金属在不依赖金属离子的细菌RNase催化反应中的作用

抽象的

肠道微生物群的细胞外酶是影响机体功能活动的关键因子，因为它们直接与上皮细胞和免疫细胞相互作用。几种芽孢杆菌属,就像Bacillus pumilus，一种常见的胞外RNase双联酶的生产者，可以作为定殖生物填充肠道微生物群。在没有金属离子作为辅助因子的情况下，在催化反应的第一阶段，二酶通过裂解3 '，5 ' -磷酸二酯键来解聚RNA，生成2 '，3 ' -环鸟苷磷酸。这种信使rna在反应混合物中维持1小时以上，可影响人体肠道菌群和人体。在目前的研究中，我们发现，在稳定RNA结构的过渡金属存在的情况下，2 '，3 ' -cGMP的速率正在增长。同时，过渡金属离子仅略微降低了2 '，3 ' -cGMP的数量，阻断了亲核嘌呤碱基N7处鸟嘌呤二酶识别位点。

1.介绍

T1家族(EC 3.1.27.3)核糖核酸酶(RNases)水解RNA并将3 '，5 ' -磷酸鸟苷和邻近核苷酸的5 ' -羟基之间的3 '，5 ' -磷酸二酯键断裂，在催化反应的第一阶段形成一个2 '，3 ' -环鸟苷磷酸。这一阶段是可逆的，比第二阶段要快得多。第二阶段中，环状中间体被水解成相应的3 ' -磷酸[1］．与属于RNase A（EC 3.1.27.5）的嘧啶特异性的RNases不同，RNASETT T1是特定的遮光膜;因此，2'，3'-循环鸟苷胺单磷酸盐（2'，3'-Ñgmp）只能在催化的第二步骤中切割[1］．属的许多成员芽孢杆菌分泌的rna酶可以完成催化反应的两个阶段。具体来说，这些物种是b、和地衣芽。可以从人类胃肠道中分离出来的微生物群，它们代表了驻留的而不是短暂的微生物群[2］．胃肠道中这种微生物的量显着超过了可以来自食物的量。萌发芽孢杆菌在人类肠道内的孢子和短暂的定植是人类相关杆菌生命周期的一部分[3.］．早些时候，我们发现b、在术前肠清洁后的直肠上皮活检中[4］．因此，杆菌分泌的产物可以影响人体的正常菌群，介导人体功能活动的变化。细胞外细菌酶是与人体相关的关键因子，因为它们直接与上皮细胞和免疫细胞相互作用[5］．然而，从这种相互作用中排除反应中间体的反应中间体，如2'，3'-循环位置异构体，即3'，5'-CAMP和3'，5'-CGMP的反应中间体。例如，显示2'，3'-循环核苷酸参与了线粒体渗透性的调节[6，7］．另外，2 '，3 ' -cGMP可促进淋巴细胞DNA中胸苷激酶的掺入[8]，类似于3 '，5 ' -cGMP，可使cgmp依赖的atp酶增加数倍[9］．虽然2 '，3 ' -cGMP的生物学作用尚未被详细研究，但可以明确的是，非规范的环状第二信使，如2 '，3 ' -cGMP和2 '，3 ' -cAMP是由动物和植物在应激环境下产生的，诱导RNA降解[10，11］．

众所周知，在所有的多、寡核糖核酸被裂解后，环状磷酸盐只能被RNase水解[12］．最近我们发现2 '，3 ' -cGMP可以在RNA:binase反应混合物中维持1小时以上，使binase表现出其生物学效应[13］．虽然Binase被视为不需要用于RNA催化金属离子的酶[14]，本研究的目的是研究二价金属离子是否会影响二价酶形成2 '，3 ' -cGMP环中间体的能力。

2.材料和方法

２.１.材料

我们从重组菌株的培养液中分离得到一种具有催化活性的同源蛋白，即鸟酰倾向的RNase, binase(分子量为12.3 kDa, 109个氨基酸残基，pI = 9.5)大肠杆菌BL21，携带pGEMGX1/ent/Bi质粒。在pH 8.5时，双酶对酵母RNA的催化活性为14000000 U/mg [15］．

环核苷酸3 '，5 ' -cGMP和2 '，3 ' -cGMP, tRNA的位置异构体圆酵母酵母和3 '，5 ' -cGMP购自德国Sigma-Aldrich公司。跃迁离子(Mn^2＋、铁^2＋和co.^2＋（mg）不破坏（mg^2＋、钙^2＋,锌^2＋)元素在反应混合物中以高纯氯化物(分析级)的形式复配。

2．2.双酶环化活性的测定

二苯酶在总体积为200 mcL的0.5 M Tris-HCl缓冲液(рH 8.5)中与酵母RNA(为特定实验确定的浓度)在37℃下孵育15分钟。催化反应在低温下停止。100mcl EPBS (8.24 мМ Na₂HPO₄1.77 мМ NaH₂阿宝₄加入140 мМ NaCl, pH 7.4)，混合均匀后在12000 ×g离心2 min。将上清倒入含有60 mcL EPBS的试管中，在−80℃冷冻。用抗3′、5′-cGMP的抗体，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对获得的2′、3′-cGMP产品进行检测。

２.３.酶联免疫吸附测定2 '，3 ' -cGMP数量

我们使用商业96孔板，固定山羊抗兔抗体(二抗)，一抗兔抗3 '，5 ' -cGMP，并按照制造商的说明(IHF，汉堡，德国)适当的试剂。鸟苷特异性微生物RNA酶的RNA水解不会导致3 '，5 ' -cGMP的形成[14］．早些时候，我们已经证明，当2 '，3 ' -cGMP浓度超过10时，2 '，3 ' -cGMP可以与商业的3 '，5 ' -cGMP抗体交叉反应检测到⁻⁵М (10 nM/mL及以上)[13］．总共50Mcl的测试样品，50mcl的生物素溶液和100mCl伯伯伯酮3'，将5'-CGMP抗体加入到孔中，并在4℃下孵育过夜。然后，将200Mcl的三霉抗生物素蛋白 - 辣根过氧化物酶缀合物的溶液加入到孔中，将其在4℃温育30分钟。此后，用缓冲液洗涤板三次，用250mCl为3'，3,5'，5-四甲基苯甲酸溶液，并在4℃下保持40分钟。然后，50 mcl为2米H.₂所以₄加入，培养皿孵育5分钟，在450nm的比色仪上进行分析。颜色的强度与与抗体结合的环核苷酸的数量成反比。使用标定曲线计算环核苷酸浓度[13］．

２.４.核磁共振光谱学

Binase¹Н nmr谱在含过渡氯化物(Mn^2＋)和非过渡金属(Mg^2＋、锌^2＋)，以及含有Mn的tRNA^2＋在AVANCE III-700 (700 MHz，布鲁克，德国)核磁共振谱仪上记录，该谱仪配有一个四低温传感器(¹H,¹³C,¹⁵N,³¹P)冷冻器。¹Н NMR记录了tRNA在水溶液中与非过渡金属离子(Mg^2＋、钙^2＋,锌^2＋)的核磁共振谱仪AVANCE II-500 (500 MHz，布鲁克，德国)。

光谱仪工作在共振线的内部稳定模式²H.¹用90°脉冲(脉冲弛豫延迟2 с;光谱宽度20.00 ppm;累积次数为100)。nmr谱记录在298 K, pH 5.5。

3.结果

3．1.RNA酶和RNA与二价金属离子相互作用的光谱特征

由于双酶活性不依赖于任何辅助因子或金属离子[14，当二价离子加入蛋白时，二价酶的光谱特征没有改变(图1）.RNA与Mn的相互作用^2＋导致了核磁共振光谱中更宽的信号(图)2 (d)）.因此，可以假设位点特异性Mg^2＋、钙^2＋,锌^2＋-RNA相互作用在RNA中不存在。在研究的浓度(0.5 - 5mМ)中，NMR谱宽与盐的量的关系被发现是不显著的。与锰^2＋，这些离子不具有强的顺磁特性，因此，在NMR谱中对RNA没有明显的影响(图)2(一个)，2 (b),2 (c)）.说到RNA-Mn^2＋相互作用时，我们可以观察到核磁共振信号谱线的选择性和渐次展宽¹5 - 8ppm区域内含氮碱基质子信号所在的tRNA的H NMR谱(图2 (d)）.增加MnCl浓度后，核磁共振信号线消失₂．由于在顺磁中心附近的质子的弛豫时间显着降低，我们检测到具有与金属核的电子旋旋具有非偶极偶极子标量相互作用的核苷酸。记录的较短放松时间，以及与MN的相互作用相关的NMR光谱相似的变化^2＋和有限公司^2＋与组氨酸残基和肽结合的谷氨酸可能是由于Mn^2＋活动(16］．

３．２．二价金属离子活性在RNA催化裂解中2 '，3 ' -cGMP速率的变化

使用抗体来定义tRNA-binase反应中中间代谢物2 '，3 ' -cGMP的速率，我们已经表明，在含有非过渡金属离子的反应混合物中，与没有添加离子的混合物相比，2 '，3 ' -cGMP产品的水平增加了2 - 2.5倍(图)3(一个)）.锰^2＋、有限公司^2＋,菲^2＋对2′、3′-cGMP无刺激作用。相反，2 '，3 ' -cGMP的速率由于离子浓度的升高而无明显下降(图)3 (b)）.

4.讨论

已知，在生理pH值下，三级RNA结构可以被二价金属离子稳定[17］．以前人们认为，既然RNA在二价离子和一价离子存在的情况下都能复性，二价离子与RNA的结合是由于离子与磷酸盐的普通静电相互作用[18］．后来的研究表明，金属阳离子对RNA的结合行为取决于其结构组织和核苷酸序列[19］．除了与带负电的去质子化磷酸盐形成配合物外，金属阳离子还与氮基中的氧原子和氮原子的电子供体相互作用，不包括外环氮原子[17］．这种相互作用是由于完全溶解的阳离子通过一层或两层水分子与RNA的稳定结合，以及部分脱水的阳离子直接与带负电荷的功能RNA基团的强关系[20.］．现在很清楚，二价金属离子在RNA酶活性的变构调节中起着关键作用[21，22］．

很难解释离子的作用，因为很难区分离子在活性RNA结构中的直接催化作用和离子的间接作用。近年来，人们发现过渡金属如镍^2＋、有限公司^2＋、锰^2＋在RNA中有特定的结合位点，特别是在核糖开关结构中[23］．毫克^2＋、锰^2＋,锌^2＋在剪接的第一步中与鸟苷作为共底物相互作用并改变催化反应的参数[24］．在表现的调节效应方面，过渡和非转型金属的离子不可互换。例如，在5' - 未翻译区域中发现的riboswitches鼠伤寒沙门氏菌转录在革兰氏阴性肠道细菌中是保守的，它被Mn变构激活^2＋，而不是通过са^2＋或Мg^2＋［25］．对于一些I组内含子核酶，折叠和催化可以激活Mg离子^2＋，但不包括Mn^2＋．研究表明，内含子为大核糖体亚基的23S rRNA基因衣藻reinhardtii、锰^2＋对催化作用无抑制作用，但会引起核酶的错误折叠。I组内含子的共底物GMP取代了Mn^2＋从鸟苷的结合位点(GUC)恢复折叠[26］．

我们已经表明，过渡和非转换离子对TRNA结构的影响和2'，3'-CGMP（图2和3.）.trna由3-4强（kd≈μM)和20以上弱Mg^2＋绑定的网站(27］．后者包括8-12转(Op-U8, Op-A9)、D-loop (Op-A20, Op-A21)、D/TΨC-loop-1 (Op-G19, N7-G20)、D/TΨC-loop 2 (Op-G57, Op-A14)、受体臂(G3•U70)和反密码子环(Op-Y37) [28］．RNA-MG^2＋相互作用主要通过在空间密封磷酸盐基团中的氧原子的直接结合介导，并且通过2'-羟基的结合，嘌呤碱的N7原子和酮氧原子（U和G）的结合。RNA-MG^2＋结合基序表现为:(1)混合G•U对的主槽，其次是Y•G对;(2) G•A对移位;(3)镁“夹”;(4)金属离子闪电;(5) E-loop主题;(6) AA平台;(7)磷酸鸟嘌呤结合基序[29］．

不像毫克^2＋、锰^2＋离子只与D/TΨC-loop-1和受体臂结合在tRNA分子中[28］．这只是Mg的七个主题之一^2＋-结合位点，即移位的G•A对，被报道为Mn^2＋(图4)[29］．

尽管具有相似的半径，充电和RNA位点，但Mg^2＋和Mn.^2＋不完全相同[30.］．毫克^2＋和Mn.^2＋在RNA中，由于阳离子对特定类型的键的偏好，在金属结合位点上具有不同的方向。因此，Mg的地位^2＋作为固体离子强烈依赖于P-O的紧密耦合，而Mn^2＋更接近鸟嘌呤的N7位置，其中与前磷酸二酯键的氧相互作用保持[31］．过渡金属与核酸的结合比Mg更紧密^2＋或者K⁺，这主要是由于与亲核含氮碱基(N7嘌呤)的相互作用[17］．

因此，Mn的特性行为^2＋在RNA的核磁共振波谱中，可以通过它与N7嘌呤的亲和性来解释(图)2 (d)）.鸟嘌呤结合Mn^2＋离子要么限制了RNA中鸟嘌呤特异性二酶位点的可及性，要么阻碍了鸟嘌呤的识别。因此，我们观察到2 '，3 ' -cGMP的速率没有增加，作为一个反应中间体，被环化的RNases催化(图)3 (b)）.基于所获得的证据表明，关于不破坏金属离子的能力2'，3'-CGMP，这不是过渡金属离子的情况，可以假设所研究的过渡金属影响RNA-Binase结合位点;在通过磷酸基团稳定RNA稳定的情况下，相关的影响特别强。

二苯酶是一种很有前途的抗癌药物[32- - - - - -36]及防病毒效果[37，38］．细菌在肠道菌群中分泌RNase是一种对抗肿瘤发生和病毒感染的自然防御机制。非过渡金属对人体2 '，3 ' -cGMP的激活肯定支持微生物rna酶的生物学效应。

5.结论

结果表明，在稳定RNA结构的非过渡金属存在的情况下，RNA切割过程中由双联酶产生的2 '，3 ' -cGMP的速率增加。在过渡金属离子的情况下，2 '，3 ' -cGMP的数量减少，因为鸟嘌呤阻断了RNA的双酶识别位点。由于人体内杆菌产生RNase是一种自然机制，非过渡金属对2 '，3 ' -cGMP的激活可以增强双酶的生物学效应。

相互竞争的利益

作者宣布没有关于本条的出版物的利益冲突。

致谢

该研究是在俄罗斯政府竞争增长方案的喀山联邦大学竞争成长中进行，并得到俄罗斯研究基金会授予号的支持。14-14-00522。

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