公差Chemoorganotrophic Bioleaching微生物的重金属和碱性压力

文摘

bioleaching潜在的细菌芽孢杆菌mucilaginosus和真菌黑曲霉向工业残留物调查评估他们对各种重金属的反应(包括砷、镉、钴、铬、镍、铅、锌)和高博士为每个金属板扩散方法进行确定毒性效应。液体批文化建立更多的定量评价以及研究碱度的影响。增长曲线是准备使用细菌/真菌生长计数板计数等技术,光学密度测量,和干重的决心。镉、镍、砷的增长有负面影响b . mucilaginosus,而答:尼日尔对镉和砷酸是敏感。然而,这表明经济增长恢复时微生物培养的这些金属被接种到不含金属的媒介。基于抑菌的结果/金属的抑制真菌的效果和微生物的适应能力相当高pH值,结果表明,两株碱性的潜在适用性为进一步研究关于bioleaching浪费材料。

1。介绍

世界人口的增长导致了材料消耗的增加和工业扩张,导致不可持续的压力在地球上的自然资源储备和环境。出于这个原因,调查有关可持续发展的技术和回收策略越来越青睐。在过去的几十年,兴趣—这是固体金属值转化为他们的水溶性形式使用微生物,有显著增加1,2]。这项技术已经商业化等金属矿石难浸金矿石和铜复苏的biooxidation [3,4]。

金属的溶解可通过各种种类的细菌和真菌,是基于三个主要机制,可以同时发生2,5,6]。酸解(i)是迄今为止最重要的一个,与常规酸浸出的机理非常相似。有机和无机酸是由微生物产生,进而浸出的金属固体质子化作用。在complexolysis (ii)、生物制剂的微生物排出体外,这些溶解金属离子通过配位体形成。柠檬酸,举例来说,是一种强大的自然螯合剂(7]。最后,在redoxolysis (iii)、氧化和还原反应,释放金属矿物。

Bioleaching受到广泛的参数包括理化和微生物的因素。这些影响微生物的生长及其浸出行为。bioleaching成功,很明显,必须保持最佳生长条件和微生物必须能够过滤材料。此外,最重要的是,必须对微生物的金属剥离(1]。一个合适的温度、pH值、氧气、盐度、和营养的可用性是微生物的生长和维护势在必行。这些条件是物种依赖、主要是重要的是要知道分类的微生物所属(自养和异养,等等)。虽然大部分的最优温度变化约30 - 50°C(嗜温菌),bioleaching表现在低/高的温度下(psychro - /嗜热菌)也报道,是使用有氧和厌氧微生物(1,8]。介质的pH值是非常重要的生物酸分泌的数量和性质也会影响重金属的可用性(9]。有机酸的生产是强烈依赖于培养基成分和培养条件;在这方面,碳源及其浓度是重要的,以及重要离子的存在(10]。浸出的金属,固体的性质,包括矿物组成、泥浆密度,粒度是关键因素5]。

除了自然资源的情况,bioleaching可以是一个有趣的路线从工业废料回收金属材料,如焚烧炉灰烬,冶金渣和矿尾矿。它也可以应用于解毒重金属污染的土壤和地下水在不同矿床网站(9,11,12]。然而,挑战在于腐蚀性和有毒的性质这些废料。重金属的存在在bioleached材料可以影响微生物的生长和代谢过程。重金属是被细菌细胞通过相同的重要的矿物质,如镁离子运输通常需要和磷酸盐(13]。这导致特定的酶活性,抑制位移基本金属,破坏膜运输过程(14,15]。Bioleaching在一个两步的过程中,没有直接接触微生物和重金属,发布比减少毒性效应;然而,它复杂的实现连续回收系统(16]。

没有明确的答案的宽容微生物有毒的重金属离子的存在。据报道,一些微生物获得某种形式的适应机制,类似于被暴露于抗生素,以确保微生物种群的生存和多样性。金属耐受性机制包括细胞外或细胞内封存的有毒金属,通常由基因质粒(17,18]。适应策略包括金属离子的主动运输从内到外的细胞,与胞外聚合物(EPS),物质细胞表面复合物的形成,和金属还原到更少的有毒状态(9,14,19- - - - - -21]。

最著名的宽容对重金属在策略芽孢杆菌物种是胞外聚合物(EPS)的物质的生产,一个复杂的混合多糖,蛋白质,核酸,脂质。每股收益的生产受到介质成分和细菌的保护环境压力(22]。bioleaching过程中,也会导致生物膜的形成,起着重要的作用在附件细菌细胞的固体材料(19]。EPS层,pH值和溶质浓度的最佳条件。此外,EPS参与金属离子的捕获方案,防止他们进入细菌细胞(23]。

在目前的研究中,研究高pH值和是否存在多种重金属和准金属阻碍工业残留的碱性bioleaching的可行性。为此,两个chemoorganotrophic微生物菌株的耐受性,显示潜在的bioleaching废料(16),芽孢杆菌mucilaginosus和黑曲霉评估。这些微生物与一种矿物在自然界中,化合物在碱性工业残留物,但在他们的自然环境并不接触,因此不会成为适应,高水平的移动重金属和准金属(24,25]。

2。材料和方法

2.1。微生物生物和化学物质

芽孢杆菌mucilaginosus从中国获得了工业文化中心集合(中金、中国)。黑曲霉(dsm - 872)是由德意志Sammlung冯Mikroorganismen和Zellkulturen GmbH (DSMZ,德国)。推荐的供应商,b . mucilaginosus在营养琼脂培养和0.001% MnSO补充吗₄·H₂O为孢子形成增强和孵化24小时30°C,而答:尼日尔在马铃薯葡萄糖琼脂和孵化培养30°C 5天。琼脂的偏应变被保存在4°C。

的重金属和各自的盐}调查一样(3)哈斯₂O₄},(V)KH₂麻生太郎₄},Cd (2)Cd(不₃)₂h·4₂O},有限公司(2)有限公司(没有₃)₂h·6₂O}、铬(III)Cr(不₃)₃h·9₂O}、铬(VI)K₂Cr₂O₇}、镍(II)倪(不₃)₂h·6₂O}, Pb (2)Pb(不₃)₂},锌(II)锌(不₃)₂h·6₂O}。每个金属盐溶解在100 mM柠檬酸/柠檬酸钠缓冲的pH值6.80。股票的解决方案1000 ppm金属含量的准备,并进一步稀释是用相同的缓冲区。

所有增长媒体和化学试剂均为分析纯,购自西格玛奥德里奇(Bornem、比利时),并使用没有任何进一步净化。增长媒体、化学溶液和玻璃材料灭菌15分钟在120°C使用之前,和随后的操作被执行在无菌条件下层流内阁。

2.2。板扩散法

第一次调查上述元素的影响微生物菌株的生长进行了使用板扩散法;更具体地说,使用中央试井(26]。在这种方法中,一个小腔琼脂板的中心,在其中一个数量的金属解决方案。这允许在琼脂平板扩散梯度的形成在孵化过程中,浓度附近的好,基本上零浓度较高的外围。营养或马铃薯葡萄糖琼脂板(90毫米)是第一个大量接种刚发展的文化,分别b . mucilaginosus或答:尼日尔压力。然后,一个中央的1厘米。到这个,100μL的金属溶液的浓度1000 ppm的金属组件被添加。每个板准备一式两份,空白板使用缓冲溶液没有金属化合物也。所需的潜伏期后30°C,金属的影响在两个菌株的生长评估视觉通过测量和比较的直径增长抑制区。板扩散试验随后重复与低浓度的金属解决方案对于那些条件敏感的微生物菌株发生1000 ppm解决方案,评估耐受阈值。

2.3。液体批文化

演示了一个重大影响的金属在上述两个微生物菌株的生长板扩散试验是在液体中实现文化。在该测试中,所需的金属量股票的解决方案是添加到接种肉汤培养基(营养肉汤MnSO为0.001%₄·H₂O为b . mucilaginosus和马铃薯葡萄糖肉汤答:尼日尔)。参考空白准备通过添加等量的缓冲溶液,而不是金属解决肉汤培养基。

实验对碱度的影响,最初的营养丰富的培养基(初始pH值7.15马铃薯葡萄糖肉汤的营养肉汤和pH值6.70)增加了添加氢氧化钠,直到所需的pH值(9.0,11.0,12.0和13.0)。pH值测量与SevenMulti酸度计(梅特勒-托利多)。

对于每一个实验,200毫升或100毫升的培养基配方,metal-stress和alkaline-stress实验,分别是厄伦美厄烧瓶内放置并接种适当的压力。孵化是在30°C执行所需的时间。被一个磁性搅拌棒的解决方案。在批处理模式和执行的实验没有pH-adjusted。每24小时测量pH值。

2.4。测定微生物生长

传统的技术被用来检测微生物生长。为b . mucilaginosus,扩散板的方法和测量光密度的总和。镀传播,100年μL整除的细菌培养(是否连续稀释在生理盐溶液、0.9%氯化钠)被转移到一家营养琼脂板和板的整个表面。每个扩散板是一式两份。孵化后,殖民地手工计算和增长表示为每毫升集落形成单位(CFU /毫升)。光密度测量在610 nm Jenway分光光度计波长。为此,1毫升文化的培养基配方的采集样本,如果有必要,用营养肉汤稀释的吸光度在线性范围0 - 0.6。与空白营养肉汤进行零点校准。

的增长答:尼日尔随后的扩散板的测量方法或干生物量。扩散板方法类似于一个用于芽孢杆菌应变,除了马铃薯葡萄糖琼脂板。测量的干生物量包括真菌生物量分开的液体培养Biofuge Stratos离心机(贺利氏的乐器),紧随其后的是隔夜干燥在110°C。干生物量的质量是衡量对真菌细胞的生长。这些液体批文化建立了400毫升的肉汤培养基。此外,金属的浓度在上层清液阶段相比,决心和最初的金属浓度。金属浓度测定用原子吸收光谱法(SpectrAA 220年,瓦里安,比利时)。

3所示。结果与讨论

3.1。的增长芽孢杆菌mucilaginosus

3.1.1。重金属的影响

板扩散试验的结果表明,缓冲溶液的生长没有影响b . mucilaginosus和答:尼日尔。在图1最重要的观察重金属抑制b . mucilaginosus所示,这些铬(VI)的存在,(III), Cd (II)。测试的其他金属的生长没有显著影响b . mucilaginosus因此这里没有显示。这些测试进行1000 ppm的金属化合物;因此,对于每一个金属,摩尔浓度不同。在目前的情况下,摩尔浓度降序对铬(VI) 19.2毫米,13.3毫米(3),和8.9毫米Cd (II)。的抑制区域的大小,最大的敏感性发生与Cd (II)(图1(一)(3)(图)紧随其后1 (b));铬(VI)(图有最小的影响1 (c))。基于这些研究结果,得出Cd (II)是最发展的有毒金属b . mucilaginosus。

(一)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

板扩散试验重复了Cd (II)和减少金属浓度(800、400和100 ppm);这些结果如图1 (d)来1 (e)。减少敏感性对金属浓度的降低是清晰可见的行为抑制区。另一个有趣的观察是,旧的文化似乎更敏感的重金属压力。然而,随着时间的推移,这些殖民地适应并生长在重金属压力。生物量的时代文化有助于改变和延迟适应策略由于细胞大小变化,墙组成,细胞外产品形成(9]。

进一步调查的增长b . mucilaginosus重金属胁迫下液体执行批处理文化的影响下Cd(2)和(3)在100 ppm的浓度。此外,100 ppm的镍(II)也进行了研究。结果与空白相比孵化一批,没有金属添加到菇营养丰富的生长介质。增长测量孵化时间为了图一个细菌生长曲线。图2演示细胞计数之间的关系基于传播电镀和光学密度的测量。b . mucilaginosus展示一个线性梯度光学密度约为0.6;更高的密度芽孢杆菌压力应该因此被稀释。测量的光学密度有几个优点关于电镀的一种文化27]:低成本、快速、无损的,因此是首选的批实验与执行b . mucilaginosus。

在图3概述不同的增长曲线b . mucilaginosus在金属的存在。一般来说,它可以表示,微生物生长曲线由图中注明的4个阶段:(1)的迟滞期微生物适应新环境;(2)指数或对数生长期中微生物生长和分裂以恒定速率,生成,或倍增时间;(3)固定相,表明一个平等的增长和衰减率由于缺乏营养或过度的微生物自身产生的废料;最后的死亡期(4)微生物死在一个指数(28]。

b . mucilaginosus增长的影响下金属;然而,较低的光密度值获得的金属的存在表明,细菌生长情况没有金属相比要低得多。与空白相比,增长的Cd (II)和镍(II)大约是三分之一一样大,而存在(III)的最大生物量浓度的大约一半。再次考虑的摩尔浓度,Cd (II)(0.9毫米)是最有毒金属(III)(1.3毫米)和镍(II)在这个测试(1.7毫米)。

每次OD测量,重复连续板与不含金属的琼脂培养基进行计数的殖民地。这些测试表明,菌落的数量没有显著差异的文化,没有金属,虽然殖民地的外观改变。通常情况下,b . mucilaginosus生长在营养琼脂板一样大,光滑的殖民地与大量粘液代(例如,图4(一))。在菌株的情况下接触重金属在批处理文化中,殖民地发现小得多,显然没有粘液代(如在图4 (b))。据报道,作为生产EPS的一部分,可以形成特定的蛋白质能够绑定的金属离子,促进细菌对重金属的耐受性。不过,这种生物材料的存在可以抑制微生物生长,例如,通过创建一个氧气传输延迟或减少细菌细胞的清除代谢产物(29日]。目前的结果表明,表面或表面的复合物b . mucilaginosus被修改时,细菌最初生长在一个中等与Cd (II),随后是生长在一个不含金属的媒介。看来粘液代谢停止或被严重干扰。

(一)

(b)

如图5在增长,pH值b . mucilaginosus从7到10的空白文化和文化与金属。这可以解释为柠檬酸代谢b . mucilaginosus柠檬酸,可以从金属盐的缓冲溶液溶解,利用碳源,导致介质的碱化。看来这个柠檬酸代谢不受金属的存在。应该提到,在如此高的pH值,金属可以在他们的氢氧化物沉淀形式(30.]。这或许可以解释为什么细菌不会成为完全灭活,金属可能不再是可利用的解决方案。

3.1.2。初始pH值的影响

除了调查重金属的影响,初始pH值的影响进行了研究。富含金属废料,如冶金渣和焚烧灰通常以其高碱度,并出于这个原因芽孢杆菌初始pH值下的应变是培养9,11、12、13所示。图6展示了进化的pH值和增长芽孢杆菌在培养时间紧张。基于光密度测量,有更多的增长b . mucilaginosus在营养肉汤的pH值增加到9相比,参考营养肉汤培养基pH值为7。几乎没有任何增长时观察到的初始pH值中增加到12和13所示。11日,文化与初始pH值的指数增长从第三天开始观察;值得注意的是,在那一刻pH值下降到约9。这些结果证实了测量重量的干生物量的这些实验(表1)。没有生物恢复的文化与初始pH值12和13,0.88 g / L的生物被发现的文化与初始pH值9和0.26 g / L生物量与初始pH值的11。因此增长b . mucilaginosus支持在一个初始pH值9,而初始pH值的增长被推迟11;看来细菌分泌酸性化合物调节pH值的最佳生长条件。12或13岁的初始pH值导致完全失活的细菌;在这种情况下,细菌死亡之前能够充分酸化中。


pH值	芽孢杆菌mucilaginosus	黑曲霉

9.0	0.88	0.55
11.0	0.26	1.23
12.0	没有增长	1.36
13.0	没有增长	可以忽略不计

(一)

(b)

3.2。的增长黑曲霉

3.2.1之上。重金属的影响

相同的实验进行真菌的物种黑曲霉。最重要的重金属抑制答:尼日尔一样(III), (V), Cd (II)。几项研究已经报道的高容忍答:尼日尔与其他真菌,相比重金属Cd (II)是一种最有毒金属曲霉属真菌sp。20.,31日]。从图7可以看到,它的增长模式答:尼日尔是不同的b . mucilaginosus;作为参考,没有金属的板图所示7(一)。很明显,(V)和Cd (II)对真菌的生长产生负面影响。Cd (II)的测试是重复600年降低浓度,400和100 ppm。这些结果如图7 (e)来7 (g)明显,低浓度被认为更大发展。

(一)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

一批液体文化准备答:尼日尔100 ppm的Cd (II)。同样的理由b . mucilaginosus在孵化、真菌生长和pH值测量时间和文化而不含金属的参考。这些结果提供了图8,其中真菌生长的基础上计算菌落的数量。结果相似b . mucilaginosus;CFU值没有显著差异,但殖民地结构明显改变。而答:尼日尔通常随着大,粗糙的殖民地与可见黑色孢子,在紧张的情况下接触Cd (II),殖民地明显小孢子形成,缺乏可见的。该可视化图所示9。这样的结果表明,金属是绑定到细胞表面上的物质作为配合物,分离曾经回到最佳生长条件。

(一)

(b)

(一)

(b)

图8显示参考文化最终的pH值低于3,而对于文化暴露于Cd (II) pH值增加了近10。答:尼日尔众所周知,产生有机酸代谢活动期间,如柠檬酸、葡糖酸(12]。Cd的pH值增加(2)掺杂文化并不意味着没有酸的生产,但这可能意味着基本化合物中产生更大的数量。然而,以前的工作表现青霉菌chrysogenum(32)指向中断生产酸代谢的主要原因,随着葡萄糖氧化酶活动是受重金属严重影响。这种酶催化氧化葡萄糖葡糖酸。减少或缺乏葡糖酸生产可能因此解释pH值增加。

一个额外的实验使用答:尼日尔执行确定生物质生产的干重。真菌的生长在100 ppm Cd (II)肉汤和比较文化的引用。经过15天的增长,真菌生物量收获。参考文化包含3.02 g / L干生物量,而文化生长在Cd (II)存在只有达到0.96 g / L的干生物量。这些结果进一步支持这样的结论,即Cd (II)负面影响的增长答:尼日尔。值得注意的是,在这个实验中,Cd (II)浓度降低从最初的100 ppm到大约80 ppm,表明这种金属的生物吸附的行为。丝状真菌的吸附能力,等曲霉属真菌sp.和青霉菌sp,已经证明是有效的和两个活的和死的生物质材料(33]。真菌细胞壁的几丁质组成的复杂结构,蛋白质、多糖和其他衍生品,提供许多官能团能够与金属离子。这甚至产生了技术方法生物量改变收益率更高bioadsorption [9]。

3.2.2。初始pH值的影响

调查的高初始pH值,曲霉属真菌应变是生长在马铃薯葡萄糖培养基配方与初始pH值为9,11日,12日和13日,和增长与参考文化pH值6.7。我们可以看到在图10,其中展示了进化的pH值在孵化期间,pH值下降的文化准备初始pH值低于或等于12。13日,文化与初始pH值的pH值保持不变,这表明微生物活动的缺失。不过,参考文化的pH值降低到最小值。在实验结束时,生物量中确定(表干重1):9,文化与初始pH值的0.55 g / L的生物量测定,而文化的生物量浓度初始pH值11和12的1.23 g / L和1.36 g / L,分别。几乎没有任何增长被视为文化pH值13(质量不是衡量)。据报道,答:尼日尔礼物优势bioleaching焚化炉粉煤灰因为其茁壮成长在高碱度的能力。在这种情况下,据说条件更有利于葡糖酸生产,成为主要bioleaching经纪人柠檬酸(12]。从目前的结果似乎还生物量增长是推动更高的pH值,只要不超过一定的限制。

4所示。结论

本研究的目的是评估重金属和高碱度值是否阻碍增长的两个chemoorganotrophic微生物,细菌芽孢杆菌mucilaginosus和真菌黑曲霉。增长决定在琼脂平板和液体批文化,提供必需的营养。结果表明,镉,镍,亚砷酸盐(如(3))的增长有负面影响b . mucilaginosus,而答:尼日尔是对镉和砷酸敏感(如(V))。这些影响被推迟或减少经济增长特征,但在没有一批文化共观察微生物的失活或死亡所使用的浓度100 ppm。两种微生物表现出很强的适应能力,一旦金属被恢复和增长。然而,殖民地的外观改变;因此金属似乎导致修改外部细胞结构。此外,与曲霉属真菌应变,发现修改的新陈代谢。孵化高pH值证明微生物都能够生长在高碱度,pH值9b . mucilaginosus甚至pH值12答:尼日尔合理的范围内,值bioleaching碱性材料。

总之,研究金属有抑菌和抑制真菌的作用芽孢杆菌mucilaginosus和黑曲霉分别,但不作为杀菌剂和杀真菌剂。关于bioleaching工业残留物,增长高pH值不应该成为障碍。因此这两种微生物在此研究为应用程序提供机会的修复重金属拉登废料,土壤或沉积物。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

承认

作者感谢K.U.鲁汶工业研究基金会(油田)可持续物质化的知识平台的资金从热过程产品(SMaRT-Pro残留²这项工作进行的)。

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