伽马辐射诱导损伤的锌指转录因子iii a

文摘

的锌指基序是一种元素的蛋白质能具体地识别和结合DNA。因为它们含有多个半胱氨酸残基,锌指图案具有氧化还原性质。电离辐射产生的自由基的生物。因此,锌指图案可能是电离辐射的目标。伽马辐射的影响在锌指转录因子的图案iii a (TFIIIA),锌指蛋白,研究了。TFIIIA被暴露在不同的射线剂量⁶⁰公司资源。剂量率0.20 Gy /分钟和800 Gy / h,分别。锌指图案的结合能力TFIIIA决心使用电泳迁移率改变分析。我们发现1000 Gy的伽马辐射受损的功能在TFIIIA锌指图案。辐射诱导损伤的网站在锌指半胱氨酸残基的巯基共同和锌(II)离子。硫醇组被氧化成二硫键和锌(II)离子表示减少锌原子。这些结果表明,锌指主题是伽马辐射的目标域,这可能会减少5 s rRNA表达式通过损伤TFIIIA锌指图案的。

1。介绍

锌指蛋白在真核生物中最大的蛋白质之一的家庭,并且约有2 - 3%的人类基因编码锌指蛋白(1]。“锌指”这一术语表示各种各样的紧凑与四面体几何稳定蛋白质域结构二锌离子与半胱氨酸硫醇和组氨酸咪唑组(2]。促进特定protein-nucleic酸锌指图案识别和绑定(3),大多数锌指蛋白转录因子功能。因此,可以推断,代理损坏锌指主题也可能影响基因表达(4,5]。因此,调查因素损害的锌指图案已经收到关注在研究锌指相关蛋白质调节基因的表达。锌指主题可分为半胱氨酸₈,半胱氨酸₄,半胱氨酸₃他和半胱氨酸₂他的₂和其他类型。多个半胱氨酸残基的存在表明,锌指图案具有氧化还原性质,因为大多数在蛋白质发生氧化还原反应的硫醇基半胱氨酸残基(6]。根据他们的氧化还原性质,代理可能损害锌指的活动主题进行了研究。几项研究已经表明,锌指图案是容易的在体外氧化诱导等代理3-nitrosobenzamide,过氧化氢,戒酒硫(7- - - - - -10]。这些观察结果也证实在活的有机体内镇压的基因特定于sp 1时,锌指蛋白,观察培养的海拉细胞受到氧化应激(11]。电离辐射的生物效应包括生物材料的氧化或还原。作为一种间接影响,许多水辐解产生的产品。因此,锌指图案可能是电离辐射的目标。

一个锌原子是一个相对redox-inert元素的氧化态锌(II)。在动物细胞中,锌(II)离子存储在胞质cysteine-rich蛋白或金属硫蛋白,zinc-sulfur形式的集群。“免费”的水平细胞内锌(II)离子很低,也就是说,nanopicomolar范围,自发释放锌(II)离子从金属硫蛋白系统目标蛋白质不发生(12]。除了破坏锌指图案,氧化剂可能参与锌代谢。目前的调查表明,氧化剂的影响锌指图案都与锌(II)离子的释放13]。根据这一假说,在金属离子锌指可能作为锌池中。电离辐射不同于常用的氧化基团的氧化锌指图案,不仅因为它们诱导形成氧化自由基也减少了激进的,也就是说,水合电子。水合电子的存在可以减少二锌离子。

转录因子iii a (TFIIIA)是第一个锌指蛋白中确定非洲爪蟾蜍,它由九个串联重复序列半胱氨酸₂他的₂型锌指(14,15]。这种类型的三维构象的锌指包含一个α螺旋和两个β表。的内部控制区域(ICR) 5 s rRNA基因有120个碱基序列,包括三个独立的启动子区域的一盒(+ 50 + 64),一个中间元素(+ 67 + 72),和一个C-box (+ 82 + 92) (16]。的九个锌指TFIIIA具体结合只有通过插入的α螺旋进这三个子区域的主要或次要的凹槽(17]。TFIIIA被选为调查损坏的锌指基序,因为半胱氨酸₂他的₂类型锌手指相对电中性,具有所有已知的条件之间的缔合常数低锌指蛋白(18,19]。在这个实验中,我们研究了电离辐射的影响的锌指基序TFIIIA和相应的损伤机制。具体地说,我们研究了锌指的绑定能力gamma-irradiated TFIIIA irradiation-induced ICR和识别潜在的网站的损害。我们所知,只有一篇文章已经发表在电离辐射的影响在一个蛋白质包含zinc-sulfur集群,也就是说,金属硫蛋白,分析其辐射防护功能的目的(20.]。我们的研究结果表明,辐射影响特定绑定的TFIIIA ICR通过巯基/二硫锌和锌(II)离子/原子交易所锌指图案。

2。材料和方法

2.1。质粒的制备pMD18T-ICR

完整的ICR序列合成一个自动化DNA合成仪(ABI 394年,应用生物系统公司公司,卡尔斯巴德,CA,美国)使用phosphoramidite化学。然后ICR序列的结扎pMD18T向量(豆类有限公司、大连、辽宁、中国),转换成大肠杆菌主管细胞(豆类)。扩大了目标DNA聚合酶链反应(PCR),琼脂糖电泳分析,证实了DNA测序。

2.2。制备重组TFIIIA

重组非洲爪蟾蜍光滑的TFIIIA是由大肠杆菌BL21 (DE3)细胞窝藏质粒pcoldII-TFIIIA [21]。短暂,细胞培养在37°C用颤抖的在220 rpm,当细胞密度(OD600)达到0.6,TFIIIA表达式被添加0.1毫米isopropylthio -诱导β- - - - - -D半乳糖苷(IPTG)和10μM ZnCl₂。4 h后进一步孵化37°C,细胞收获和细胞溶解EmulsiFlex-C3均质器(Avestin,渥太华,加拿大)。细胞溶菌作用后,包涵体,包含大多数TFIIIA,第一次洗缓冲区1 (50 mM Tris-Cl 100毫米生理盐水1毫米EDTA,特里同x - 100和0.1%,pH值8.0)在被溶解在缓冲2 (50 mM Tris-Cl 100毫米氯化钠6 M盐酸胍和5毫米德勤,pH值8.0)。整个溶解过程是在4°C,和24小时完全溶解TFIIIA所需。上层清液然后慢慢稀释缓冲3(50毫米Tris-Cl, 50毫米氯化钠,100μM ZnCl₂谷胱甘肽0.1参数1毫米,0.1毫米GSSG, 10%甘油、0.1%诺乃清洁剂p 40, pH值8.0)的速度每秒一滴,和样品在4°C慢慢搅拌24 h TFIIIA再折起。重折叠过程完成后,样本集中使用一个超滤管(Amicon超、微孔有限公司Billerica,妈,美国)之前被快速蛋白液相色谱纯化使用Superdex 75列(美国通用电气有限公司,费尔菲尔德,CT)。

检测锌(II)离子辐照TFIIIA,重组TFIIIA也准备在缓冲区没有锌(II)离子补充。与上面描述的过程类似,包涵体中包含的TFIIIA复合使用缓冲区1,2,3。该复合TFIIIA然后在4°C和40%硫酸铵沉淀了30分钟。颗粒再次与缓冲2和复合变性缓冲3缺乏100μM ZnCl₂。其余的净化过程进行如上所述。使用布拉德福德的蛋白浓度测定方法,以及纯化TFIIIA解决方案(0.25μ克/μL)储存在−80°C到使用。

2.3。辐射暴露

TFIIIA解决方案是辐照⁶⁰公司资源的氛围中空气在4°C。吸收剂量0 Gy, 1 Gy, 10 Gy, 100 Gy, 500 Gy, 800 Gy, 1000 Gy。低剂量(1 Gy, 10 Gy)管理⁶⁰Co源(Gaotong同位素有限公司成都,四川,中国)放射性约22.2×10¹²Bq。剂量率为0.20 Gy /分钟。高剂量(100 Gy, 500 Gy, 800 Gy, 1000 Gy)是管理⁶⁰有限公司源(Nordion Inc ., Kanata、加拿大)的放射性大约14.8×10¹⁶Bq。剂量率是800 Gy / h。剂量测定法进行定期的0.6厘米³农民电离室(30010型),是连接到一个剂量计(Breisgau PTW-Freiburg Co .)、弗莱堡,德国)。旁边的房间被辐照管。

2.4。电泳迁移率改变分析

荧光FAM-labeled探针的制备,只有5 s核糖体rna基因的PCR扩大了使用高保真Dpx DNA聚合酶(吐露港生物技术。中国上海)使用引物的质粒pMD18T-ICR M13F-47 (FAM)和M13R-48。FAM-labeled探针是纯化使用向导SV凝胶和PCR清理系统(WI Promega有限公司麦迪逊,美国),量化NanoDrop 2000 c系统(热有限公司沃尔瑟姆,妈,美国)。电泳迁移率改变分析(EMSA)中执行20μL反应体积包含50 ng的探针和2.5μ辐照TFIIIA g,反应缓冲区的50 mM Tris-HCl (pH值8.0),100毫米氯化钾,2.5毫米MgCl₂,0.05毫米德勤,10%甘油。孵化后30分钟25°C,反应系统加载到2%琼脂糖凝胶缓冲与0.5×此种。凝胶进行扫描ImageQuant LAS 4000迷你系统(GE)。剪大马哈鱼精子DNA (100 ng /μ添加L)是为了防止非特异性结合。

2.5。量化的辐照TFIIIA二硫化

二硫检测程序如下:TFIIIA解决方案(0.25μ克/μL, 200μL)被用移液器吸取到5,5′-dithiobis-2-nitrobenzoic酸(DTNB)和2-nitro-5-thiosulfobenzoate (NTSB)解决方案(3毫升),分别。DTNB解决方案(pH值8.0)和8 M尿素制备,200毫米三,1% SDS, 3毫米的EDTA, DTNB 10毫米。NTSB的解决方案是由股票的解决方案(100毫克的DTNB溶解在10毫升的1 M Na₂所以₃,pH值调整到7.5;亮红色的解决方案被带到38°C,和氧气是通过它充溢)通过稀释1:100年,一个刚做好的解决方案包含8 M尿素,三,200毫米100毫米亚硫酸钠,EDTA 1% SDS, 3毫米。蛋白质的混合物,DTNB / NTSB解决方案在黑暗中孵化了30分钟。吸光度在412 nm当时记录的空白3毫升DTNB或NTSB解决方案和200年μL的水。DTNB混合物的吸光度在412海里被发现与自由硫醇含量和增加线性NTSB混合物总硫醇的内容。因此,二硫的浓度可以通过使用下面的公式: 在哪里稀释倍数,TFIIIA的浓度,TFIIIA的体积,消光系数(13900⁻¹厘米⁻¹)。

2.6。量化的锌(II)离子辐照TFIIIA

锌(II)离子分析工具包(建成有限公司、南京、江苏、中国),这是基于比色法,是用来确定锌(II)离子的浓度gamma-irradiated TFIIIA。以下程序:使用试剂1(抗坏血酸和柠檬酸钠溶解在消息灵通的缓冲区(0.2米,pH值6.0),最终浓度为0.05 M抗坏血酸和柠檬酸钠0.2米)与辐照TFIIIA混合(150μ(150 L)和标准的解决方案μ30.6 L,μM;ZnSO₄)。5分钟的解决方案是孵化的37°C。溶液的光密度是阅读在578 nm使用紫外-可见分光光度计(日本岛津公司有限公司日本京都)。在阅读之后,600年μL 5-Br-PAPS被添加到解决方案。混合解决方案是孵化为5分钟37°C。溶液的光密度是阅读。(2)锌离子的浓度是使用以下公式计算:

3所示。结果与讨论

3.1。结合Gamma-Irradiated TFIIIA ICR

伽马辐射的影响在绑定使用EMSA TFIIIA ICR的进行了研究。不同剂量的γ射线,从1 Gy - 1000 Gy,被用来照射TFIIIA解决方案。图1(一)显示了绑定的辐照TFIIIA EMSA乐队只有和图1 (b)显示积分光密度(IOD)的乐队。如图1(一)γ剂量等于或低于800 Gy施加无显著影响绑定的TFIIIA只有和TFIIIA辐照剂量与这些仍然可以绑定与ICR(车道3 - 7)。结果和相应的碘(图一致1 (b))。然而,1000 Gyγ辐照消除这个绑定能力,而且,在这个剂量,绑定的TFIIIA ICR显著下降(巷8)。相应的碘1000 Gy为345.70。这些结果表明,1000 Gy的伽马辐射损害TFIIIA锌指主题和功能降低特定绑定的TFIIIA ICR。绑定的TFIIIA ICR 5 s rRNA的表达式的第一步;减少在特定绑定的TFIIIA ICR可能因此影响5 s rRNA的表达。

3.2。损害网站的锌指基序Gamma-Irradiated TFIIIA

硫原子的蛋白质的氧化还原电势范围从0.27−−0.125 V (22]。硫醇基的低氧化还原电势表明锌指图案很容易氧化。γ放射性损伤的绑定能力TFIIIA可能涉及氧化锌指巯基共同的主题。戴斯。莱纳姆:二硫苏糖醇(DTT),代理,减少了可逆氧化硫醇基,被用来探索的锌指硫醇组织图案是否辐照TFIIIA被氧化了。图2(一个)介绍了EMSA乐队辐照后绑定的辐照TFIIIA ICR TFIIIA与不同浓度的德勤,孵化和图2 (b)显示了IOD的乐队。德勤的浓度是0.05毫米,0.1毫米,0.2毫米,0.5毫米,1.0毫米,分别。辐射剂量是1000 Gy。如图2(一个),德勤在0.1毫米的绑定能力无显著复苏辐照TFIIIA(巷2)。相应的IOD只有398.44(图2 (b))。德勤在0.2毫米的应用产生了轻微的复苏(巷3)。然而,经济复苏引起德勤在0.5毫米是重要的(巷4),碘为7378.14。此外,德勤在1.0毫米的应用产生了类似的复苏,0.5毫米的诱导下,德勤(巷5),碘为7963.55。产品的氧化硫醇基可以可逆或不可逆。可逆的最终产品是二硫化23),和不可逆产品是亚磺酸和磺酸。锌指绑定的复苏能力观察孵化后的辐照TFIIIA德勤表明γ辐射的水辐解产物氧化硫醇组锌指图案生成二硫产品。

为了进一步证明获得的结果图2二硫的浓度在辐照TFIIIA使用比色法检测到。γ剂量使用从1 Gy - 1000 Gy。图3显示二硫的浓度在TFIIIA与不同的γ辐照剂量。二硫的浓度增加而增加剂量,并在1000年二硫化Gy辐照TFIIIA明显高于对照组。结果表明水辐解支持产品1000 Gy的伽马辐射氧化硫醇组锌指图案形成二硫产品。水辐解产品有羟自由基、过氧化氢、水合电子、氢自由基。他们的值是2.7,0.55,2.7和0.7,分别。二硫的生成相应的反应如下:

几项研究已经表明,形成二硫键的锌指基序直接导致释放锌(II)离子(13,24]。这个版本促进最终崩溃的锌指基序的结构,这可能是减少的原因与ICR辐照TFIIIA绑定的。

尽管绑定的TFIIIA ICR巯基/二硫交换,影响调制部分因为德勤在0.5或1.0毫米不完全恢复绑定辐照TFIIIA(图的能力2(一个)道4和5)。半胱氨酸残基,锌离子是必不可少的因素各种类型的锌指结构的图案,如半胱氨酸₈和半胱氨酸₄,这表明硫醇基与锌结合位点是非常重要的锌指结构和功能。发现德勤部分恢复的绑定能力辐照TFIIIA表明锌网站,除了硫醇基,可能参与了锌指图案的损害。图4(一)介绍了EMSA乐队的结果绑定后的辐照TFIIIA ICR辐照TFIIIA与不同浓度的ZnCl孵化₂。图4 (b)显示了IOD的乐队。ZnCl的浓度₂使用20μ50米,μ米,100μM,分别。如图4(一),ZnCl₂在20μM的绑定能力产生了轻微的复苏辐照TFIIIA(巷2)。相应的IOD是929.92。然而,ZnCl₂在50岁μM导致了一个相对重要的恢复绑定能力(巷3),IOD是3784.67。治疗100μM ZnCl₂IOD 3338.12(巷4和图生产4 (b))。这些结果表明,锌网站参与γ辐射诱导损伤锌手指图案。

辐照TFIIIA的绑定能力完全恢复后孵化与50μM ZnCl₂和0.5毫米德勤(图5(一个))。相应的IOD 10156.85(图5 (b))。生产的全面复苏的结合这两个代理进一步表明损坏锌指图案到1000年TFIIIA Gy的伽马辐射包括硫醇基和锌。

3.3。损坏锌锌指主题的网站Gamma-Irradiated TFIIIA

虽然硫醇基减少德勤可以夺回现有锌(II)离子重构锌指的功能,功能完全康复后才发生降低辐照TFIIIA与新的ZnCl孵化₂解决方案(图5(一个))。这个结果表明一些锌(II)离子辐照TFIIIA正在改变。锌是一种金属离子,这种变更价态的形式会发生改变。到目前为止,没有发达的直接检测方法改变价金属离子在溶液中电离辐射引起的。比色法测定锌(II)离子的浓度因此用于间接评估是否在辐照TFIIIA锌离子的化合价变化。缓冲区的辐照TFIIIA不含有锌离子。表1显示的内容锌(II)离子TFIIIA辐照与1000 Gy;锌(II)离子的浓度比未照射低辐照TFIIIA TFIIIA。锌原子的价是0和2,分别。

减少锌(II)离子的浓度间接表明,锌(II)离子进行了还原,和锌原子在辐照TFIIIA生成。伽马辐射诱导减少水化电子是一个强大的代理与氧化还原电位为2.77 V。在辐照TFIIIA锌原子生成的水合电子。相应的反应如下: 生物保护自己免受金属元素通过使用各种蛋白质隔离金属元素。锌原子函数生成自由基,可能是一个辐射损伤的重要来源。重要的是,锌原子的形成辐照TFIIIA表明原子核外的价电子的金属离子易受电离辐射。价电子原子核外的金属离子可能是一个新的站点辐射敏感。金属离子参与各种生理过程,并对辐射的影响在此基础上敏感的网站,因此,辐射生物学中具有重要意义。

4所示。结论

TFIIIA是一种转录因子,特别是结合5 s核糖体rna基因通过锌finger-ICR复合物的形成。伽马辐射(1000 Gy)会削弱绑定ICR的锌指图案。网站辐射诱导损伤的锌指基序的半胱氨酸残基的巯基共同和锌(II)离子。硫醇组被氧化成二硫键和锌(II)离子可能减少锌原子。在这个实验中,我们得到了在体外伽马辐射诱导数据损坏锌指TFIIIA的图案。进一步的工作应该关注γ辐射诱导损伤的锌指基序在活的有机体内。辐射对蛋白质的影响包含金属离子和/或硫醇组是重要的和值得进一步调查。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作得到了中国国家重点基础研究计划(973计划)资助2013 cb933904;中国国家自然科学基金会拨款31400721和31400721;和优先级的学术程序开发江苏高等教育机构。

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