大豆提取物制备的纳米铜和氨基酸螯合纳米铜的抗菌性能

摘要

本文比较了铜-氨基酸螯合物和纳米铜的抗菌性能大肠杆菌，金黄色葡萄球菌,粪肠球菌．用大豆水提物合成了这些铜-氨基酸螯合物，并以铜-氨基酸螯合物为原料制备了铜纳米颗粒。采用标准微量稀释法(CLSI M100-S25 2015年1月25日)评价样品的抑菌活性。在抑菌活性测定中，将铜离子和铜- edta螯合物作为参考，使铜-氨基酸螯合物特别适合作为抑菌剂，具有很好的应用前景。同时采用MTT法(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基溴化四唑)验证其对细菌细胞的抑菌作用。对铜螯合物的抗菌活性显著增强，并发现一株特异性菌株粪大肠．其结果将最终导致更好地利用铜-氨基酸螯合物的具体应用，铜纳米颗粒不能使用。

1.介绍

众所周知，铜具有广泛的抗细菌和真菌的活性[1- - - - - -4］.由于抗生素耐药性的发展和传染病的激增，很多研究人员都在寻找新的抗菌剂[5- - - - - -11］.

尽管铜是各种应用中最广泛使用的材料之一，但由于其高防锈性，其纳米合成需要一些特别的注意。与金和银相比，铜对空气非常敏感，铜的氧化物相在热力学上更稳定。因此，铜纳米粒子表面氧化层的形成必然导致其抗菌性能显著下降[12- - - - - -14］.

近年来，人们对几种镍、铜、钴有机铜配合物的抗菌和抗肿瘤性能进行了测试。它们的作用方式可能是氨基酸和金属离子的结合，这可能会留下一些潜在的自由原子供体，增强生物活性[13，15- - - - - -17］.

螯合剂是高度稳定的产品，能够维持包围金属离子从一个有机分子(螯合剂);因此，应注意储存，避免其沉淀为不溶性氢氧化物[15，18］.

我们之前已经报道了大豆水提取物介导的非常稳定的铜纳米颗粒的合成；在这项工作中，我们报告了铜纳米颗粒和铜螯合物的抗菌活性，它们是离子铜和铜纳米颗粒之间的中间步骤[19］.主要目的是比较不同种类的铜，如铜纳米颗粒和铜螯合物的抗菌性能。这种比较研究将揭示菌株的特异性，并最终使铜-氨基酸螯合物在铜纳米颗粒不能使用的特定应用中得到更好的利用。

2.材料和方法

2．1．试剂

有组织的大豆是在当地的天然产品超市购买的;氢氧化钠(NaOH)和硫酸铜(CuSO)₄h·5₂O)的Sigma-Aldrich未经进一步纯化。实验全程使用milliq水(18.2 Ω);合成试剂为磷酸盐缓冲钠₂HPO₄和KH₂人事军官₄(Fermont)， Mueller-Hinton汤(BD Difco)，氯化钠(NaCl, CTR Scientific)，试剂盒MTT 3-[4,5-二甲基噻唑-2-yl]-2,5-二苯基溴化四唑(Sigma-Aldrich)。

2．2．描述

利用Ocean Optics S2000-UV-Vis系统获得了光学吸收光谱，使用jol -1230进行了100 kV下的透射电子显微镜(TEM)成像，进行了热重分析(TGA)，并使用动态光散射纳米级仪(DLS)测量了平均粒径。红外光谱(FTIR)由红外亲和力-1组成。

2．3.实验方法

制备6个样品，比较其杀菌活性;铜样品在40 mM浓度下合成。合成如下:(我)大豆提取物:取去离子水100 mL，加入3 g变形大豆，加热至沸点10 min;然后通过过滤将纤维分离。(ii)离子的溶液种:本溶液经加备而成在去离子水。(3)铜-大豆提取物螯合物:根据Guajardo-Pacheco等人之前报道的方法合成[19］.如上所述，制备了大豆提取液;之后，1克CuSO₄h·5₂加入O，磁搅拌混合15 min;用1m的氢氧化钠溶液将pH调整到7。(iv)铜纳米粒子的胶体分散:以硼氢化钠为还原剂，通过铜螯合络合物溶液的化学还原，在水相中制备铜纳米粒子。100ml的铜络合物溶液用N₂气体10分钟，以除去溶解氧;滴加1 mL硼氢化钠水溶液(0.1 M)，不断搅拌。溶液在完全加入还原剂后变成黑色，表示铜纳米颗粒的形成。纳米颗粒被乙醇反复洗涤[19］.(v)EDTA-铜螯合物:对于EDTA螯合铜溶液，加入1克CuSO₄h·5₂O和1 g EDTA混合在100 mL去离子水中。之前计算的Cu/EDTA比值为11.68。

２.４.抗菌测试

使用标准微量稀释法测试螯合物的抗菌活性，该方法确定了导致细菌生长抑制的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌剂浓度（MBC）（CLSI M100-S25 2015年1月）。所测试的菌株是大肠杆菌(写明ATCC 25922),金黄色葡萄球菌（ATCC 29213），以及粪肠球菌(写明ATCC 29212)。将细菌浓度标准化为568 nm处的光密度为0.2(约为1 × 10)⁸CFU/mL)。将分散体中的螯合物用50稀释μL缪勒-欣顿肉汤和50μL磷酸缓冲液接种菌株，接种浓度为1 × 10⁵CFU/mL培养24 h°C (20.］.

2．5．MTT试验

MTT法检测细菌细胞增殖情况。细菌细胞(10⁵CFU/mL)孵育到Mueller-Hinton肉汤中，浓度为50μ在96孔微量滴定板中每孔1个。将三倍系列稀释的铜氨基酸螯合物添加到含有细菌细胞的孔中。24岁以后 在37°C下培养h后，对每种浓度进行一式三份的测试。24小时后，10 μL的MTT (5μ每孔加入L/mL)试剂，37℃孵育4 h。然后,DMSO (100μL)加入完成反应;轻轻地摇动盘子，使形成的晶体重新溶解。用Microplate Reader (Bio-Rad Laboratories)分光光度计在490 nm波长读取吸光度。结果用细胞增殖抑制率表示，计算为,在这和分别代表对照样本及样本的活菌平均数[21］.

3.结果和讨论

数字1（a） 显示了铜离子溶液的紫外-可见吸收光谱和图1(b)铜-大豆萃取液。在650 ~ 1000 nm范围内可以观察到与无铜离子相关的典型宽带，最大值约为800 nm [22］.在图1(b)该带消失，表明游离铜离子耗尽，形成铜-大豆萃取物复合物。400 - 550 nm的波段属于大豆提取物。

数字2显示了铜-大豆萃取液的吸收红外光谱。在400到500厘米的范围内可以看到条带⁻¹对应形成铜螯合物，该带在457 cm处⁻¹是Cu-N对称振动和CO₂摆动，宽度614厘米⁻¹和773厘米⁻¹可以归因于CO₂摇摆和NH₂与氨基酸络合引起的摇摆;从1000到1100厘米⁻¹是C-N振动。山顶ν(切断),ν（C=O）在1421时 厘米⁻¹, 1580厘米⁻¹，身高1626厘米⁻¹是ν(C = O)和北半球₂分别剪。范围从3290到3390厘米⁻¹对应于O-H和N-H振动。所有这些振动模式都证实了铜-氨基酸复合物的形成[23]; 众所周知，大豆含有丰富的蛋白质，其中95%的总蛋白质称为可溶性蛋白质，约16%归因于氮的存在[24，25]，有利于铜氨基酸螯合物的形成，如红外吸收光谱所示。

数字3.显示了(a) EDTA起始溶液的紫外-可见吸收光谱，在400 ~ 900 nm范围内可以观察到较宽的波段;(b)离子铜溶液的典型波段在400 ~ 900 nm，最大波段在800 nm左右。(c)为edta -铜螯合物样品;可以看到，由于游离铜离子的耗尽和铜与EDTA形成螯合物，离子铜带的最大值减小;这可能是螯合物形成的证据。

数字4显示了铜纳米颗粒样品的紫外-可见吸收光谱，在约560 nm处有典型的吸收等离子体带。

数字5为铜纳米颗粒样品的TEM图像，可以观察到纳米颗粒呈准球形，平均直径为nm，直方图中可见，共测量了169个纳米颗粒。TEM图像和直方图也显示了纳米粒子的窄尺寸分布;这可以通过动态光散射测量得到证实(图)6)．

数字6展示了铜纳米颗粒的动态光散射测量;平均粒径为4.9 nm，粒径分布窄。

3．1.抗菌效果

测定了螯合物的MIC值大肠杆菌(写明ATCC 25922),金黄色葡萄球菌（ATCC 29213），以及粪大肠(写明ATCC 29212)。结果如表所示1，可以看出，与铜离子、铜- edta螯合物和铜纳米颗粒相比，铜-氨基酸螯合物样品对三种被测菌株的抗菌活性最好。

铜纳米颗粒和铜-氨基酸螯合物的MIC较低粪大肠比测试时大肠杆菌和金黄色葡萄球菌．这些结果可能是指每个菌株细胞壁的差异;革兰氏阳性菌株的细胞壁比革兰氏阴性菌株的细胞壁宽[26］.此外，还报道了铜离子的毒性机理粪大肠包括DNA的快速降解，然后是细菌呼吸的减少;我们也知道，铜离子抑制细胞膜中的某些细胞色素粪大肠通过改变伴生还原酶的构象和电子转移[27］.这些矫揉造作的铜过粪大肠可以通过铜螯合物中氨基酸的存在而增强这可能是为什么粪大肠是不是对铜-氨基酸螯合物比较敏感大肠杆菌和金黄色葡萄球菌．

而铜纳米颗粒与EDTA参比的MIC结果无显著差异大肠杆菌和金黄色葡萄球菌．

数字7显示纳米铜和铜-氨基酸螯合物对细菌的mic值粪大肠．将连续稀释的纳米颗粒暴露于细菌菌株中，可以看到铜-氨基酸螯合抗菌效果优于铜纳米颗粒;总的来说，铜-氨基酸螯合物在三种细菌的所有6个样品中表现出最高的活性(表1)1)．

在图8，我们可以看到氨基酸螯合铜样品的MTT测定结果；抑制率值为粪大肠比…高大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在10 mM的浓度下，比其他测试溶液的浓度小一个数量级。

4.结论

在水溶液和抗菌试验中合成了铜-氨基酸螯合物，结果表明，其菌种特异性和增强活性是铜纳米颗粒和铜- edta螯合物的10倍左右，具有更好的抗菌效果粪大肠而不是两个大肠杆菌和金黄色葡萄球菌．这些结果表明，铜-大豆螯合物可以替代铜纳米颗粒作为特定应用的候选抗菌剂。

竞争利益

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

本研究得到了CONACyT (CONACyT) Grants C005-189530和CB-2010-01-153675的支持。De Alba-Montero和G. M. Loredo-Becerra分别感谢CONACyT提供的358436和401515号奖学金。由Desarrollo professional Docente para el Tipo Superior项目(PRODEP 2016)为支付加工费提供财政支持。

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