文摘

GbIspH1, IspH 1型银杏叶叶绿体,Fe / S酶催化还原脱羟基的HMBPP isopentenyl二磷酸(IPP)和dimethylallyl二磷酸(DMAPP)磷酸methylerythritol途径在叶绿体的最后一步。细菌IspH相比,植物IspH,包括GbIspH1,有一个额外的多肽链N终点站。在这里,生化功能N终端GbIspH1是调查的区域N终端截断GbIspH1 (GbIspH1-truncated)。野生型GbIspH1 (GbIspH1-full)和GbIspH1-truncated催化地活跃了IPP DMAPP 15的比例:1。动力学参数的(17.3±1.9,14.9±2.3µ米)和(369±10和347±12分钟⁻¹)pH值8.0得到GbIspH1-full GbIspH1-truncated,分别。有趣的是,GbIspH1-full和GbIspH1-truncated显示明显不同pH-dependent活动,并得到了最大的酶活性在pH值为8.0和7.5,分别。然而,催化活化能量()GbIspH1-full和GbIspH1-truncated几乎相同的36.5±1.6,35.0±1.9焦每摩尔,分别。这是建议的N终端区域GbIspH1参与pH-dependent调节酶活性在光合作用。

1。介绍

自发现甲羟戊酸-磷酸(MVA)独立methylerythritol (MEP)途径1),重要的注意被吸引到新的类异戊二烯生物合成途径由于潜在的应用在医学(2]。而MVA途径只存在于动物,亚加亚,和真菌,议员通路在大多数细菌无处不在,原生动物,和蓝细菌(3]。有趣的是,植物是利用两个途径,MVA和议员通路被发现在胞液和质体,分别。在MVA途径,甲羟戊酸产生乙酰辅酶a转化为isopentenyl二磷酸(IPP)由三个ATP-dependent酶。然而,欧洲议会议员与糖酵解代谢途径开始,丙酮酸和glyceraldehyde-3-phosphate,七个独特的酶组成的路径产生IPP和dimethylallyl二磷酸(DMAPP)(见图1)。

在欧洲议会议员通路,4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl二磷酸(HMBPP)还原酶(HDR、IspH或LytB;EC 1.17.1.2)催化最后一步的还原脱羟基HMBPP产生IPP DMAPP [4,5]。3:1 site-differentiated菲₄年代₄集群被发现在细菌的活性部位IspH的穆斯堡尔谱(6),和蛋白质x射线晶体结构(7- - - - - -9)提供底物结合位点的结构特征。目前,对IspH提出了两种不同的反应机制。两种机制涉及相同的底物反应步骤绑定,一个电子还原Fe / S的集群,从减少(Fe和电子转移₄年代₄]^{2 +}HMBPP集群。然而,桦树reduction-like机制需要形成的烯丙基的激进或阴离子中间10,11),而有机金属机制提出了烯基metallacycle中间Fe / S集群和HMBPP之间形成12]。

大多数机械的研究进行的细菌IspH [13),但没有可供植物IspH生化报告。尽管植物IspH似乎遵循相同的细菌IspH反应机理,其氨基酸序列不同于细菌IspH(参见图S1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2015/241479)。即植物IspH蛋白质有额外的100 - 130氨基酸残基N终端区域。研究反应机理植物IspH GbIspH1 (GbIspH1-full) IspH 1型银杏叶是准备。此外,生化功能N终端区域的植物IspH也与调查N终端截断GbIspH1 (GbIspH1-truncated)。

2。方法

2.1。一般信息

甲基紫罗碱(MV)亚硫酸氢钠(DT) trizma基地,N混身起红疹;痒-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic酸(),4 - (2-hydroxyethyl) 1-piperazineethanesulfonic酸(玫瑰),2 - (N吗啉代)ethanesulfonic酸(MES),二钠盐的5′- [3 - (2-pyridyl) 1、2、4-triazine-5, 6-diyl] bis-2-furansulfonic酸从奥尔德里奇(ferene)购买。对缺氧环境(O₂< 1 ppm), Schlenk线和厌氧室(M.O.Tech)配备了Pd的催化剂。酶底物,HMBPP,准备根据公布的方法(14)和核磁共振光谱仪的特征。CD谱的蛋白质在同一个缓冲溶液(5.71μ米)测量范围的190 nm - 260 nm Chirascan +(应用Photophysics)。

2.2。GbIspH1表达和纯化

GbIspH1与他(GbIspH1-full)获得重组大肠杆菌BL21 (DE3)包含pQE-31向量,请提供的首尔国立大学Soo-Un金教授,韩国。的N终端多肽(Met1-Arg61)截断GbIspH1 subcloned进BamHI / pETDuet NotI网站(Novagen)。His6-tag位于N终端的蛋白质,和GbIspH1-full和GbIspH1-truncated使用他亲和柱层析法纯化。两种蛋白质的氨基酸序列是可以在补充材料。细胞生长包含50磅媒体μ氨苄青霉素g /毫升、1.0毫米FeCl₃和1.0毫米(NH₄)₂所以₄直到OD_600年达到0.6在37°C。细胞培养与1.0毫米isopropyl-1-thio -β-D-galactopyranoside (IPTG) 30°C 13小时表达的蛋白质。细胞被离心收获(3000克,15分钟)在4°C和存储在使用前−70°C。冷冻细胞(通常10 g)在室温下解冻在氮气氛和稀释10倍体积的厌氧裂解缓冲(磷酸50 mM, pH值8.0,和150毫米氯化钠)在冰上。细胞溶解产物从声波降解法(10 20秒的周期破裂1分钟的休息)在氩气氛。离心后的上层清液收集在11000 g 20分钟在4°C。上层清液加载在一个Ni-NTA亲和柱层析法(4毫升树脂)在厌氧室。树脂是preequilibrated磷酸盐缓冲剂(50 mM磷酸盐、pH值8.0和150毫米氯化钠)。列是用磷酸缓冲包含20毫米咪唑并筛选了包含200毫米咪唑磷酸盐缓冲剂。分数有棕色被Amicon汇集然后脱盐超离心过滤器(30 kDa)在4000 g和三羟甲基氨基甲烷/盐酸缓冲液的缓冲交换(50毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸,液pH值8.0,和100毫米氯化钠)。紫外可见光谱得到的蛋白质从Scinco s - 3150紫外可见分光光度计。 Protein concentration was determined by Bradford assay [15]。的铁内容净化GbIspH1蛋白质测定吸收铁的532海里^{2 +}-ferene(5的二钠盐、5′- [3 - (2-pyridyl) 1、2、4-triazine-5, 6-diyl] bis-2-furansulfonic酸)复杂(16]。

2.3。酶动力学GbIspH1

酶动力学研究GbIspH1-full和GbIspH1-truncated在严格的厌氧条件下进行。反应混合物(0.4毫米2.0毫米MV, DT, 50 mM玫瑰,和pH值8.0)包含HMBPP、200 nM GbIspH1是添加到启动反应。酶反应混合物的总量是450μL和HMBPP不一的浓度在0到250之间μM substrate-dependent动力学。减少HMBPP被减少MV的消失(监控= 3150⁻¹厘米⁻¹通过紫外可见分光光度计在732海里。σ情节软件被用来获得动力学参数的初始反应速率。

在pH-dependent动力学研究中,GbIspH1(200海里)添加到three-buffer反应混合物(250μMV M HMBPP, 2.0毫米,0.4毫米DT,混身起红疹;痒50 mM, 50毫米玫瑰,50 mM MES)调整后博士与温度有关的动力学与250年进行μ米的HMBPP 0-50°C。GbIspH1(200海里)添加到反应混合物进行反应时所需的反应温度是维护。

2.4。反应产品标识

分离反应产物、酶反应进行了GbIspH1 (1μ米),HMBPP(5.3毫米),MV(5.0毫米),并在300年DT(7.5毫米)μL 50 mM的消息灵通的缓冲区(pH值8.0)在室温下对3 h在厌氧气氛。反应后,氧化铈(0.75 g)在300年μ0.2 L N氨溶液添加到酶反应混合物(17]。的解决方案是反应1 h与轻微的搅拌,在40°C和脱去磷酸产品与乙酸乙酯提取(200μL×3)。对于GC / MS分析,安捷伦7890 a (GC)配备DB-5MS (19091 s - 433)列(30米、0.25毫米和0.25μm)与安捷伦5975 c (MSD)检测器。样本(1μL)被注入到注射器(250°C)模式在离了。烤箱温度保持在40°C前5分钟增加到450°C (10°C /分钟)。与积极的电离质谱得到模式的电子电离(70 eV)。

2.5。序列分析和蛋白质结构预测

IspH蛋白质的氨基酸序列对齐使用MultAlin计划(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html)。分子量、摩尔消光系数GbIspH1-full和GbIspH1-truncated计算蛋白质成为计算器v3.3计划(http://www.scripps.edu/ ~ cdputnam / protcalc.html)。蛋白质三维结构预测GbIspH1-full通过I-TASSER (http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER)服务器。

3所示。结果与讨论

Fe / S蛋白参与许多重要的生物过程,如光合作用、能量代谢。除了电子转移,Fe / S许多独特的固氮反应,酶催化制氢,CO氧化等等。即使是简单的立方形的[4铁₄S]集群作为代数余子式的激进和减少IspH山姆反应。

而广泛的生化特征的细菌IspH已经报道,没有植物IspH酶动力学是可用的。在这里,我们首次报道GbIspH1的催化特性。金等。18)建议额外的N终端肽区域包含10-40 residue-long转运肽可能促进IspH到叶绿体的易位。然而,其他的生化功能N终端多肽地区之间的运输肽和催化领域还不清楚。本研究的目的是研究植物IspH和细菌之间的区别IspH蛋白质和调查可能的额外功能N终端GbIspH1多肽的地区。的N终端截断GbIspH1用于这项研究是通过删除61个氨基酸的准备的NGbIspH1的终点站。

3.1。GbIspH1纯化和表征

GbIspH1 GbIspH1-full蛋白质和GbIspH1-truncated被Ni-NTA亲和柱层析法纯化,蛋白的纯度是经sds - page(图S2a)。GbIspH1-full和GbIspH1-truncated估计的表观分子量乐队的位置分别为56.6和49.3 kDa,接近理论值的56.0和49.7 kDa,分别。纯化GbIspH1-full紫外可见光谱和GbIspH1-truncated是在厌氧条件下,获得和吸收在410海里,铁、特点₄年代₄集群的观察(图开通)。的(菲比₄年代₄]^{2 +}包含蛋白质,用紫外可见分光光度计,被用来评估holoprotein在提纯金属蛋白的比例。的GbIspH1-full比率和GbIspH1-truncated测量是0.18和0.17,分别和两个蛋白铁的不需要调整₄年代₄集群。铁含量GbIspH1-full和GbIspH1-truncated也取决于使用ferene比色法,和和Fe /蛋白质测定GbIspH1-full GbIspH1-truncated,分别。铁的结合₄年代₄集群在蛋白质纯化GbIspH1终于证实了EPR谱。甲基紫罗碱- (MV)减少了WFT显示菱形信号在20 K特征的减少(Fe₄年代₄]⁺集群(图S3)。CD光谱获得从GbIspH1-full GbIspH1-truncated非常相似,表明两种蛋白质折叠类似(图S2c)。CD光谱也从AaIspH类似报道19从植物和细菌),这表明IspH蛋白质的二级结构是相似的成分。

GbIspH1-full和GbIspH1-truncated蛋白质的纯化是在无氧的条件下进行的,和Fe / S的识别集群需要几种不同的生物物理特征。孤立的蛋白质表现出淡棕色颜色和(铁的存在₄年代₄]^{2 +}集群是电子光谱。蛋白质定量和有限元分析,结合的铁₄年代₄)集群GbIspH1-full和GbIspH1-truncated证实。电子顺磁共振光谱的研究作为孤立和亚硫酸氢- (DT)减少蛋白质(Fe的支持₄年代₄)集群GbIspH1穿梭+ 2,+ 1氧化还原状态。

3.2。酶动力学GbIspH1

测定酶活性的纯化IspH,电子从电子供体是必需的,因为IspH催化还原脱羟基HMBPP。几在体外电子给体,包括生物NADPH / flavodoxin还原酶/ flavodoxin和非生物的DT / MV减少系统,利用了IspH的稳态动力学(11]。在这项研究中,DT-reduced MV作为电子供体,substrate-dependent GbIspH1-full的反应速率和GbIspH1-truncated被分光光度法测量HMBPP的存在。详细,单电子减少MV展览两个强大的电子吸收732海里(= 3150⁻¹厘米⁻¹)和604 nm (= 18750⁻¹厘米⁻¹),两个分子的减少MV被IspH消耗产物的生成。电子转移和减少HMBPP紧密耦合IspH催化,氧化的MV监控减少了相关的电子吸收减少IspH活动(20.]。

GbIspH1-full Substrate-dependent初始速度曲线和GbIspH1-truncated显示典型Michealis-Menten动力学(图S4),和两GbIspH1酶催化活动与其他报道IspH蛋白质(表1)。例如,IspH大肠杆菌用同样的减少系统显示604分钟⁻¹和19.7μ米(21]。GbIspH1-full和GbIspH1-truncated之间类似的动力学参数(与最小值⁻¹),(与μ分别得到了M)。虽然它不是明显不同,GbIspH1-full似乎表现得更好和更高的。在GbIspH1的预测蛋白质的三维结构,N终端肽底物结合位点(图附近2)。相对较低价值来自GbIspH1-truncated可能是由于额外的缺失N怎么可能定位终端肽链上的底物结合位点。

活动概要GbIspH1-full和GbIspH1-truncated pH值的范围-10 - 5.5显示两个GbIspH1蛋白质表现出最大的活动在不同的pH值。而GbIspH1-full显示最大酶活性在pH值为8.0,GbIspH1-truncated显示最高的活动在pH值为7.5。Altincicek et al。22)报道,IspH的最大活动Aquifex aeolicus被发现在pH值7.0 - -7.5的范围。当pH值范围的最大活动相比,50%以上的范围GbIspH1-truncated (pH值5.6 - -9.3)是更广泛的比GbIspH1-full (pH值6.6 - -9.1)(图3)。酸性pH值区域显示50%最大活动特别是GbIspH1-full转移由pH值1.0单位。因此,提出了额外的N终端区域GbIspH1-full pH值依赖的酶活性的影响。中的某些氨基酸残基N终端区域可能调节质子转移的步骤需要在催化,或构象变化期间陪同IspH催化可以摄动GbIspH1-truncated通过删除NGbIspH1-full终端的地区。

寻找是否有多余的N终端GbIspH1肽地区影响酶反应通路,活化能值GbIspH1-full和GbIspH1-truncated决定通过测量与温度有关的酶活性在0-50°C。如图4,反应速率常数与温度有关的酶都是几乎相同的和活化能(阿仑尼乌斯方程获得的)值和焦每摩尔GbIspH1-full和GbIspH1-truncated分别。如果额外的N终端GbIspH1-full肽地区影响病原反应步骤,催化反应的活化能值由GbIspH1-full和GbIspH1-truncated预计将显著不同。然而,强烈建议额外的结果N终端区域没有改变GbIspH1催化的病原反应步骤。活化能的值从GbIspH1-full和GbIspH1-truncated获得远高于报道8.0焦每摩尔恶性疟原虫IspH [23)和可比的活化能嗜热焦每摩尔报道答:aeolicus(22]。

虽然还不知道这一步反应IspH酶反应途径是病原反应步骤中,肖et al。21)报道,IspH可以显著增加的活动通过改变电子给体。此外,电子转移步骤后的构象变化通常是发现的病原反应一步redox-active金属酶催化。例如,MoFe蛋白质的构象变化需要停靠菲电子转移后蛋白质病原分离步骤固氮酶的催化。因此,很可能反应步骤涉及分离IspH将病原生物电子供体的一步。活化能的比较的基础上,也提出N终端区域GbIspH1不积极参与电子转移步骤。

3.3。反应产品识别

在植物细胞中,MVA途径和议员途径都存在于胞质和叶绿体,分别和认为有不同的生理功能24]。也只知道MVA途径产生IPP但议员途径提供了IPP和DMAPP。不同比例的IPP / DMAPP所需的特定isoprenyl二磷酸生物合成在细胞质和叶绿体,显然需要比DMAPP IPP的合成香叶二磷酸(GPP),通过二磷酸(FPP),等等。尽管短链prenyl二磷酸,包括IPP (C5) DMAPP (C5), GPP (C10)和FPP (C15),可以运输到其他细胞细胞器在植物细胞(25),isoprenyl二磷酸异构酶(伊迪)是普遍发现从细胞细胞器包括叶绿体、线粒体和过氧物酶体。因此,保持最优的代谢通量IPP / DMAPP[细胞是至关重要的26]。这个背景信息促使我们研究生产的产品比IPP / DMAPP IspH。

有趣的是,IPP / DMAPP的比率也被认为是一个重要的特质相关的反应机理。根据拟议中的IspH-catalyzed反应机制,烯丙基的阴离子物种通常是由两个不同的IspH反应机理,要么从衬底烯丙基的激进的物种的减少7]或有机金属衬底之间复杂的形成和铁₄年代₄集群(8)(图5)。烯丙基的阴离子物种被认为是关键的中间的机制,控制产品的形成,因此决定了产品比率。质子转移从中间二磷酸组的烯丙基的阴离子一半是关键反应步骤控制IPP的产品分布和DMAPP。到目前为止,所有IspH蛋白质,包括恶性疟原虫IspH,据报道产生4.5 - -6.3:1的比例IPP / DMAPP [27]。最近,我们报道,IDI-missing植物病原细菌伯克glumae2:生产1 IPP的比例和DMAPP [28]。

IPP的识别和DMAPP由GbIspH1-full GbIspH1-truncated是通过GC / MS分析IPP的脱去磷酸产品和DMAPP(图S5),获得的产品比例是GC-FID定量(补充材料)。控制实验和混合物的标准IPP DMAPP发现采收率prenyl和isoprenyl醇1:0.92,相应实验结果修正。令人惊讶的是,反应混合物的比例IPP / DMAPP GbIspH1-full和GbIspH1-truncated都发现15:1重复性良好。因为产品比率从GbIspH1获得蛋白质显著大于其他IspH蛋白质的报告值,它提出了质子转移在GbIspH1催化烯丙基的阴离子的中间可能不同于细菌IspH系统。

4所示。结论

总之,催化地活跃GbIspH1蛋白质GbIspH1-full和GbIspH1-truncated成功纯化,在厌氧条件下的特点。孤立的GbIspH1蛋白质含有铁₄年代₄像细菌IspH集群,它显示可比其他IspH催化活性蛋白质。额外的N终端GbIspH1地区常见植物IspH蛋白质,似乎不影响病原反应步骤,因为GbIspH1-full和GbIspH1-truncated显示类似的动力学参数和活化能。然而,额外的N终端区域提出调节酶活性的pH-dependent方式,基于GbIspH1-full和GbIspH1-truncated pH-dependent活动概要。

GbIspH1-full完全GbIspH1多肽测量最大酶活性在pH值为8.0,和IspH答:aeolicus据报道显示最大酶活性在pH值7.0 - -7.5的范围(22]。菠菜IspG,有趣的是,另一个工厂议员途径酶,存在于叶绿体据报道,接受电子从光合作用的光反应29日],GbIspH1表达的增强是由光引发(18]。所有这些报道,光合作用调控很可能是在工厂运营议员途径。在光合作用的光反应,质子从叶绿体基质类囊体腔,运输和基质的pH值方法pH值8.0 [30.]。从我们pH-dependent活动研究中,它是合理的N终端多肽地区GbIspH1 pH-dependent方式可以调节酶活性在叶绿体。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是支持的框架下国际合作项目由韩国国家研究基金会(NRF - 2013 k2a1b7a01044254)和基础科学研究项目通过韩国国家研究基金会(NRF)由教育部(NRF - 2010 - 0020984)。作者还要感谢太阳庆熙Kim博士KBSI初步EPR测量。

补充材料