生物无机化学与应用

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体积2016年| 文章的ID8206854| https://doi.org/10.1155/2016/8206854

他对表达的影响、净化和锌指蛋白结构,ZNF191 (243 - 368)

Dongxin赵 ¹ 和忠县黄²

学术编辑器: 维克多Brabec

收到了 2016年4月18日

修改后的 2016年6月13日

接受 2016年6月23日

发表 2016年7月20日

文摘

锌指蛋白与遗传相关的疾病和癌症。获得适量的锌指蛋白为研究它们的属性、结构、使用和功能,许多蛋白质表达系统。ZNF191(243 - 368)是一种锌指蛋白,可以与他融合生成融合蛋白等₆-ZNF191(243 - 368)和ZNF191(243 - 368)他₈。他蛋白质的纯化使用Ni-NTA树脂可以克服的困难ZNF191(243 - 368)分离造成的包涵体的形成。的影响他在ZNF191(243 - 368)的属性和结构进行了利用光谱技术和水解酶的实验。我们的研究表明,插入他的n端或c端ZNF191年底(243 - 368)对蛋白质有不同的影响。因此,一个表达式系统应考虑基于蛋白质的性质和结构。此外,水解酶的活性ZNF191(243 - 368)他₈提供了新的见解的生物功能分子的设计。

1。介绍

蛋白质的性质、结构和功能蛋白质的表达的重要因素在体外。虽然可以表达的蛋白质在体外使用各种表达系统,包涵体的形成,外源性毒性蛋白,修改侧链等等所有影响蛋白表达,可以使蛋白质纯化的过程。因此,很难表达足够的蛋白质为研究它们在体外。这也为研究提供了挑战ZNF191和ZNF191 (243 - 368)。

融合表达系统(例如,销售税和球员们)能促进蛋白质表达和简化净化(1,2]。然而,每个表达系统具有独特的特征,影响如何使用它。例如,如果目标蛋白质包含一个凝血酶消化的网站,它无法轻易从GST融合蛋白,不能使用消费税表示系统。他表达系统广泛应用因为的标记有一个低分子量和不影响蛋白质的结构和功能。这意味着没有必要区分他和靶蛋白(3,4]。此外,他融合蛋白很容易被Ni-NTA亲和树脂纯化。锌指蛋白表达,分离和纯化使用他/ Ni-NTA系统(4- - - - - -6]。然而,他融合蛋白的使用仍存在争议(7,8]。

我们建立了两个他表达系统ZNF191 (243 - 368)。他的₆介绍了标签的氨基端和他结束₈介绍了标签的c端一端ZNF191 (243 - 368)。Ni-NTA树脂用于蛋白质纯化,克服的困难ZNF191(243 - 368)所造成的分离和净化包涵体的形成。的影响他在ZNF191(243 - 368)的属性和结构使用光谱技术进行评估和水解酶活性实验。我们发现我们进一步了解锌指蛋白的结构和折叠过程。

2。材料和方法

2.1。材料

限制性内切酶,BamH我,后三世,濒死经历我和Xho我和T4 DNA连接酶买来新英格兰生物学实验室。Pfu DNA聚合酶、核苷酸、异丙基β-D-thiogalactoside (IPTG),特里同x - 100、咪唑、氨苄青霉素、卡那霉素是从Sangon购买(上海,中国)。Ni-NTA树脂购买试剂盒。其他试剂均为分析纯。pET-41b质粒和大肠杆菌BL21 (DE3)应变,pQE30质粒,M15应变(Novagen)作为表达载体和宿主菌株。pGEX-B质粒构建在我们的实验室。YM-5超滤膜Amicon。交联葡聚糖G-25收购法玛西亚生物技术。中低端蛋白质标记被从生物获得基本的公司。

2.2。构建重组质粒

pQE-ZF质粒的构建表达如前所述₆-ZNF191 (243 - 368) (9]。引物用于构建ZNF191(243 - 368)他₈表达系统如下:up-primer: 5′-GGAATTCCATATGAGAAATCCCTCTCGAAAGAAACA-3′;down-primer: 5′20CTCGAGAACTTCCACAACATTCAGAAG-3′。这些引物被用来放大ZNF191 pTSA-18质粒(243 - 368)。每段消化利用濒死经历我和Xho我内切酶和插入pET-41b向量。由此产生的向量被任命为pET-ZF和转化大肠杆菌BL21 (DE3)应变表达式。

2.3。表达和纯化His-Tagged ZNF191 (243 - 368)

质粒pQE-ZF pET-ZF变成了大肠杆菌M15,大肠杆菌分别BL21 (DE3)宿主细菌。他表达系统,3毫升的磅中包含适当的抗生素(他的₆添加了标签表达系统、氨苄青霉素和卡那霉素;为他的₈添加标签表达系统,卡那霉素)接种刚孤立的宿主菌株的菌落携带重组向量。媒介是孵化一夜之间在37°C和稀释1:100 3毫升的磅中含有抗生素用颤抖,直到OD_600年= 0.6;然后IPTG添加不同浓度和文化是生长在不同温度不同时间。1毫升中生长和诱导的细胞在不同条件下离心液和resuspended 1毫升的溶解产物缓冲区,然后用1毫升的2×SDS混合加载缓冲区,和煮10分钟,所以整个细胞的样品准备。那么所有样本运行在15% sds - page凝胶和可视化通过考马斯亮蓝r - 250染色。发现了目标蛋白质与蛋白质相比标准标记,和最优条件在体外表达测定。

在最优条件下高表达蛋白的诱导。的表达和纯化ZNF191(243 - 368)他₈类似于他₆-ZNF191 (243 - 368) (9]。500毫升的磅收获的细胞中生长和诱导在最优条件下悬浮在10卷的细胞裂解缓冲(50更易·L⁻¹不₂阿宝₄pH值8.0,300更易·L⁻¹氯化钠5更易·L⁻¹咪唑)。和细胞被溶菌酶溶解1 h在4°C,然后处理5 U /毫升DNase,搅拌30分钟退化核酸在4°C。可溶性和不可溶性细胞分数被离心分离在15000 r / min 30分钟。上层清液与Ni-NTA混合树脂净化融合蛋白根据制造商的手册。His-tagged蛋白质在洗脱筛选了包含50更易·L⁻¹不₂阿宝₄300更易·L⁻¹氯化钠,250更易·L⁻¹咪唑,在pH值8.0。筛选了解决方案集中使用Amicon YM-5然后通过交联葡聚糖g - 75列去除杂质和交联葡聚糖G-25列删除盐;然后收集蛋白质溶液是冻干。纯化蛋白质混合2×SDS加载缓冲区和煮10分钟准备样品。样本检测到15% sds - page凝胶。

2.4。紫外可见吸收光谱

蛋白质的紫外光谱被记录在惠普8453二极管阵列分光光度计(美国)。蛋白质浓度在10毫米Tris-HCl解决方案(pH值7.5)使用布拉德福德的方法测定。浓度是1μ摩尔·L⁻¹。

2.5。圆二色性(CD)光谱

CD光谱被记录在190年和250年之间的蛋白质的纳米使用J720 Jasco分光偏振计。的光学路径长度是10毫米,蛋白质溶液的浓度与10毫米Tris-HCl (pH值7.5)是1μ摩尔·L⁻¹。录音在25°C。

2.6。锌离子滴定测试

ZNF191(243 - 368)和ZNF191(243 - 368),他被酸化,透过一个交联葡聚糖G-25列获取蛋白质没有锌离子。CD曲线zinc-free蛋白滴定的锌离子进行了测试。

2.7。尿素变性测试

一系列的解决方案的缓冲区不同最终尿素浓度(0,1,2,3,4,5,6,7,8摩尔·L⁻¹)准备。相同的蛋白质数量被添加到所有缓冲的解决方案,被让站10分钟在室温下测量荧光。

2.8。水解酶活性试验

不同数量的蛋白质的解决方案添加到质粒的解决方案给最后一个蛋白质浓度为1μ摩尔·L⁻¹。他们1%琼脂糖凝胶电泳检测后24小时在37°C。

3所示。结果与讨论

3.1。构建重组质粒

质粒pQE-30有六个连续的代码在外源基因的氨基端和氨苄青霉素抗性。BamH我和后三世消化网站被用来克隆ZNF191(243 - 368)基因pQE-30质粒,质粒pQE-ZF生产。一个RGS-His₆背后的代码存在pQE-ZF的起始密码子和氨基酸残基克和Ser编码BamH我的网站后,他;因此pQE-ZF表达的蛋白质包含十一个额外的氨基酸残基(RGSHHHHHHGS)氨基ZNF191年底(243 - 368)。表达的蛋白质被称为他的₆-ZNF191(243 - 368),它有一个分子量1267 Da高于ZNF191 (243 - 368)。在质粒pET-41b之间的目标基因克隆濒死经历我和Xho我网站,生成一个重组质粒pET-ZF。自识别网站濒死经历我有一个起始密码子,没有额外的氨基酸残基的氨基端一端ZNF191 (243 - 368)。然而,氨基酸残基的低浓缩铀和Glu编码的识别网站Xho我之前8连续组氨酸;因此额外的10个氨基酸残基(LEHHHHHHHH)年底c端检测到目标蛋白质。表达的蛋白质是ZNF191(243 - 368)他₈和分子量1339 Da高于ZNF191 (243 - 368)。

3.2。蛋白质的表达和纯化

在最佳条件下表达的蛋白质是:OD的细菌生长_600年在37°C = 0.6,然后由0.1毫米IPTG诱导6 h。His-tagged蛋白质纯化使用Ni-NTA树脂和sds - page检测。

尽管他的分子量₆-ZNF191(243 - 368)和ZNF191(243 - 368)他₈是高于ZNF191(243 - 368),分子量之间的区别没有可见的sds - page。相应的蛋白质(图显示一个乐队1),表明蛋白质纯度高于90%和电泳带的位置符合预期的分子量的蛋白质。这表明,目标蛋白质在体外,他表达系统适用于表达和净化ZNF191 (243 - 368)。

3.3。紫外光谱的蛋白质

在紫外光谱的三个蛋白质(图2),观察无显著差异。都有吸收峰的板式换热器和酪氨酸在260 - 280海里的肩峰Zn-S债券由cysteine-Zn^{2 +}协调在230 nm,表明这些蛋白质可能有类似的结构10,11]。

3.4。CD谱的蛋白质

根据蛋白质的CD光谱在紫外区域(图3),ZNF191(243 - 368)显示了典型的负面的吸收峰α螺旋大约在205 nm和222 nm)以及积极的吸收峰约190海里(12]。积极吸收峰转移到195海里,3肩峰-峰值在210 - 230海里的CD谱₆-ZNF191(243 - 368)表示₆-ZNF191(243 - 368)有更多的β折叠(13]。此外,CD光谱之间的相似性ZNF191(243 - 368)他₈和ZNF191(243 - 368)表明,他们有一个类似的结构。这表明,c端结束的标记,锌指蛋白的N -终端ZNF191(243 - 368)有不同的影响。

3.5。锌离子滴定测试

协调锌离子与半胱氨酸及其在锌指肽形成四面体分子是必要的为了维护的锌指结构域。CD谱的折叠是一种有效的方法来检测锌指根据锌离子配位。锌指结构域是被脱锌,可以回收的锌离子;因此锌离子促进锌指多肽链的折叠。

zinc-free蛋白质的CD光谱滴定与锌离子在图所示4。这些表明zinc-free锌指蛋白有积极的峰值约为190 nm和205 - 235 nm的负峰,证明zinc-free锌指蛋白仍保持一些二级结构和不完全改变成一个不规则的曲线(14]。锌离子的增加回报的CD光谱zinc-free ZNF191(243 - 368)和zinc-free了他₆-ZNF191(243 - 368)的蛋白质脱锌前图所示3。这表明它们的结构可以通过添加锌离子[恢复15]。锌离子滴定曲线的zinc-free ZNF191(243 - 368)他₈的负峰α螺旋在约208海里转移到200海里,这是类似于不规则曲线的负峰约200海里,表明ZNF191(243 - 368)他₈没有原始的结构与锌离子协调因为八个连续的组氨酸c端一端阻碍与锌离子肽链的正常协调。

(一)

(b)

(c)

从无机化学的角度来看,两个配体在一个域和两个配体的羧基端氨基末端的下一个领域可能配合锌离子在蛋白质包含连续C₂H₂锌指域。此外,两个肽链可能配合一个锌离子(16]。的CD光谱的差异ZNF191(243 - 368)他₈之前或之后是否滴定锌是由金属失配引起的他的c端结束。当然,这些只是猜测基于CD光谱。我们希望在未来确定这些蛋白质的结构通过核磁共振及其晶体结构。

3.6。尿素变性测试

ZNF191(243 - 368)包含四个酪氨酸。尿素变性后,蛋白质酪氨酸的微环境将会改变,所以会相应不同的蛋白质的荧光光谱表现变化的蛋白质结构17,18]。位移变化的最大发射波长不同的锌指蛋白在不同尿素浓度图所示5。蛋白质在不同尿素浓度的演变是基于荧光光谱分析。

低尿素浓度下,最大发射峰波长的荧光光谱ZNF191(243 - 368)约为344纳米,而转移到350海里随着尿素浓度。他的最大发射峰波长₆-ZNF191(243 - 368)从342到346纳米。的最大发射峰波长的荧光光谱ZNF191(243 - 368)和他的₆-ZNF191(243 - 368)有同样的红移,表明酪氨酸残基在蛋白质从最初的非极性环境折叠蛋白质的极地环境展开的蛋白质。这是按照锌指蛋白的结构。自从ZNF191酪氨酸(243 - 368)是关键氨基酸残基的疏水核心经典“指状”结构,它是蛋白质暴露在溶剂逐渐展开19]。然而,的最大波长ZNF191(243 - 368)他₈并没有改变随着尿素浓度的增加,这意味着在展开酪氨酸的环境发生了微妙的变化。因此,的标记在蛋白质的氨基端和c端端ZNF191结构的影响以不同的方式(243 - 368)。这种差异是否影响蛋白质功能还有待阐明。

3.7。水解酶活性试验

特殊的磷酯键的水解DNA通过自然核酸酶一直是个问题。人工水解核酸酶的设计将提供更多的可识别的DNA序列,将药物设计和基因治疗中获益。目前,大多数设计策略是连接DNA结合元素和DNA分解脂肪的元素或建立水解酶的活性位点DNA结合肽(20.- - - - - -22]。许多锌指蛋白识别特定DNA序列。新锌指蛋白识别独特的DNA序列设计和扩展识别DNA的长度(23- - - - - -25]。将是有用的一个锌指核酸酶结构设计,因为锌指域的识别网站不是一个对称的序列。SP1的半胱氨酸突变对他的成功开发一个锌指DNA水解肽功能(26]。这让我们想起水解活动是否会引入通过他手指肽锌或锌指蛋白。在这里,我们选择了质粒pGEX-B包含GGAGGG网站研究His-tagged蛋白质的水解活性。pGEX-B的质粒DNA结合实验得到的ZNF191 (243 - 368) (27),电泳结果如图6。的质粒都有两个主要的乐队。

一般来说,提取质粒有两个,有时3、电泳带。在超螺旋质粒状态(我)的最快,其次是环形质粒(II)和线质粒(III) [28]。线结构开发和超螺旋质粒分离完全当ZNF191(243 - 368)他₈是补充道。这表明他的协调和锌离子赋予蛋白质与DNA裂解。这或许可以解释为什么H₄锌指结构不存在于生命体。但这并不是他₆-ZNF191(243 - 368),进一步证实,不同位置的polyhistidine会有不同的效果。Polyhistidine在锌指蛋白c端可能更容易形成活动网站相似的蛋白酶(29日]。

4所示。结论

的标记的氨基端和c端端ZNF191(243 - 368)有不同的对蛋白质的性质和结构的影响。因此,有必要仔细考虑是否选择他的系统在体外锌指蛋白的表达。ZNF191(243 - 368)与他有不同的属性,这提供了新的见解的生物功能分子的设计。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者要感谢金融支持中国国家自然科学基金(没有。21301050也没有。21575034)和河南省的科技项目(162102210197)。

引用

k·m·邱c . f . Chang j .舒伯特e . Wondrak和h . h .庄瑞豪”表达和纯化的重组His-tagged GST-CD38融合蛋白使用杆状病毒/昆虫细胞表达系统,”蛋白表达和纯化,40卷,不。2、396 - 403年,2005页。
视图: 出版商的网站 | 谷歌学术搜索
c .橘黄色j . h . Brandstatter和r .劳动部zip2, PKC -一个新的接头变体ζ相互作用的蛋白质家族,结合GABAC受体,PKC -ζ,Kvβ2》《生物化学》杂志上,卷278,不。8,6128 - 6135年,2003页。
视图: 出版商的网站 | 谷歌学术搜索
a·b·梅森徐瑞秋他,t·e·亚当斯et al .,“表达、纯化和表征nonglycosylated重组人血清转铁蛋白含有c端hexahistidine标签,”蛋白表达和纯化,23卷,不。1,第150 - 142页,2001。
视图: 出版商的网站 | 谷歌学术搜索
h . z .彭g·e·贝格s l·哈珀j·r·弗里德曼d . w . Speicher和f . j . Rauscher三世,“生化分析Kruppel-associated盒(带锁)转录镇压域,“《生物化学》杂志上,卷275,不。24日,第18010 - 18000页,2000年。
视图: 出版商的网站 | 谷歌学术搜索
gdp梅雷迪思,h . y . Wu, n . l . Allbritton”目标是使用的标记的蛋白质功能化,”Bioconjugate化学,15卷,不。5,969 - 982年,2004页。
视图: 出版商的网站 | 谷歌学术搜索
s .夏普W.-M。瑶族,r . Tycko”表达和纯化的重组肽的阿尔茨海默氏症β固态核磁共振,淀粉样蛋白”蛋白表达和纯化,42卷,不。1,第210 - 200页,2005。
视图: 出版商的网站 | 谷歌学术搜索
a·b·梅森徐瑞秋他,p . j . Halbrooks et al .,“微分的影响他的标记N - c终端:重组人血清转铁蛋白的功能研究,“生物化学第41卷。。30日,第9454 - 9448页,2002年。
视图: 出版商的网站 | 谷歌学术搜索
a .圣歌x Provatopoulou, i . w . Manfield和g . g .,“结构和功能描述的DNA结合域曲霉属真菌nidulans基因调控蛋白区域。”Biochimica et Biophysica学报(BBA)——和蛋白质组学,卷1648,不。1 - 2、84 - 89年,2003页。
视图: 出版商的网站 | 谷歌学术搜索
D.-X。赵,X.-C。腾,Z.-C。丁,Z.-X。黄”,表达和纯化ZNF191(243 - 368)在三个表达系统中,“中国化学杂志,25卷,不。11日,第1742 - 1739页,2007年。
视图: 出版商的网站 | 谷歌学术搜索
L.-C。陈、m . e . Noelken和h .“,“半胱氨酸- 75和锌离子的干扰协调不足以激活人类的前体基质金属蛋白酶3 (stromelysin 1),“生物化学,32卷,不。39岁,10289 - 10295年,1993页。
视图: 出版商的网站 | 谷歌学术搜索
j·w·f . Li, j . Wang Metal-coupled折叠的半胱氨酸和w·王。₂他的₂锌指。”美国化学学会杂志》上,卷130,不。3、892 - 900年,2008页。
视图: 出版商的网站 | 谷歌学术搜索
r . w .司机,h . n .黄平君g . Abbenante和d·p·费尔利”循环β与一个螺旋链三肽像CD谱。”有机的信,11卷,不。14日,第3095 - 3092页,2009年。
视图: 出版商的网站 | 谷歌学术搜索
d . m . Rothwarf P.-T。施,J.-L。彭、h·a·Scheraga和v . g .达文波特”使用sequence-specific tri-block共聚物helix-forming倾向的氨基酸,”生物聚合物,39卷,不。4、531 - 536年,1996页。
视图: 出版商的网站 | 谷歌学术搜索
m x Chen楚,d . p . Giedroc”MRE-binding转录因子- 1:弱锌结合手指域5和6调整结构、亲和力,和特异性metal-response元素的复杂,“生物化学,38卷,不。39岁,12915 - 12925年,1999页。
视图: 出版商的网站 | 谷歌学术搜索
t .锅和j·e·科尔曼锌(II)的结构和功能结合位点在GAL4 dna结合域的转录因子,”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷86,不。9日,第3149 - 3145页,1989年。
视图: 出版商的网站 | 谷歌学术搜索
k·r·Thickman a . Davis和j·m·伯格”选址在串联阵列的领域,”无机化学,43卷,不。25日,第7901 - 7897页,2004年。
视图: 出版商的网站 | 谷歌学术搜索
g .梅公元Venere, a . f .农业f·d·加尼姆和n Rosato”偶极放松色氨酸和酪氨酸在甘油和蛋白质:从他们的荧光衰减直接评价,“杂志的荧光,13卷,不。6,467 - 477年,2003页。
视图: 出版商的网站 | 谷歌学术搜索
a . m .琼斯黑发和d·l·法伦”,距离映射使用荧光光谱在蛋白质:酪氨酸、色氨酸、淬灭bimane荧光以军事的方式”生物化学,53卷,不。40岁,6290 - 6301年,2014页。
视图: 出版商的网站 | 谷歌学术搜索
圣歌,c . m . Kraemer-Pecore r . Watkin和g . g .,“依恋的组氨酸标签的最小的锌指蛋白曲霉属真菌nidulans基因调控蛋白区域引起dna结合蛋白的构象变化的网站,“蛋白表达和纯化,39卷,不。2、152 - 159年,2005页。
视图: 出版商的网站 | 谷歌学术搜索
s . j .富兰克林“Lanthanide-mediated DNA水解,”当前化学生物学的观点,5卷,不。2、201 - 208年,2001页。
视图: 出版商的网站 | 谷歌学术搜索
e . Boseggia m .他是l . Lucatello设计et al .,”对有效锌(II)的人工核酸酶,”美国化学学会杂志》上,卷126,不。14日,第4549 - 4543页,2004年。
视图: 出版商的网站 | 谷歌学术搜索
r·t·Kovacic j·t·韦尔奇,s . j .富兰克林“嵌合metallopeptide Sequence-selective DNA乳沟,”美国化学学会杂志》上,卷125,不。22日,第6662 - 6656页,2003年。
视图: 出版商的网站 | 谷歌学术搜索
m .长冈y Doi、j . Kuwahara和y Sugiura”小说策略的设计一个新的锌指:创建一个锌指at富集的序列α螺旋替换。”美国化学学会杂志》上,卷124,不。23日,第6527 - 6526页,2002年。
视图: 出版商的网站 | 谷歌学术搜索
t . Kamiuchi e·安·m·Imanishi t . Kaji m .长冈和y Sugiura“人工锌指九肽与30个碱基对结合位点,”生物化学,37卷,不。39岁,13827 - 13834年,1998页。
视图: 出版商的网站 | 谷歌学术搜索
特·m·p·Kolasinska, m . Minczuk“设计师锌指蛋白及其应用”基因,卷366,不。1,27-38,2006页。
视图: 出版商的网站 | 谷歌学术搜索
野村和y Sugiura“Sequence-selective和水解乳沟锌指DNA的突变体,“美国化学学会杂志》上,卷126,不。47岁,15374 - 15375年,2004页。
视图: 出版商的网站 | 谷歌学术搜索
赵d . x和z . x黄”,识别代码ZNF191(243 - 368)及其与DNA的相互作用,”生物无机化学与应用ID 416751条,卷。2015年,7页,2015。
视图: 出版商的网站 | 谷歌学术搜索
j . k . Lu太阳,D.-X。赵,Q.-C。朱,w . Lv“L-dopa-L-Tyr的合成和ctDNA L-dopa-L-Tyr之间的相互作用,”国际期刊的肽研究和治疗,20卷,不。3、299 - 305年,2014页。
视图: 出版商的网站 | 谷歌学术搜索
b . l .法兰和d s .老的,”在酶催化Cocatalytic锌图案,”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷90,不。7,2715 - 2718年,1993页。
视图: 出版商的网站 | 谷歌学术搜索

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