化态。此外，过渡金属允许d-轨道杂化与配体的复合物，从而得到更多配体的配位和各种配位构型[3.］.在不同的蛋白质位点，可以发现金属离子与内源性(多肽的主链和侧链原子)或外源性配体(即与蛋白质结合的其他分子)结合[4，5］.许多蛋白质结合的金属是二价离子，蛋白质对金属的亲和力评价一直是众多研究的对象[6- - - - - -11］.在不同缓冲液和不同pH值下所测得的亲和度显示出它们对测量条件和分析方法的依赖性。对特定金属离子的亲和性，无论是天然的还是外生的，对金属蛋白的完全特性来说都是一个重要的信息，无论使用什么技术，众所周知，它关键依赖于氨基酸的配位。

在金属蛋白和金属结合域中，以锌离子结构为特征的锌指基序无疑是最具代表性的[12- - - - - -15由于其在生物界的普遍存在(例如，人类基因组中3%的基因编码含有锌指蛋白的蛋白质[16，17])。

锌指家族是由几个成员，结合锌与半胱氨酸和组氨酸的不同组合。在经典的真核生物锌指中，两个半胱氨酸和两个组氨酸以高亲和力结合锌。也可以发现四个半胱氨酸配位位点以及由三个Cys和一个His组成的位点与结构锌离子紧密结合，这种配位对于结构域折叠总是必不可少的[12- - - - - -15］.

原核半胱氨酸的dna结合区域₂他的₂锌指蛋白Ros (Ros87)的结构域与真核生物的结构域不同，且明显大于真核生物的结构域。Ros87由结构锌和一个15-残基疏水核连接在一起，由58个残基组成，呈βββαα拓扑结构[18］.许多Ros同系物(Ros/MucR家族)已被鉴定[14，19- - - - - -24，其中配位球似乎只由一个(第一个)半胱氨酸组成[19］.第二个协调残基通常是一个天冬氨酸，这表明该区域可能存在CysAspHis₂协调。Ros87_C27D的结构表征[25]，一个在第二配位上有天门冬氨酸的Ros87突变体，已经证明该残基通过单配位锌离子代替了第二半胱氨酸的作用;这种突变只是轻微地扰乱了结构域的功能结构。

当描述锌蛋白/肽相互作用的主要问题是锌(II)是一个d离子，光谱无声。因此，如果结合、折叠或展开伴随结构变化[8]可以通过圆二色性(CD)或核磁共振(NMR)来评估锌离子亲和力，但一般来说，评估锌离子亲和力的最扩散程序是考虑一个完全负载Co(II)的蛋白质，并通过紫外-可见光谱法跟踪Co(II)被锌置换[6，15，26- - - - - -30.］.

钴(II),作为一个d7离子作为探针，可以取代天然金属进入被检测蛋白的结构和催化金属结合位点。Co(II)和Zn(II)的大小几乎相同[31](离子半径分别为0.58 Å和0.60 Å)，许多锌结合位点已被证明是金属可取代的[32- - - - - -35］.在某些情况下，当Co(II)取代天然Zn(II)时，具有催化锌位的酶被证明具有类似甚至更高的酶活性[3.］.

在配体Co(II)配位时，能级发生分裂d轨道电子发生。Co(II)配体系统吸收特定波长的光，这是由于所谓的d-d跃迁，即兴奋和弛豫d轨道电子(36］.配位配体的性质和数量以及系统的整体配位几何决定了吸收发生时的波长和强度[37，38)热烈的乐队ε> 300⁻¹厘米⁻¹)在625±50 nm处显示四面体配位和弱带(ε≤30米⁻¹厘米⁻¹)在525±50 nm处显示八面体配合物。中间频带(50≤ε≤250⁻¹厘米⁻¹)表示五配位[26］.

Co(II)也给出了不同波长的吸收带:由于S⁻→Co(II)配体-金属电荷转移(LMCT)，在近紫外光谱中存在316 ~ 340 nm的强吸收带。这个波段非常有用，因为在320 nm的消光系数的大小允许推断S的数量⁻-Co(II)债券作为每个债券的贡献ε约900-1200 M⁻¹厘米⁻¹［39，40］.总结,ε在~ 320 nm处可以计数S⁻参与了协调工作ε在~ 600 nm被用来检测配位几何和假设其他配体的性质[26］.

在这里，利用原核锌指的能力，利用不同的残基组合来适当地协调结构金属离子[18，25，41，我们描述了Co(II)结合对更大的原核锌指结构域Ros87和其突变体Ros87_C27D的影响。

2.材料和方法

2．1．蛋白表达与纯化

所使用的所有蛋白均如之前报道的那样表达和纯化[42］.所有实验都只使用新鲜制备的样品。简单来讲,_宠物ros56 - 142 (Ros87)和_宠物Ros56-142_C82D (Ros87_C27D)蛋白的合成如下:¹⁵核磁共振实验的N标记是通过在37°C的改良的最小培养基中包含¹⁵NH₄Cl为唯一氮源，而在UV-Vis和圆二色性实验中，蛋白在LB培养基中表达。在这两种情况下，用1.0 mM IPTG诱导蛋白表达约2.0 h。

然后收集细胞，悬浮在20 mM Na中₂HPO₄(pH 6.8)缓冲液，超声裂解。细胞粗提物经离心纯化，上清液应用于Mono S HR 5/5阳离子交换色谱柱(Amersham Biosciences)。将含有蛋白质的混合组分应用于HiLoad 26/60 Superdex 75 (Amersham Biosciences)凝胶过滤色谱柱。

2．2．紫外可见光谱

在150µM TCEP存在的情况下，使用0.1 M HCl将蛋白溶液酸化至pH 2.5，并透析10 mM Tris, 150µM TCEP, pH 2.5，从而去除天然锌离子，获得apoRos87和apoRos87_C27D。最终将pH调整到6.5，并在整个实验过程中严格控制pH。采用10 mM Tris, 20µM TCEP, pH 6.5，在Shimadzu UV-1800分光光度计上记录室温下200 ~ 800 nm范围内对Ros87和apoRos87_C27D的Co(II)加入实验的紫外-可见光谱。对载脂蛋白溶液(Ros87为4 μM, Ros87_C27D为3 μM)进行了等量滴定，每一步增加0.4 μM的最终Co(II)浓度。0.1毫米CoCl₂使用1.6 Co(II)/蛋白比的溶液。每个实验至少重复三次，以获得可比较的结果。在pH值为2.5的情况下，通过280 nm的吸收得到蛋白质浓度。

2．3.核磁共振光谱学

NMR样品中含有150 μM的蛋白质，在pH 6.5的10 mM Tris和150 μM TCEP中，存在1.4当量的CoCl₂和90% H₂O / 10%²H₂O.所有的HSQC光谱记录在298 K的布鲁克Avance III HD 600mhz上，配备了低温探针，位于坎帕尼亚-路易吉万维泰利大学(Caserta，意大利)的环境、生物和制药科学与技术系。¹H和¹⁵采用TMS作为外部参考，间接标定N化学位移。所有NMR波谱数据均使用TopSpin 3.5软件(Bruker)进行处理，并使用计算机辅助共振赋值进行分析[43] (CARA)软件cara.nmr.ch）.

２.４.圆二色性

采用装有Peltier温度控制装置的JASCO J-815 CD偏振分光计进行圆二色实验。数据采集在200-260 nm波长范围内，使用路径长度为1 cm、数据间距为1 nm、带宽为1 nm、扫描速度为50 nm/min的石英试管。所有CD样品在pH为6.5的10 mM Tris和150 μM TCEP中均含有约15 μM的蛋白质。一种新鲜的氯化钴溶液₂5.0 mM已经被用来达到一个最终的[公司^２＋/[蛋白质]的1.4倍。所有的光谱都是重复的，并从缓冲液的贡献中减去。使用服务器BeStSel进行光谱反褶积[44］.

3.结果与讨论

用CoCl滴定载脂蛋白-Ros87(即未展开的原核锌指Ros87，没有天然锌(II)结合)和载脂蛋白- ros87_c27d(即Ros87与天门草突变的第二配位半胱氨酸)的紫外-可见光谱₂如图所示1(一)和2(一个)．

以Co(II)-Ros87为例ε在近紫外(~ 320 nm)中，反映硫代酸基配位数的值为1950 M⁻¹厘米⁻¹在350 nm处，表明该蛋白使用两个硫醇基团与Co(II)离子配位。另一方面εCo(II)-Ros87_C27D的值是1020 M⁻¹厘米⁻¹在345 nm处，表明Co(II)配位中有一个硫醇基团参与。在这两种情况下,缺乏频谱的形状的变化和过渡的波长在滴定允许排除复合物的形成与不同的蛋白质/公司(II)比率(即2:1,3:1,或更多)形成在低有限公司(II)浓度(28］.这种UV-Vis行为以前在HEPES缓冲液中的相同蛋白质上独立观察到[25］.

两种蛋白在589-670 nm附近也观察到强烈的吸收带。这些结果表明，Ros87以四面体几何形式与Co(II)配合。此外，Co(II)-Ros87_C27D表现出强烈的d-d吸收带以589 nm为中心ε380米值⁻¹厘米⁻¹在这种情况下也表示四面体几何。

因此,数据1 (b)和2 (b)显示两个¹H -¹⁵在1.4等量Co(II)离子存在下，Ros87和Ros87_C27D的N HSQC谱线。在质子和氮维度上，两种光谱都显示出强烈和离散的信号，表明Ros87和Ros87_C27D与顺磁Co(II)的相互作用，这两种情况都产生了具有稳定的三重结构的折叠构象(Co(II)-Ros87和Co(II)-Ros87_C27D)。重要的是，在不受Co(II)顺磁性影响的区域，这两个光谱与holo-Ros87光谱(数据未显示)有意义地重叠，这表明钴负载蛋白的结构与锌负载蛋白非常相似。

因此，CD光谱也表明，这两种蛋白质的二级结构含量在Co(II)负载结构中似乎相对于锌负载构象是很保守的(图)1 (c)和2 (c)）.实际上，这两种CD光谱都具有结构良好的蛋白质的特征，包括α-螺旋和β-薄片二级结构。我们使用服务器BeStSel从CD数据估计了这两个蛋白质的蛋白质二级结构(图)1 (d)和2 (d)）.该服务器通过线性组合固定基分量拟合CD实验曲线，得到8个二级结构元素的百分比[44］.数据表明Co(II)-Ros87和Co(II)-Ros87_C27D结构具有与ros87计算结构(PDB代码2JSP)和Ros87_C27D计算模型相似的二级结构含量[25]使用MOLMOL软件确定[45]及渠务署署长[46，47］.

这里报告的数据总体上表明，Co(II)络合具有与天然锌相似的四面体配位几何结构，并且Co(II)对锌离子的置换不会剧烈地扰乱原核生物锌指结构域的结构特性。

有趣的是，将Ros87_C27D的紫外-可见光谱与文献报道的具有Cys的锌指的紫外-可见光谱进行了比较₂他的₂,半胱氨酸_3.他和半胱氨酸₄协调描绘了一个蓝色的移动d-d用单个半胱氨酸来配合金属离子的蛋白质的过渡带[48)(图2）.这种转变与Krizek等人的报告一致[10，他描述了越来越多的转变d-d随着配位半胱氨酸数目的减少，转变到更高的能量。仅含有一种半胱氨酸的锌指状金属位点的紫外-可见光谱很少有报道[48］.在真核生物Cys中₂他的₂ZF，在某些情况下，第二半胱氨酸的取代可能导致(例如，与天门冬氨酸或谷氨酸的取代[48)在配位几何上不同于本地四面体配位所表现的弱d-d吸收带。在这里，我们发现了一个强烈的波段在589 nm，与NMR和CD数据，表明金属离子的四面体配位导致蓝移d-d吸收带。因此，我们提出了Co(II)在不同半胱氨酸和组氨酸数目的锌指中的四面体配位光谱方案(图3(一个))[37，49]可以实现(图3 (b))与我们的结果。

我们还测定了两种蛋白质对Co(II)的亲和力，通过在pH 6.5的Tris缓冲液中直接滴定，表明当Co(II)/蛋白质摩尔比等于1.4时，复合物最终形成。使用1:1模型拟合UV数据(图4)[30.，得到β常数的下限为5.59(±1.97)× 10⁻⁸Ros87和2.35(±0.92)×10⁻⁷Ros87_C27D。

(一)

(b)

用Zn(II)连续滴定载Co(II)蛋白，诱导两个条带的逐渐减少;与Co(II)相比，Zn(II)离子在添加两倍过量时的消失表明Co(II)离子被光谱惰性Zn(II)离子取代。

4.结论

在这篇文章中，我们报道了原核生物锌指Ros87(一种天然锌蛋白)及其突变体Ros87_C27D的Co(II)取代形式的光谱和结构特征，其中第二配位半胱氨酸突变为天冬氨酸。只有一种半胱氨酸的锌指位点的紫外-可见光谱，既不涉及锌，也不涉及其他感兴趣的金属，很少被报道[48］.以真核生物Cys为例₂他的₂锌指，在某些情况下，第二配位半胱氨酸的取代可能导致(例如，与天门冬氨酸或谷氨酸的取代[48)的配位不同于几何上的原生四面体配位所示的弱d-d吸收带;当组氨酸取代半胱氨酸时，配位仍然是四面体。在这里，我们展示了，在原核生物领域，本机与钴锌的替换突变并不深刻影响的结构域和第二配体氨基酸的替换与天冬氨酸产生强烈的乐队在589 nm,表明这个替换不显著改变金属离子的四面体几何协调。我们还展示了如何存在一个单一的半胱氨酸在蛋白质的协调球暗示强d-d紫外-可见光谱中的吸收带，相对于两个半胱氨酸配位发生蓝移。

与小的真核生物结构域不同的是，我们的数据概述了在像Ros87_C27D这样的大蛋白的情况下，构成结构的其他元素(例如大疏水核)在决定配位球的几何形状方面发挥了决定性作用。总的来说，紫外-可见光谱技术被证实是一种非常好的、非常灵敏的工具，可以用来确定结构金属位点中配体的数量和几何形状。

的利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

财政支持由Ministero dell ' isstruzione提供，dell 'Università e della Ricerca no。20157 wzm8a。

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生物无机化学与应用

摘要