砷质数人类骨髓CD34 +细胞红细胞分化

文摘

三氧化二砷展品在某些血液恶性肿瘤,治疗效果至少部分是通过调节细胞分化。以前的在体外人类造血祖细胞的研究表明,砷可以抑制红细胞分化。然而,这些影响都观察到砷化合物的存在,而伴随细胞抑制剂和细胞毒性的砷可能掩盖prodifferentiating活动。消除细胞抑制剂和细胞毒性的潜在影响的砷,我们采用了一种新的协议由初加工人类骨髓CD34 +细胞低,noncytotoxic三氧化二砷的浓度,其次是分析集落形成活动没有砷化合物。骨髓标本来自慢性粒细胞白血病患者达到完全细胞遗传学缓解。CD34 +细胞被magnetic-activated孤立的细胞分类。我们发现三氧化二砷增强红细胞集落形成活动,这是伴随着减少granulomonocytic分化功能。此外,在erythroleukemic K562细胞,我们表明,三氧化二砷抑制红细胞成熟,表明砷可能对红细胞生成两相的影响。总之,我们的数据提供了第一个证据显示,三氧化二砷可以提高红细胞的主要人类造血祖细胞分化。

1。介绍

无机砷,主要是三氧化二砷的形式(ATO),已经被证明是有效的治疗某些血液恶性肿瘤(1,2]。ATO的药理作用主要是通过调制的转译后的修改和蛋白酶体降解的关键蛋白质参与这些疾病的发病机理(1,2]。此外,诱导白血病细胞分化与凋亡可能也有一个重要的角色在ATO的治疗作用[3]。另一方面,也是一个重大的环境毒素,砷和砷暴露在人类可能促炎和致癌效应在多个器官,包括造血系统(4]。以前的在体外人类造血祖细胞的研究表明,砷可能抑制红细胞分化(5,6]。然而,这些影响都是在整个过程中砷的存在的区别归纳。ATO以来人类造血细胞(细胞抑制剂和细胞毒性的行为5,6),这些影响可能影响后续分化试验的结果。

干扰的消除可能影响细胞增殖分化的读出功能,我们采用了一种新颖的协议由初加工人类骨髓(BM) CD34 +细胞与低,noncytotoxic ATO的浓度,其次是分析ATO的集落形成活动没有。有趣的是,我们发现了一个意想不到的ATO的启动效应增强红细胞集落形成的活动,这是伴随着减少granulomonocytic分化功能。

2。方法

2.1。BM细胞的收集和净化

本研究人类齐鲁医院伦理委员会批准。书面同意书之前从所有参与者获得样本收集。BM标本来自慢性骨髓性白血病患者在常规后续测试。所有病人都接受伊马替尼治疗,取得了完全细胞遗传学缓解。盈余BM样本没有临床试验和总单核细胞后被使用Ficoll-Paque梯度密度离心分离。细胞悬浮在低温贮藏RPMI 1640年媒体含65%,25%的正常人血清,10% DMSO,暂时储存在液氮中。CD34 +细胞纯化、细胞不同患者解冻和汇集在一起,以确保足够的细胞数量的实验。CD34 +细胞被magnetic-activated纯化细胞排序使用人类CD34 MicroBead工具包(Miltenyi)。这个过程也消除了大部分的死细胞。这种方法已广泛应用于先前的研究净化人类CD34 +祖细胞(7- - - - - -9]。孤立的细胞CD34表达的纯度> 90%,由流式细胞术。结果CD34 +细胞制备还研究了用荧光原位杂交(使用从Cytocell工具包,剑桥,英国),和Ph值+细胞不能被探测到。

2.2。细胞培养、治疗和集落形成单位(CFU)测定

CD34 +细胞无血清培养系统在StemPro-34系统(技术)补充谷氨酰胺和2毫米,100μM 2-mercaptoethanol,没有或存在以下细胞因子(浓度在ng / mL): flt3配体100年,100年干细胞因子,interleukin-3 20日和粒细胞集落刺激因子20(所有从生活技术),如前所述[10),建议在制造商的协议。ATO(礼物陈朱博士的实验室,上海血液学研究所)是溶解在PBS和添加到7天的文化。CFU测定,细胞被冲洗掉ATO和集落形成细胞被发现使用MethoCult系统从干细胞的技术(# H4434)根据制造商的指示。这种方法已经被其他组验证研究人类造血祖细胞分化[11,12]。殖民地被数16天。Erythroleukemic K562细胞培养RPMI 1640中补充10%胎牛血清。

2.3。流式细胞术分析

细胞生存能力评估检测坏死和凋亡细胞内人口与流式细胞术(FACSCalibur系统(美国BD生物科学,山景,CA)),使用一个膜联蛋白V-FITC凋亡检测工具(BD # 556547),可以区分坏死,凋亡早期和晚期凋亡细胞。细胞表面的表达血型糖蛋白和CD41a也用流式细胞仪使用FITC-conjugated单克隆反CD41a (BD # 557296)和反人类血型糖蛋白(研发# FAB12281P)抗体。

2.4。实时定量PCR (qPCR)

表达人类的α、β和γ血红蛋白基因(HBA、HBB HBG)在K562细胞被qPCR测量使用SYBR绿色方法(SsoFast EvaGreen Supermix Bio-Rad、大力神、钙、美国)如前所述[13]。引物序列来自先前的报道(14,15]。

2.5。免疫印迹

使用单克隆免疫印迹进行所述反hemoglobin-zeta抗体(研发# MAB7708) (13]。

2.6。数据分析

数据表示为±SEM。未配对的双面以及用于统计分析。一个< 0.05被认为是具有统计学意义的价值。

3所示。结果

我们第一次祖细胞的培养条件进行了优化。我们发现,消除StemPro-34补充细胞因子的报道中呈现细胞nonproliferating虽然保持了良好可行性(图1(一))。这种文化条件下,我们接下来筛选ATO的不同浓度对CD34 + BM的影响细胞的生存能力。后7天治疗期间,ATO为0.5μ显示没有影响细胞凋亡或坏死,而ATO在2和5μ米的比例增加细胞的坏死和凋亡晚期状态3-4-fold(图1 (b))。阐明ATO分化的祖细胞的影响,我们用ATO 0.5细胞进行预处理μ米7天,然后执行CFU试验在ATO的缺失。我们发现有一个显著增加红细胞殖民地在ATO-pretreated细胞的比例,而祖细胞的总CFU活动没有改变(见表1)。粒细胞/巨噬细胞殖民地的比例减少形成鲜明对比。测试ATO在同一浓度的影响红细胞的成熟,我们对K562细胞5天与qPCR测量血红蛋白的表达水平。然而,我们发现,ATO显著降低HBA的表达水平,HBB, HBG(图2(一个))。利用免疫印迹,我们还显示,ATO显著降低血红蛋白的表达水平(图2 (b))。此外,我们发现ATO显著降低血型糖蛋白的表达水平(红细胞)的标志在K562细胞,但没有影响的水平CD41a(巨核细胞的标志(图)2 (c))。

4所示。讨论

本研究的主要发现是,ATO noncytotoxic浓度,质数人类造血祖细胞红细胞分化,这是伴随着减少granulomonocytic分化(总结在图3)。这种现象并没有被其他的研究报道。砷摄入量被发现导致巨成红细胞性贫血(16,17]。然而,它也观察到,砷中毒增加人类BM多孔性和红细胞增生(17]。目前尚不清楚红细胞增生是否直接影响砷的造血干细胞或补偿性响应后贫血。我们的数据可能会提供一个解释这些结果,表明砷可以直接调节人类造血祖细胞的分化。

氧化应激增加被认为是一个关键的角色在介导砷的生物和毒理学效应(18]。值得注意的是,一些研究已经表明,活性氧的增加可能减少具备干细胞造血干细胞(19,20.),促进血统的承诺(21]。在最近的一项研究,表明细胞内活性氧可能参与促进红细胞谱系分化的人类脐带血CD34 +细胞轻度高热应力条件下(22]。根据这些结果,我们建议观察到红细胞扩张引起的ATO可能由redox-dependent机制,增强红细胞谱系分化。支持这一概念,一个最近的研究表明,二硫化砷可能引发红细胞分化在髓系白血病细胞系(23]。

尽管ATO提升人类红细胞殖民地的扩张主要BM细胞,我们表明,在K562细胞,ATO血红蛋白基因的表达减少和降低红细胞血型糖蛋白标志a的水平这一发现是一致的,以前的研究报告(5),这表明ATO抑制红细胞的成熟。综上所述,我们的数据表明,对红细胞生成ATO可能有两相的影响。另一方面,它已经表明,ATO的表达增加了人类的巨核细胞标记CD41a erythroleukemic细胞系赫尔(5]。然而,在我们的实验条件下,我们没有发现任何影响的ATO CD41a K562细胞中表达。这种差异可能表明这些细胞ATO的响应是不同的。

人类白血病疾病被认为是克隆病态发起的多能造血干细胞或早期多能祖细胞(24],封锁分化细胞白血病细胞处于不同阶段的成熟是白血病的特征(25]。分化疗法是一种有效的治疗策略等某些类型的白血病急性早幼粒细胞白血病(25,26]。的确,对三氧化二砷急性早幼粒细胞白血病也敏感,而砷的有益作用的机制仍未完全理解(26,27]。我们的结果提高的可能性,arsenic-induced分化也可以探索新颖的组合治疗策略。一个突出的问题是砷也会影响白血病干细胞或祖细胞的分化,重要的是是否arsenic-induced分化改变的敏感性白血病干细胞/祖细胞与其他化疗药物。

5。结论

总之,我们的数据提供了第一个证据表明ATO可能'人类造血祖细胞,用于增强红细胞分化。的生理或病理生理意义ATO-induced调节造血分化,然而,仍有待阐明。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究部分由中国国家重点基础研究项目(2010 cb529202)和新世纪优秀人才计划在大学(ncet - 10 - 0555)。作者感谢Drs。分钟刘和Jianzhi太阳(血液学、齐鲁医院)协助处理临床标本。

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