文摘

海洋生物膜形成由于水下表面粘附的细菌和其他微生物通常被认为是一个主要的microfouling形式。随后的附件高等生物,如藤壶幼虫,贻贝,等等,对海洋生物膜,导致macrofouling。几种方法被用来防止微和macrofouling。银纳米粒子(AgNPs)表现出强烈抑制和抗菌活性。生物合成AgNPs是成功迅速获得由于其日益增长的重要性。因此,目前的研究重点是AgNPs使用水果提取物的生物合成Aegle marmelos通过紫外可见分光光度计及其特征,x射线衍射仪(XRD)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)和原子力显微镜(AFM)。进一步分离和鉴定的海洋细菌生物膜的形成进行了通过16 s rDNA分析。的antimicrofouling影响biosynthesized AgNPs对海洋细菌生物膜形成和测试结果表明,它可以有效地抑制生物膜的形成。这个初步研究证明了AgNPs可能用作预防antimicrofouling剂生物淤积在早期阶段。

1。介绍

海洋生物淤积上遇到的一个主要问题是人为造成的海洋环境中的对象。生物淤积被定义为不受欢迎的积累微生物,植物和动物在人工表面沉浸在一个常见的矩阵(1]。建立污染社区发生在几个阶段。最初,任何水下表面被调节膜涂布有机和无机分子组成。随后出现macrofouling之前可能是细菌生物膜的形成(细菌污染)等生物膜可能产生有害影响的能力表面免受更大的污损生物。使用化学防污剂是一种常见的和简单的方法来控制污染引起的微观,macrofoulers [2]。然而,许多抗菌材料不太有效的浮游同行相比,生物膜上微生物(3]。因此,高浓度的化学防污剂所需的有效控制污染导致有害的副作用。未来研究防污策略可能目标的形成调节层来防止后续殖民的表面4]。

在最近的过去,纳米粒子获得生物学领域的重要性,医学,电子由于其独特的物理和生物特性。银早就知道有强烈的抑制和杀菌效果,以及广泛的抗菌活动,即使在低浓度(5]。因此,金属纳米粒子中,AgNPs收到关注各领域包括生物医学设备涂料(6,水净化7),和食品包装8]。此外,它被认为是一个更少的有毒和抗菌药物安全高等动物(9]。AgNPs已经检查了他们的能力来减少微生物感染的皮肤(10和烧伤的伤口11)并防止细菌殖民化导管等各种表面设备(12]。有一些物理和化学方法用于合成AgNPs [13),但这些方法创造了巨大的环境问题包括使用有毒化合物和一代的有害副产品。另一方面,使用生物实体,即微生物和植物,已经探索了AgNPs的合成,被发现是一个清洁、无毒,对环境可接受的方法。利用微生物的合成AgNPs有一些缺点,包括维持细胞培养在无菌环境和长时间的潜伏期。然而,植物介导AgNPs的合成提供了几个优势,如成本效益和无毒、环保产品(14]。植物提取物作为合成的减少和限制代理AgNPs和粒子形成更稳定的各种形状和大小,使它比化学和微生物合成一个更有效的方法。许多类型的植物曾AgNPs的合成,即牡荆牡(13),属amboinicus(15),栀子(16),牛至属植物vulgare(17),和水果提取的气味清香cumini。

Aegle marmelos树是一种原产于印度和它属于家庭芸香料。金色的苹果,它通常被称为印度枳和孟加拉海棠看到整个东南亚。芳香的叶子和果实的植物有药用价值和被用来治疗消化不良和鼻窦炎。叶子的答:marmelos含有生物碱的aegeline (N - [2-hydroxy-2 (4-methoxyphenyl)乙基]3-phenyl-2-propenamide)是已知的成分和消费作为膳食补充剂。水果的植物包括marmelosin包含几个生物活性化合物,luvangetin, auraptene,补骨脂素,marmelide和单宁。在目前的研究中,我们演示了使用的前景Aegle marmelos水果提取物AgNPs合成的。进一步的antimicrofouling活动biosynthesized AgNPs测试对海洋细菌生物膜形成孤立的从船的船体和16 s rDNA分析来确定的。

2。材料和方法

2.1。媒体和化学物质

所有媒体组件从Hi-Media购买实验室Pvt Ltd .,孟买,印度,和硝酸银从西格玛奥德里奇购买化学品、印度。的健康的水果答:marmelos从殿里Vellore收集,泰米尔纳德邦,印度。

2.2。准备水果提取

为了准备水水果提取物,50克的新鲜答:marmelos水果是surface-cleaned使用自来水,然后重蒸馏的水。水果干在烤箱60°C 48 h,然后使用迫击炮和杵碎成粉末。水提物是由地面加热粉末Milli-Q 100毫升的水60°C水浴10 - 15分钟,结果提取使用1号绘画纸滤纸过滤。AgNPs的滤液用于合成。

2.3。合成的银纳米粒子答:marmelos水果中提取

生物合成的AgNPs是由简单的还原硝酸银的使用水水果提取物答:marmelos遵循标准的出版文学与小修改。在一个典型的过程,12毫升的准备水果提取物加入88毫升1毫米的硝酸银溶液,在室温下在黑暗的孵化。然后,证实了纳米颗粒的形成视觉颜色从黄色变成深棕色。

2.4。描述

绿色合成AgNPs首次以紫外可见分光光度计(优秀的,德国)在300 - 800纳米的分辨率1海里。AgNPs合成纯化,冻干使用冷冻干燥器和驱动的样本使用x射线衍射仪分析了。XRD模式收集在力量中心——AXS D8推进x射线衍射仪和铜Kα辐射波长1.541°和扫描角2θ在10°-80°的范围。进一步表征合成纳米颗粒的傅里叶变换红外光谱学(优秀的,德国),使用由KBr冻干样品颗粒技术的范围400 - 4000厘米⁻¹。合成纳米粒子的大小和形态特征进行了研究使用原子力显微镜(Nanosurf ARITIDIS)。显微图像记录与硅悬臂力常数0.22 - -0.77 N / m和小费高10 - 12海里的联系方式。

2.5。样本收集和隔离的海洋细菌生物膜形成从船的船体

生物膜的样本来自船舶的船体固定Royapuram港(13°6′15′′N 80°17′30′′E)钦奈,印度泰米尔纳德邦,。收集到的样本被带到实验室无菌容器和存储在冰箱在4°C。孤立的细菌是由连续稀释的样本收集和电镀Zobell海洋琼脂(ZMA) 48 h内取样的时间。接种板块在37°C孵化24 - 48 h殖民地的发展;形态不同的殖民地被纯化和筛选的生物膜形成能力为O’toole描述和科特勒(18]。此外,隔离显示最大生物膜形成能力/污染活动选择和通过分子识别技术。

2.6。分子鉴定和识别

海洋细菌生物膜形成和被16 s rDNA分析表征。基因组DNA从纯粹的文化和孤立的片段对应16 S rRNA放大在PCR使用以下转发(5′-CWG RCC TAN CAC ATG SAA GTC-3′)和反向(5′grc GGW GTG TAC唠叨GC-3′)引物(单字母代码:R =或G S = C或G, W =或T, N = C或G T, W =或T)。这些序列与16 S rDNA NCBI数据库中序列和核苷酸序列相似性决定使用BLASTN [19]。序列对齐使用多序列比对软件CLUSTALW2程序采用邻居加入算法建立的发展史20.]。

2.7。分析Antimicrofouling AgNPs合成的影响

2.7.1。好扩散法

杀菌作用的生物合成AgNPs对海洋细菌生物膜形成是评估标准的琼脂扩散技术(21]。测试生物都生长在营养肉汤24 h和每个细菌隔离的隔夜汤文化调整到0.5麦克法兰(0.5 - -2.5×10的标准²³)CFU毫升⁻¹和草坪文化了穆勒辛顿琼脂(尼古拉斯)板块。冻干AgNP在无菌蒸馏水溶解,用为了防止粒子的聚集。五井6毫米直径是每个人在每个板块和合成AgNP溶液的浓度20,40岁,60岁,80μ克毫升⁻¹在每个加载。井在板的中心没有添加纳米粒子保持控制。盘子被孵化24小时37°C和抑制区被减去计算直径从总抑菌圈直径。

2.7.2。提取的胞外多糖(EPS)

AgNPs的影响生产的EPS的提取和量化研究了EPS的海洋细菌生物膜的形成。短暂,一夜之间隔离种植在不同浓度的AgNPs(0、20、40、60和80μ克毫升⁻¹在营养肉汤)37°C。提取进行了细菌分离株的EPS据库马尔et al。22]。隔夜生长细菌培养在8000转离心10分钟4°C和上层的收集。三卷冰冷95%乙醇添加到上层的为了沉淀每股收益。原油EPS从而获得被离心分离出来的10000 rpm 15分钟后,提取EPS的重量决定风干样品在室温下48 h。

2.7.3。Antibiofilm活动

antibiofilm活动是由微量滴定板方法按照我们以前的报告23]。菌株的生长在营养肉汤37°C用颤抖的150 rpm。100年μL(细菌培养在个别井的无菌接种96 -与AgNPs微量滴定板(80μg),控制井维护没有添加纳米粒子。然后,孕育了板在37°C 3天为了检查细菌隔离形成生物膜的能力。潜伏期后,文化在每一个被仔细地冲洗和无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)为了消除松散附着细菌细胞。形成的生物膜附着细胞被染色的井100量化μL结晶紫的0.1% (W / V) 20分钟。染色后,板与自来水冲洗和结晶紫与99%乙醇可溶性。彩色的光密度(OD)附着细菌测定微量滴定板的读者在570 nm (OD_570年海里)直接对应于生物膜的数量。

2.8。统计分析

所有的实验进行了一式三份和结果解释使用GraphPad棱镜6统计软件。实验数据的统计分析利用双向方差分析和统计学意义时被接受值小于0.05

3所示。结果与讨论

3.1。对AgNPs

3.1.1。紫外可见光谱分析

为了证实AgNPs的形成,水水果提取物答:marmelos1毫米AgNO对待₃由紫外可见吸收光谱监控解决方案是在200 - 800纳米的范围。一个吸收峰集中在423 nm的特点AgNPs观察(图1)。表面等离子体共振(SPR)模式特征的金属粒子与粒子大小、稳定分子,表面吸附粒子的介电常数和介质。一个SPR带对应于球形纳米粒子,而两个或两个以上的SPR带对应于各向异性分子(24]。在目前的研究中,一个单一的SPR乐队表现出的反应混合物揭示了AgNPs的球形。SPR峰的强度随着反应时间的增长表明AgNPs浓度的增加。在24小时的反应时间,吸光度达到最大之后没有变化峰值的位置指示的反应。

3.1.2。XRD

绿色合成的晶体性质AgNPs提取的水果答:marmelos证实了x射线衍射研究(图2)。四个不同的峰值为38.26°,43.38°,64.4°,和77.05°表示,(111),(200),(220)和(311)反射的金属银。XRD模式也代表了银的面心立方结构紧密匹配的报道引用值联合委员会权力衍射(JCPDS) 03 - 0921标准。的感染高峰明显证实水晶合成纳米颗粒的性质是在良好的协议与先前的报告25]。

3.1.3。红外光谱

AgNPs合成的红外光谱谱图所示3这揭示了可能的生物分子存在于水果提取也是负责银离子的还原及其与AgNPs交互。红外光谱显示强烈的乐队在3441.01厘米⁻¹,1645.28厘米⁻¹,1631.78厘米⁻¹,1409.04厘米⁻¹。3441.01厘米的宽带⁻¹对应的强烈伸展振动羟基(-哦)的酚类化合物(26]。尖锐激烈的峰值为1645.28厘米⁻¹和1631.78厘米⁻¹可以归因于- C = O -和- C = C -拉伸振动,这表明水果提取物中的黄酮类和萜类化合物的答:marmelos。1120.64厘米的两座山峰⁻¹和1066.64厘米⁻¹可以归因于羧酸的。——伸展振动,酯和醚组蛋白质和代谢物的提取中,可能参与了还原过程(27]。乐队在1408.04厘米⁻¹对应于芳香胺的C = N伸缩振动。弱信号观察到700.12厘米⁻¹,538.04厘米⁻¹,983.70厘米⁻¹对应于-C-Cl -C-OCH₃分别延伸模式的卤代烃和烯烃(28]。因此,从红外光谱,它可能认为这些生物分子的主要作用bioreduction AgNPs的稳定。

3.1.4。AFM

的biosynthesized AgNPs进一步证实了AFM显微图像。获得的图像使用硅悬臂梁和力常数0.02 - -0.77 N / m在接触模式29日]。冻干样品溶解在丙酮和spin-coated使用顶点仪器旋转涂布机然后它干了15分钟前分析。粒子是球形的形状和大小的单个粒子被发现34.7海里。合成纳米颗粒的地形图像显示了单个粒子聚集(图4)。

3.2。分离和分子鉴定

完全,12种不同的菌株被分离和筛选形成生物膜的能力。12隔离,隔离五显示最大污染活动选择,16 s rDNA测序后,他们认定假单胞菌otitidis应变NV1,铜绿假单胞菌应变NV2,肠杆菌属下水道应变NV3,小细菌属sp。NV4,葡萄球菌hominis应变NV5。他们的序列存入基因库(NCBI)加入数字KF574079 KF574080, KF574081, KF574082和KF574083分别。

3.3。Antimicrofouling研究

3.3.1。好扩散分析

良性的合成纳米颗粒导致这部小说研究水水果提取物答:marmelos被用于合成AgNPs antimicrofouling效应的绿色合成AgNPs测试对海洋细菌生物膜的形成。AgNPs显示显著的抗菌活性对所有五个细菌生物膜形成(假单胞菌otitidis应变NV1,铜绿假单胞菌应变NV2,肠杆菌属下水道应变NV3,小细菌属sp。NV4,葡萄球菌hominis应变NV5)证实了抑制的圆形区域。抑制区被发现增加AgNPs浓度的增加和作用被发现最高为80μ克毫升⁻¹浓度(方差分析,)。在测试隔离,抑制区被发现对最高铜绿假单胞菌应变NV2(12毫米)小细菌属sp。NV4(10毫米)和最低的反对肠杆菌属下水道应变NV3(6毫米)。在的情况下P。otitidis应变NV1和美国hominis应变NV5发现9毫米,7毫米,分别(表1)。

3.3.2。AgNPs对胞外多糖产量的影响

分泌的胞外多糖是广泛的聚合物,可以高度附着在细胞表面或释放的粘液细胞的周围环境。细菌生物膜的形成是紧密相连的生产EPS充当粘合剂的水下表面粘附的细菌。在目前的研究中,AgNPs的影响在生产EPS的海洋细菌生物膜的形成是由生物质产量(EPS /单位生物量)。图5显示了EPS的干重提取细菌生物膜形成可与生物膜的形成,如图6。在五个细菌生物膜的形成,假单胞菌otitidis应变NV1被发现生产EPS的最大数量,而大肠下水道NV3产生最少的压力。此外,AgNPs的影响(0、20、40、60和80μ克毫升⁻¹)研究了EPS的生产,结果如图所示6。增加了AgNPs浓度负监管生产EPS(方差分析,)。这表明biosynthesized AgNPs有能力阻止EPS生产,否则细菌分离株的生物膜。Kalishwaralal et al。30.]研究了AgNPs的antibiofilm活动反对开发的生物膜铜绿假单胞菌和葡萄球菌epidermidis。他们表明,纳米颗粒能有效地阻止EPS的合成。根据文献,细菌与EPS生产能力在成功殖民表面可能有优势成为主要的殖民者。据报道,菌株在生物膜形成能力的差异可能是由于不同的表面扩散的附加和天生的能力(31日]。

3.3.3。Antibiofilm活动

进一步的antibiofilm活动AgNPs被微量滴定板化验方法直接量化附加的细菌。生物膜是由与结晶紫染色法检测,通过测量光密度在570海里。控制油井的OD值大于井装满AgNPs (80μ克毫升⁻¹)(方差分析,)。这直接反映了antibiofilm能力或生物AgNPs(图的防污性能5)。因此,上述结果表明,AgNPs可以作为潜在的antimicrofouling代理对海洋细菌生物膜的形成。尽管几项研究已经报道了纳米银的杀菌作用(9,32),他们的作用机制至今尚不清楚。李等人。33研究了AgNPs反对的作用机制大肠杆菌和报道,纳米粒子能够破坏细菌细胞膜的结构和抑制一些膜酶的活动,最终导致细菌的死亡。同样,科拉琴和杂志(34协会]报道活性氧(ROS)的抗菌机理和细胞膜损伤AgNPs反对铜绿假单胞菌。由于Ag)⁰电离、银⁺离子也可以与蛋白质相互作用,特别是与活性硫醇团体(半胱氨酸),增加了细胞损伤(35]。因此,从上面的报道,暗示的是,AgNPs可能对海洋细菌生物膜形成通过抑制呼吸链酶导致活性氧的形成,最终导致细菌死亡。因此,获得的结果直接显示,生物合成AgNPs不仅有效地抑制细菌的生长,也阻碍了生物膜的形成。

4所示。结论

绿色合成的AgNPs水水果提取物答:marmelos据报道。海洋细菌生物膜的形成是与船的船体被确定通过16 s rDNA分析导致microfouling根据他们的能力。绿色合成纳米颗粒的能力控制/防止细菌生物膜形成社区(这被认为是主殖民者)进行antimicrofouling研究对此进行了研究。纳米粒子被发现控制生长和存活的细菌生物膜形成有效明显的antimicrofouling研究。需要开展进一步的工作来证明该领域的适用性,在海洋环境中合成纳米颗粒。因此,目前的工作给范围可能发展的配方含有AgNPs有效防污剂可以防止microfouling,从而防止海洋生物淤积。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者要感谢羊膜生物科学pvt Ltd .)的细菌分离鉴定,和大学支持研究工作。