文摘

本研究设计了一种仿生移植减少恢复时间,实现早期骨整合创造一个活跃的表面。骨形成protein-2 (BMP-2)是一个强有力的监管机构蛋白成骨的通路。由于很难维持BMP-2生物功能和特异性,BMP-2有效交付植入物表面的主要挑战是临床应用。在这项研究中,一种新的方法合成官能团硅烷膜与BMP-2优越的修改提出了钛表面。三组比较有和没有BMP-2体外和体内:修改后的钛表面机械研磨;电化学改性通过恒电位阳极处理(决定);喷砂、碱加热、蚀刻(聪明)。单元测试表明,电解珩磨和智能组与BMP-2显著提升D1细胞活性和分化而没有BMP-2组。此外,智能组与BMP-2表面明显促进了早期碱性磷酸酶表达在D1细胞与其他表面组。与这些团体体内相比,智能硅烷与BMP-2显示优越的骨骼质量和创造之间的接触区域植入和周围的骨头。 The SMART group with BMP-2 could promote cell mineralization in vitro and osseointegration in vivo, indicating potential clinical use.

1。介绍

牙科植入物是嘴的功能重建的关键遮挡和牙齿。钛(Ti)是一种理想的生物材料对牙科植入物由于其出色的机械性能,有效的耐腐蚀性能和优异的生物相容性。然而,骨量减少或骨质疏松症患者,包括那些有糖尿病和老年病人,可怜的骨性愈合,因为可怜的骨质量和数量。这些病人少骨应用的移植,需要更长的等待时间植入后骨整合应用(1,2]。物理或化学表面改性在牙科植入物可以提高骨整合,减少治疗时间,从而提高患者的复苏(总3,4]。

表面改性应用于Ti通过各种方法来创建独特的微观结构提高生物反应和表面能5]。一般来说,表面物理和化学修改的主要目的是促进移植骨整合。在我们之前的研究中,我们调查了祖骨细胞之间的相互作用在几个修改表面,所有这些应用在商业方法(6]。我们发现两个修改表面,恒电位阳极处理(决定)在硫酸电解液通过恒电流源和喷砂,碱加热,和蚀刻(聪明),结果报告,组织产生更好的细胞在体外矿化潜力。

最近,理想的仿生表面设计债券更多的生物因素,积极启动骨愈合过程。重组人类骨骼形态protein-2 (rhBMP-2),这是一个转化生长因子,已证实启动和调节成骨细胞分化[7]。然而,一些研究发现没有关键osteoconductivity BMP交付对表面的影响(8,9]。各种方法已经应用于保税植入表面成为生物反应表面(8- - - - - -15]。我们使用一个交付技术成功地在以前的实验中是债券改性钛活性表面的粘附受体摘要蛋白(13]。摘要表面增强高山osteoprogenitor细胞表达文化,1到7 d后之后,我们使用acid-etched钛表面与硅烷偶联剂进一步治疗,这可能与Arg-Gly-Asp多肽共价债券的表面。

本研究旨在调查两个修改表面(电解珩磨和智能),进一步处理硅烷偶联剂和高生物活性的蛋白质,BMP-2。表面润湿性能通常用于评估一个表面的亲水能力、与水的接触角显示表面的润湿性。表面性质和特点测量和评估执行粗糙度和润湿性测量。(3)- 4 5-dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTS)试验用于测量细胞增殖。骨生成和矿化可以早期发现通过碱性磷酸酶(ALP)。因此,高山的细胞活性和表达能力的骨祖细胞(D1细胞)比较在不同钛表面。动物实验进一步进行评估早期bone-to-implant接触比率通过ct机产生的新骨形成和histomorphometric分析喷砂和acid-etched (SLA),与BMP-2电解珩磨,智能与BMP-2团体。

2。材料和方法

2.1。衬底表面的修改

纯钛样品直径14.8毫米和2毫米厚的圆形基板被用作表面改性的基质材料。涂层前,样本与砂纸抛光(砂粒大小:2000 #),用丙酮脱脂,用蒸馏水冲洗。组成对照组的样本被贴上加工表面(M)。额外的修改涉及两个钛表面电解珩磨和聪明。决定治疗的钛衬底样本作为阳极,而不锈钢容器的墙壁是用作阴极。一个水电解质制备硫酸溶液0.1。电解珩磨过程被执行在工作电压为100 V。决定治疗10分钟后,涂层样本从电解液,用蒸馏水彻底冲洗,在室温下干燥。聪明的治疗首先是用喷砂和酸腐蚀过程。钛基体是喷砂30年代使用的空气压缩机3公斤/厘米²的阿尔₂O₃粉(平均直径为200μ米),其次是盐酸酸治疗(HCL) (37%, Panreac,巴塞罗那,西班牙),浓硫酸(H₂所以₄)(95%至98%,Panreac,巴塞罗那,西班牙),和去离子水1:1:100。同时,超声波酸腐蚀进行了30分钟的100°C。磁盘被蚀刻在氢氧化钠(0.5米)1 h和去离子水清洗,干,盐酸浸30分钟的蚀刻(0.1米)。最后,样本清洗和干燥在100°C的1 h。

2.2。仿生改性

我们进行了表面处理过程后,样本沉浸在1:1 H的混合物₂所以₄和30%过氧化氢2 h,在三次蒸馏水冲洗,晾干的(16]。对硅烷化基板被放置在含有10%丙酮为2 h 3-mercaptopropyltrimethoxysilane 25°C,在丙酮清洗,干一夜之间在37°C。基板被放置在1%的戊二醛磷酸缓冲盐在真空炉。本研究中使用的BMP rhBMP-2遗传学研究所提供的剑桥,美国。治疗基质被垂直下降到BMP-2浓度(7.5 ng / mL)。

2.3。衬底表面分析

场发射扫描电子显微镜(日立s - 3000 n,日立,东京,日本)是用来检查衬底表面结构,细胞形态后细胞附件,重新。接触角(凸轮- 100,创造了纳米技术,Inc .)、台湾)测量被用来演示基板的表面润湿性能。测试样本一式三份()。平均表面粗糙度的测量是用粗糙度测试仪(sj - 301三丰公司、有限公司、日本)。

2.4。细胞培养

D1细胞(多能间充质细胞,美式文化收藏、马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国),从BALB / c小鼠骨髓细胞克隆,在骨骼中维护(杜尔贝科修改鹰的媒介,表达载体,卡尔斯巴德,CA,美国)含10%胎牛血清,0.1%抗坏血酸钠在湿润的气氛中5%的二氧化碳在37°c。

2.5。(3)- 4 5-Dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyltetrazolium溴化试验

D1细胞被播种在基质和没有BMP-2修改成24-well板的密度100000细胞/培养基。细胞收获1天,4、7、10、14和21检测细胞增殖利用MTS四唑(细胞Titer96水,Promega,麦迪逊,WI)。总之,3 h之前每个所需的时间点,10µL的MTS试剂添加到每个好,并在37细胞被孵化µC 3 h。吸光度检测在490 nm微型板块autoreader(英国丹尼克斯技术,Billingshurst)。整个实验重复三次。

2.6。碱性磷酸酶活性

D1细胞被播种在二氧化钛薄膜,没有微弧氧化改性成24-well板的密度100000细胞/培养基。细胞在天收获4、7、10、14和21。Sigma-Aldrich碱性磷酸酶工具包(美国σ85号)被用来检测和染色高山辛伐他汀治疗后活动。准备alkaline-dye解决方案,2毫升的磷酸萘酚AS-MX碱性溶解在重氮盐的解决方案,这是一个快速紫B胶囊溶解在48毫升蒸馏水。细胞被固定在室温下10% formalin-saline 10分钟然后用去离子的基质是洗一次蒸馏水(dd H₂O)和一个alkaline-dye混合物被添加到每个在48-well板和孵化15 - 30分钟。染色的解决办法是删除,井用蒸馏水洗净。固定和染色板在室温下被风干,和高山阳性染色细胞拍摄使用较轻的显微镜(日本尼康)。

2.7。动物实验

两个国内猪4岁女帽和重20公斤被用于这项研究。所有程序都按照规范执行指南动物实验台中荣民总医院。手术前1 d的头猪被饿死了。所有外科手术进行下Zoletil[5毫克/公斤,肌内(坜)注射,然后用异氟烷吸入的麻醉,直到手术完成。局部麻醉后氧四环素(7 - 11毫克/公斤),矢状切口是在股骨,软组织和骨膜被动员起来。植入孔股骨上创建。第一轮2毫米钻头被用来穿皮质骨,和一个2毫米麻花钻垂直12毫米插入股骨。接下来,一个3毫米飞行员钻是用来创建一个洞。最后,五个被植入股骨。条件如下:SLA、电解珩磨ECH-BMP-2,聪明,SMART-BMP-2 ()。移植后,骨膜和皮肤缝合了四点丝绸在两层。

2.8。样本的收集和制备标本

这些动物安乐死后14天。动物最初镇静Zoletil(5毫克/公斤,坜)和安乐死注射氯化钾(2更易/公斤体重)的心。心脏骤停后,我们收获动物的股骨。这些股骨固定4%多聚甲醛。标本脱水增加浓度的酒精在室温下。在准备组织学分析,样本嵌入在树脂。180年嵌入式骨样本切成薄片µ米厚用精密锯,磨床(CL-40、台湾Nakazawa)和骨植入样本减少到30µm×使用磨床机(FRS-C,顶级技术)。

2.9。微观结构和矿物含量

六个骨植入标本(),每组检查使用扫描电子显微镜和能量色散x射线能谱法(SEM-EDX) 14天。EDX探针耦合的扫描电子显微镜(飞利浦FEG XL 30日,牛津仪器,Inc .)康科德,妈,美国)的加速电压25 kV和100µ一个照明使用当前和100年代计算时间。在每一个标本,分析钙(Ca)和磷(P)进行了搪瓷(%)的内容。

2.10。ct机

ct机(Skyscan 1076、力量、比利时)是用来分析骨修复,这是计算使用图像软件所需的时间点。建立了扫描条件是0.5毫米的铝制过滤器,35µm扫描分辨率,x光电压50 KV, x射线电流200毫安,600 m的曝光时间。骨愈合使用总量分析,评估骨体积,骨体积百分比(BV /电视)。

3所示。结果

3.1。钛植入体的接触角和表面形态

评价属性的植入物表面,润湿性测量是一个典型的战略评估材料表面的亲水性。样品表面是显示在图的特点1(一)。M的接触角、电解珩磨和聪明的接触角大于72.22±3.27°,66.44±1.99°,和59.32±0.15°。智能处理的底物有狭隘的接触角,和M集团最宽的。之前的研究结果显示一个类似的趋势6]。与BMP-2亲密接触之后,基团,桶,ECH-B,和SMART-B基质是亲水的,因为他们的接触角分别为29.38±5.29°,58.87±4.38°,54.30±1.59°。表面粗糙度的M,决定,和智能基质为0.11±0.01,0.17±0.02,1.35±0.06μm。基质样品的表面粗糙度,在智能最大的表面粗糙度值高于1.35μ米,如图1 (b)。涂层BMP-2后,桶的粗糙度和ECH-B增加到0.16±0.04,0.32±0.04μm。然而,SMART-B的粗糙度降低为1.72±0.06μm。

3.2。细胞形态学上各种钛植入体

在评估植入物的生物相容性,我们观察到的细胞附着能力和扩散。在这个工作中,标准电池附件首次建立了细胞培养来确定精确的生物在体外细胞生长和活动的表现。图2显示D1细胞的显微照片图像在不同钛表面有或没有BMP-2 1 h,后1 d, 2 d。1 h孵化后,细胞标本没有BMP-2涂层是球形,和许多微绒毛被发现。1 d的文化后,细胞更有效地附加到表面,从而支持文化的趋势后观察1 h。智能组没有BMP-2涂层有更多的扩展比决定自组细胞形态没有BMP-2后1 d细胞培养。1和2 d的文化后,细胞高度更有效的表面,细胞显示出类似的形态的丝状伪足都向外扩展与1 h文化。结果表明,BMP-2涂层表面与电解珩磨和智能增强细胞附件。

3.3。细胞增殖在各种钛植入体

细胞增殖测定通过MTS试验1、4、7、10、14、21 d。上的D1细胞增殖实验组与加工组如图3。D1细胞的数量增加1天,直到第七天。所有代谢活动达到了最大价值后第七天的D1细胞培养组。此外,D1 SMART-B组的细胞代谢活动最高在这些团体。值的戏剧性的变化,在此期间,细胞的数量减少从第十天到21天,显示发生矿化机制特别是ECH-B的表面和SMART-B组。

3.4。高山D1细胞播种各种钛植入体的活性

本研究的主要目的是分化D1细胞成骨细胞矿化。D1的高山活动细胞显示在图4。D1的高山活动细胞测量后1、4、7、10、14、21 d文化在不同钛基板处理。孵化后1、4、7 d,高山活动的差异没有统计学意义上培养的细胞表面。高山活动达到最大后14 d电解珩磨和聪明,特别是在BMP-2涂层组。值得注意的是,高山活动转移到一个更早的时间在10天D1文化达到最大值,发生在该集团与BMP-2焊接表面。因此,表面形态和BMP-2增长的综合因素导致了早些时候的表情高山与BMP-2钛衬底粘合。

3.5。最初的骨植入各种钛植入体的接触在14天

最常用的商业化的方法修改植入物表面的SLA组选择与我们的实验ECH-B组,比较聪明,SMART-B动物研究。骨植入物(BIC)是通过测量ct机联系。FE-SEM精确成像的画面显示骨植入物接触(图14天5(一个)),导致BIC量化(图5 (b))。最高的价值提出了SMART-BMP-2焊接组。然而,BIC ECH-BMP-2组显示低于SLA组。ct机分析显示相同的BIC趋势SMART-BMP-2集团的BV /电视明显高于在SLA和ECH-BMP-2组(数字6(一),6 (b),6 (c))。

4所示。讨论

硅烷化改性的表面,我们成功地应用在先前的研究6,13),允许生物活性官能团增加粘附能力和生物属性。BMP-2的均匀分布在表面如图1(一)。后拒绝接触角表示增强的润湿性BMP-2结合功能基板。米的戏剧性的变化与BMP-2的自组装表面硅烷键后显示修改后的润湿性。

修改后的表面与生物活性蛋白质,BMP-2,立即提供成骨的信号,提高细胞变成一个机械的三维结构,因此附加到表面因为固定和共价成键BMP-2毛孔。尽管结果显示类似的模式后2 d D1祖细胞的形态特征、表面的薄膜结合刺激细胞增殖和矿化7 d后,如图3和4。正如前面提到的,在交付BMP-2植入的临床挑战网站的蛋白质变性或失活的可能性。这些结果说明BMP-2可能适用于骨再生和减少恢复时间。此外,这个修改为细胞表面结构锚固和扩展中起着关键作用比可溶性BMP-2交付。Crouzier等人表明,高浓度的配体和细胞骨架重构引起matrix-bound BMP-2但不能观察到分散可溶性BMP-2 (16]。这种现象也显示在我们之前的研究17]。

评估最初的植入物的骨整合程度,ECH-B SMART-B商业化的SLA治疗在动物研究比较。SMART-B组的结果显示大约50% BIC和BV /电视早在14 d。值得注意的是,尽管ECH-B组证明有效的体外细胞增殖和矿化,BIC的最小值是观察ECH-B组。不一致的结果可能发生由于失去物理安克雷奇因为ECH-B(平均0.32的粗糙度μ1.27米)明显小于SMART-B (μ米),导致的损失的粘结BMP-2 ECH-B移植手术期间。更高的粗糙度与化学键SMART-B组表现出优越的骨头之间的摩擦阻力和表面改性。因此,的平均粗糙度ECH-B组比SMART-B平组。表面粗糙度可能的原因导致的损失BMP-2的结合。明显差距的SMART-B组提供的证据结合密切BMP-2通过硅烷化,如红线图所示5。

5。结论

osteoprogenitor细胞之间的交互和BMP-2修改表面为Ti牙科植入物可以增加增强细胞矿化。通过硅烷化,BMP-2蛋白可以改善扩散和提高高山表达在细胞培养的早期阶段,这尤其表现在智能组在我们的研究中。结果表明,一个活跃的生物功能表面可以加速osteoprogenitor细胞矿化,但这应该是测试在动物实验中证实结果。表面是适合所有属性,如粗糙度、润湿性和生物因素,特别是影响的早期骨整合牙科植入物。因此,进一步的研究应关注程度的骨整合牙科植入物的各种预处理移植前表面硅烷化可以影响这个过程的早期阶段。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢教授黄Her-Hsiung国立阳明大学,台北,台湾,提供动物实验。这项工作是支持的拨款从经济部,台湾(102 - ec - 17 a - 04 - 04 - 0834),从高雄军队总医院,高雄,台湾(没有。10422)。