血清总抗氧化能力决定使用高锰酸钾琼脂方法基于血清琼脂扩散

文摘

目标。开发一种新方法测定血清中总抗氧化剂和评估的总抗氧化能力的生物。设计和方法。硫代硫酸钠(Na₂年代₂O₃)和血清被用来评估高锰酸钾琼脂的线性度和精度的方法。血清样本中扩散的面积30重症监护病房(ICU)患者和44名健康受试者相比被高锰酸钾琼脂法确定。结果。线性(线性试验的Na₂年代₂O₃是0.994;血清为0.987)和线性实验的精度(变异系数的高血清水平扩散within-run, between-run,和天小面积的变异系数低血清扩散within-run between-run,和天都少于10%)使用高锰酸钾琼脂法是可以接受的。之间的血清总抗氧化剂ICU组和健康组是不同的(正反)。结论。血清中总抗氧化剂高锰酸钾琼脂法可以确定。总抗氧化能力的有机体可以评估血清中总抗氧化剂的量。

1。介绍

生物自由基是正常的新陈代谢的产物,包括活性氧(ROS)和活性氮物种(RNS)和活性氧的主要生物自由基的95%以上。在正常情况下,生产和清除自由基平衡时发挥重要作用在生物系统1,2]。一旦这种平衡被扰乱,自由基会损害细胞,组织和器官,引起癌症(3[],心脏疾病4),脑部疾病(5),老化(6),等等。在循环系统中,人血清白蛋白(HSA)的浓度在等离子体~ g / L。HSA构成血浆蛋白总量的60%,是重要的维持生物体内源性抗氧化功能(7]。许多分析用于确定血清总抗氧化能力(TAC),但这些方法都有一定的局限性。总激进捕获抗氧化参数(陷阱)8,9试验和氧自由基吸收能力(ORAC) [10,11]分析是基于氢原子转移(帽子)反应;然而,特殊的设备是必要的和反应是复杂的。trolox等效抗氧化能力(问题)12- - - - - -15)测定2 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) [16,17)测定铁降低抗氧化能力(收紧)[18,19分析,铜离子降低抗氧化能力(CUPRAC) [20.,21分析是基于电子转移(ET)的反应。然而,问题分析结果准确性差、可能会影响到吸光度的时间选择阅读。然而,DPPH方法使用甲醇作为溶剂,但甲醇会破坏秩序的实际抗氧化活性。收紧化验需要醋酸缓冲,在pH值为3.6。含巯基的化合物(SH)样本干扰结果和任何与合适的化合物氧化还原电势也会开车-TPTZ减少。CUPRAC分析可以检测血清中抗氧化剂,如铜的标准电极电位^{2 +}/铜⁺很低。此外,缓冲区添加到反应系统也会干扰的结果。因此,在这项研究中,高锰酸钾(KMnO₄)是用作氧化剂来确定TAC在血清22),目的是提供一种方法具有良好的线性度和精度检测血清中总抗氧化剂和简化实验程序。

氧化还原滴定法可以检测无机或有机化合物的数量以直接或间接的方式。KMnO₄是一个理想的氧化剂;它具有较强的氧化能力和一些nonredox反应;的标准电极电位/ MnO₂高达1.695 V。锰^{7 +}完全可以减少Mn吗^{2 +}只有在强酸性的环境中。因为研究表明,pH值可以干扰(氧化还原反应的结果23),氧化还原反应应该设置在一个中立的环境接近生理pH值7.35 - -7.45。然而,在中性环境中,一个丰富的MnO棕色沉淀₂高锰酸钾滴定法,生成沉淀MnO呢₂干扰终点的判断。因此,高锰酸钾琼脂方法是一种更好的方法来确定血清的TAC。高锰酸钾琼脂法是基于高锰酸钾氧化还原滴定法,但需要更少的试剂和样品比高锰酸钾氧化还原滴定方法。血清在高锰酸钾琼脂扩散和氧化还原反应区域的颜色变化由于Mn的减少^{7 +}。一个棕色的圆出现24小时后在氧化还原反应区域,而nonredox反应区域变成了红色。血清中总抗氧化剂的数量可以由测量血清扩散的面积和生物的氧化还原状态可以评估血清中总抗氧化剂的量。

2。方法

2.1。血清标本

血清标本收集从第一医院隶属于大连医科大学第二医院隶属于大连医科大学。三十重症监护病房(ICU)患者作为实验组,包括20个男性和10个女性,平均年龄的年。44个健康受试者被视为健康组和包括31名男性和13名女性,平均年龄的年。实验组的诊断包括胃肿瘤,大脑肿瘤,食物中毒等等。血清标本存放在−20°C后收集和实验前应在室温下解冻。这项研究是大连医科大学的伦理委员会批准。

2.2。方法

1.5 g琼脂在100毫升蒸馏水溶解,加热3分钟在100°C。当琼脂溶液的温度冷却到55°C, 15毫升0.003 mol / L KMnO₄是用70毫升琼脂溶液混合。7毫升高锰酸钾琼脂溶液添加到菜。盘的直径7厘米;因此,高锰酸钾琼脂的厚度是0.18厘米。高锰酸钾琼脂凝固时,光圈成立于高锰酸钾琼脂的中心;琼脂孔径是6毫米。30μL血清添加到孔径和6毫升液体石蜡覆盖在高锰酸钾琼脂表面。高锰酸钾琼脂存储在黑暗在4°C 24 h。棕色的圆的直径测量,血清扩散的面积计算(包括孔径的直径)使用以下公式:,在那里血清扩散和的面积来表示棕色的圆的直径来表示。

2.3。线性试验

0.01 mol / L标准的还原剂,Na₂年代₂O₃,混合血清稀释100%,80%,60%,40%,和20%浓度。一个平行样品准备每个浓度。棕色的圆的直径测量的面积和Na₂年代₂O₃扩散以及血清扩散计算。

2.4。精密的实验

指文档精确定量测量方法的性能评价,批准guideline-second版(EP5-A2) [24),从5健康人血清池我们稀释混合血清的浓度为100%(被视为高水平)和50%(被视为低水平),添加高锰酸钾琼脂,棕色的圆的直径,计算血清扩散的面积,并包含一个平行样品为每个运行,每天2分20天。两个运行之间的时间间隔超过2小时。

2.5。方法比较

血清样本稀释用水的100%,80%,60%,40%,和20%浓度。30μL在每个稀释血清水平添加高锰酸钾琼脂。每个稀释级的棕色的圆的直径测量的面积和血清扩散计算。上述5稀释血清水平测量使用我们的描述方法和之前报道的碘氧化还原滴定法(22]。领域的血清在高锰酸钾琼脂扩散和光学密度(OD)碘氧化还原滴定法进行了比较。

2.6。样品测试

健康受试者的血清样本和ICU患者加入高锰酸钾琼脂和棕色的圆的直径测量的面积和血清扩散计算。

2.7。统计分析

统计软件SPSS 13.0是用来评估结果。非参数检验是用来比较的结果。的值(正反)被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。扩散的血清

血清中抗氧化剂之间的氧化还原反应发生和氧化剂KMnO₄。高锰酸钾琼脂,血清扩散孔中心的各方。高锰酸钾琼脂的颜色从紫色变成棕色在KMnO下降后₄。氧化还原反应区域变成了棕色,nonredox反应区域变成了红色,和两个区域之间的边界是明确的。图1表明血清扩散的结果。

3.2。线性试验

高锰酸钾琼脂法的准确性由两个线性评估实验。五钠的浓度₂年代₂O₃在高锰酸钾琼脂扩散是用于验证高锰酸钾琼脂法的准确性。5混合血清的浓度扩散在高锰酸钾琼脂用于验证的准确性高锰酸钾琼脂法矩阵的物质。棕色的圆的直径测量的面积和Na₂年代₂O₃分别计算扩散和血清扩散。在SPSS 13.0中,钠的浓度₂年代₂O₃被设置为设在和反应的面积区域被设置为设在。Na的面积之间的线性关系₂年代₂O₃扩散和钠的浓度₂年代₂O₃观察(图2)。设置为混合血清的浓度设在和反应的面积区域被设置为设在。之间的线性关系混合血清的面积扩散和混合血清的浓度观察(图3)。线性试验的Na₂年代₂O₃,方程的系数为0.994,斜率为0.02,和截距为0.188。在线性实验中血清,方程的系数为0.987,斜率为0.009,和截距为0.888。

3.3。精密的实验

高水平和低水平的面积在0.003 mol / L KMnO血清扩散₄测定了20天。重复性(),between-run精度(),在精度(),平均面积()的血清扩散测定EP5-A2文档的指导。变异系数(CV),,,计算(表1)。最大的高水平和低水平的简历是6.3%和5.1%,分别。

3.4。方法比较

在SPSS 13.0中,血清在高锰酸钾琼脂扩散的面积被设置为设在OD的碘氧化还原滴定法被设置为设在。这两种方法之间有良好的线性。方程的系数为0.994,边坡−4.034,截距为13.273(图4)。

3.5。结果ICU小组

两组扩散结果所示(表2)。ICU组血清的最大区域扩散是2.27厘米²中位数(50百分位数)是2.01厘米²,最低是0.64厘米²。健康组血清的最大区域扩散是2.27厘米²中位数(50百分位)是1.77厘米²,最低是1.65厘米²。结果两组相比时,(正反)。

4所示。讨论

血清中抗氧化剂之间的氧化还原反应和氧化剂KMnO₄发生在这个实验。血清扩散的中心孔中各方高锰酸钾琼脂。Mn的颜色^{7 +}紫色和沉淀MnO吗₂是棕色的。高锰酸钾琼脂的颜色从紫色变成棕色KMnO下降₄,越来越MnO₂。氧化还原反应区是棕色和nonredox反应区是红色的;两个区域之间的边界是明确的。布朗面积越大代表了血清中被发现含有更多的抗氧化剂。不同数量的血清中抗氧化剂可以反映TAC的生物。通过测量棕色的圆的直径和计算血清扩散的面积,可以确定血清中抗氧化剂的量和推断的抗氧化状态的器官。

线性实验观察表明,线性好。线性试验的Na的面积₂年代₂O₃扩散和Na₂年代₂O₃浓度,方程的系数为0.994,斜率为0.02,和截距为0.188。在线性混合血清的面积扩散实验和血清稀释,方程的系数为0.987,斜率为0.009,和截距为0.888。高锰酸钾琼脂是可以接受的线性和高锰酸钾琼脂有很好的准确性,即使在血清基质物质。在精度实验中,高水平的简历within-run为2.9%,between-run是6.3%,和天是0(设置between-run标准差的估计0如果负根据EP5-A2文档),而低水平的简历within-run为3.0%,between-run是5.1%,天是0(设置between-run标准差的估计0如果负根据EP5-A2文档)。所有CV值低于10%,高锰酸钾琼脂的精度是可以接受的。扩散区域依赖于大量的抗氧化剂;少数量的抗氧化剂在样本结果在一个小扩散区。在图2,当钠₂年代₂O₃解决方案(0.01 mol / L)不到20%的原来的浓度稀释,很难测量扩散面积和结果的简历将更大。同样的,当血清稀释至20%,抗氧化剂也被稀释。微量的抗氧化剂产生小扩散区域,这是很难衡量。来验证我们的方法,同样的5个浓度水平的血清样本进行了描述高锰酸钾琼脂法与之前报道的碘氧化还原滴定法(图4)。好的线性在OD值碘氧化还原滴定法和扩散区域从我们的方法。良好的精度,精度和可靠性的描述方法。

在这里,我们的方法是应用于区分从ICU患者和健康者血清标本。当血清中扩散的区域使用非参数检验两组比较,(正反)小于0.05,表明高锰酸钾法用于测定血清中总抗氧化剂。健康组的血清扩散的最小面积大于在ICU小组,和类似的结果观察血清平均面积的扩散。更多的抗氧化剂在健康受试者的血清检测表明TAC健康受试者可能更好。

分析表明,高锰酸钾琼脂法可以比高锰酸钾滴定法,尽可能少的降水MnO₂生成使用这种方法来判断终点。由于减少试剂和样品的使用高锰酸钾琼脂法,可以大规模应用该方法在诊所。此外,高锰酸钾琼脂方法可以排除外部的干涉₂由于覆盖液体石蜡表面的琼脂。的标准电极电位/ MnO₂是1.695 V,远高于0.77 V铁吗^{3 +}/铁^{2 +}并为铜0.16 V^{2 +}/铜⁺比收紧,可以检测更多的抗氧化剂,特别是CUPRAC化验。高锰酸钾的氧化还原反应琼脂法发生在中性环境而不是酸性环境,可以更好地反映TAC比收紧在生物分析的状态。在高锰酸钾琼脂法,只有KMnO₄作为试剂,比CUPRAC试验获得的结果更可靠。CUPRAC化验的结果可以很容易地受到缓冲区添加到系统中。比较陷阱的高锰酸钾琼脂法测定和氧自由基吸收试验,本研究的过程相对简单,不需要特殊的设备,测量血清扩散反射的面积总血清中抗氧化剂的量。问题分析和DPPH实验相比,高锰酸钾琼脂法最好线性度和精度,表明这是一个很好的替代这两个化验。

5。结论

高锰酸钾琼脂法有很好的线性度和精度。血清扩散的区域显示抗氧化剂的浓度,进一步表明血清TAC。高锰酸钾琼脂法,ICU患者和健康者可以区分基于血清扩散。高锰酸钾琼脂法是一种新技术调查TAC的疾病和衰老,应该用于确定血清抗氧化剂在诊所。

利益冲突

没有利益冲突有关的出版。

引用

1. r·a·弗洛伊德r . a、t .他k .汉斯莱和k . r .枫树,”转译研究涉及氧化应激和老化、疾病”自由基生物学和医学,51卷,不。5,931 - 941年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. h .之一,和t·芬克尔”解开抗氧化剂的真相:ROS和疾病:找到正确的平衡,”自然医学,20卷,不。7,711 - 713年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. m . Valko m . Izakovic m . Mazur c·j·罗兹和j .上“氧自由基的作用在DNA损伤和癌症发病率,”分子和细胞生物化学,卷266,不。1 - 2,37-56,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. 徐p . y .张x, x c·李,“心血管疾病:氧化损伤和抗氧化保护,”欧洲医学和药理科学审查,18卷,不。20日,第3096 - 3091页,2014年。视图:谷歌学术搜索
5. a . Popa-Wagner s Mitran s Sivanesan e . Chang, a m。Buga”, ROS和脑部疾病:好的,坏的,丑陋的,”氧化医学和细胞寿命ID 963520条,卷。2013年,14页,2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. j . Labat-Robert l·罗伯特,“长寿和衰老。自由基和黄嘌呤氧化酶的作用。审查。”Pathologie生物,卷62,不。2、61 - 66年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. m .酒馆A.-L。玛丽,j。米拉,b . Guidet”特定的人类血清白蛋白的抗氧化性能,”年报的重症监护,3卷,不。1,第四条,2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. d·d·m·韦恩·g·w·伯顿,k英格尔德,和美国洛克,”总数的定量测定,过氧化氢radical-trapping抗氧化能力的人类血浆过氧化反应控制。由血浆蛋白的重要贡献。”2月的信,卷187,不。1,33-37,1985页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. e . Lissi m . Salim-Hanna c·帕斯卡,m . d . del Castillo”总抗氧化潜力的评价(陷阱)和总抗氧化活性luminol-enhanced化学发光测量,”自由基生物学和医学,18卷,不。2、153 - 158年,1995页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. g .曹h . m .塞,r·g·卡特勒“氧自由基吸收能力测定抗氧化剂,自由基生物学和医学,14卷,不。3、303 - 311年,1993页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. g .曹c·p·Verdon a·h·b·吴h . Wang和r . l .之前,“自动测定的氧自由基吸收能力COBAS法拉二世”临床化学41卷,第1部分,不。12日,第1744 - 1738页,1995年。视图:谷歌学术搜索
12. n·j·米勒,c . Rice-Evans m·j·戴维斯诉Gopinathan和米尔纳,”一个新颖的方法测量抗氧化能力及其应用在早产新生儿监测抗氧化状态,”临床科学,卷84,不。4、407 - 412年,1993页。视图:谷歌学术搜索
13. x田和k . m . Schaich”效应的分子结构动力学和动力学与abt Trolox等效抗氧化能力的测定^+•”,农业与食品化学杂志》上,卷61,不。23日,第5519 - 5511页,2013年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. r .再保险:佩莱格里尼,a . Proteggente a . Pannala m·杨和c . Rice-Evans“抗氧化活性应用一种改进的abt激进的阳离子脱色试验,”自由基生物学和医学,26卷,不。9 - 10,1231 - 1237年,1999页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. r . van Den Berg g·r·m·m·Haenen h . van Den Berg和a .韧皮”的适用性改进Trolox等效抗氧化能力(问题)测定混合物的抗氧化能力评价测量”食品化学,卷66,不。4、511 - 517年,1999页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. g . Litwinienko和k·英格尔德”,对氢原子抽象异常溶剂的影响。1。酚类化合物的反应与2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (dpph^∗在醇类),”《有机化学》杂志上,卷68,不。9日,第3438 - 3433页,2003年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. r . Amorati s Menichetti e . Mileo g . f . Pedulli和c . Viglianisi“氢原子转移反应ortho-alkoxy-substituted酚类:实验方法,”化学的,15卷,不。17日,第4410 - 4402页,2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. i f·f·Benzie j。j应变,“铁减少等离子体(收紧)作为衡量能力的抗氧化能力”:收紧分析,“分析生物化学,卷239,不。1,第76 - 70页,1996。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. i . f . f . Benzie j。j应变,“铁减少/抗氧化能力测定:直接测量的总抗氧化活性的生物体液和修改版本同步测量的总抗氧化能力和抗坏血酸浓度,”方法酶学卷,299年,第2章,页15 -,爱思唯尔,1999年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. r . Apak k Guclu m . Ozyurek, s . E . Karademir”小说总抗氧化能力指数膳食多酚和维生素C和E,用铜离子还原能力的存在neocuproine: CUPRAC方法,”农业与食品化学杂志》上,52卷,不。26日,第7981 - 7970页,2004年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. r . Apak k Guclu m . Ozyurek b . Bektaşoğlu和m .本“铜离子减少抗氧化剂的抗氧化能力测定人体血清和氢氧自由基食腐动物,”分子生物学方法卷,594年,第239 - 215页,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. m, n . Liu和h·刘,“总质量的测定血清中抗氧化物质和抗氧化能力每单位质量使用氧化还原滴定法,“生物无机化学与应用928595卷,2014篇文章ID, 5页,2014。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. l . m . Magalhaes m a, s .里斯和j·l·f·c·利马”方法对体外抗氧化性能评价方面,“分析Chimica学报,卷613,不。1 - 2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. 评价精度性能的定量测量方法;批准的指导方针NCCLS,第二版,2004年版。

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