人肺癌细胞系A-549 ATCC受营养上有机和无机硒的差异影响

摘要

有机和无机形式的硒(Se)对人体细胞的营养浓度的影响已被广泛研究;然而，迄今为止，对营养水平上的潜在毒性知之甚少。在本研究中，我们确定了亚硒酸钠(SSe)和硒蛋氨酸(SeMet)对暴露在0 - 3 mM硒浓度下的肺癌细胞的细胞生长和细胞内结构的影响。我们的结果表明，SSe对细胞生长的影响比SeMet更快(分别为24 h和48 h)。细胞暴露于0.5、1.5和3 mM SSe 24 h后，与对照组相比，细胞生长减少了10、50和60%。48 h后，暴露于SSe的细胞中细胞核明显碎裂，提示诱导细胞死亡。相反，SeMet不影响细胞增殖，细胞表型与对照相似。微管和微丝结构也受到这两种Se化合物的影响，同样，SSe比SeMet毒性更大。据我们所知，这是第一次报道有机硒和无机硒在肺癌细胞营养上水平的差异效应。

1.介绍

硒(Se)作为硒蛋白的一部分，在甲状腺激素的代谢和细胞抗氧化应激中发挥重要作用[1.,2.］.硒酶是胎儿细胞分化、生长和发育所必需的[3.]硒缺乏导致免疫球蛋白的产生和谷胱甘肽过氧化物酶的活性降低，从而减少细胞氢过氧化物[4.］.关于血浆中硒的最低浓度对多种酶的最大表达仍然存在争议。谷胱甘肽过氧化物酶需要量为75 ng/mL, 40 ng/mL即可达到μg / d Se (5.–7.］.硒蛋白活性在血浆硒水平在1.2至1.7之间时达到最大值μ摩尔/升[8.］.根据汤姆森的一项研究[9，血液中硒浓度达到最佳代谢可能取决于人群类型。硒的主要来源是谷物、肉类和鱼类，少量的牛奶和鸡蛋[10,11］.

硒在生命系统中的作用取决于其化合物的化学结构，而化学结构又与它们的浓度和生物利用度有关。例如，硒蛋氨酸(SeMet)的生物利用度大于亚硒酸钠(SSe) [12］.

即使高剂量硒也可能有毒[13,14]，这种元素的超营养水平对某些疾病(包括高血压和癌症)有保护作用[15–19］.尽管硒的抗癌作用已被证实[20.]据我们所知，很少有研究比较以超营养水平供应不同化学形式的硒的效果。

本研究通过将人癌细胞A-549ATCC暴露于营养上有机和无机Se(最高3 mM)，以确定其对细胞生长、DNA和细胞骨架结构的影响。我们的结果表明，硒，在营养上的浓度给人肺癌细胞，可以进一步探索作为一种癌症治疗的选择。这种递送可以通过功能化的纳米颗粒来完成。

2.材料和方法

2.1.化学品

硒-L-蛋氨酸（SeMet）和亚硒酸钠（SSe）购自Sigma（美国密苏里州圣路易斯市）。本研究中使用的所有其他化学品均为商用化学品。

2．2．细胞培养

选择人肺癌细胞系A-549 ATCC进行本研究。细胞在D-MEM（Dulbecco改良Eagle培养基，GIBCO，USA）中培养，添加10%胎牛血清（GIBCO，USA），并在37°C下培养，5%CO_2..

2.3. A549细胞对硒化合物的暴露

在12孔板(Costar，康宁，美国)中制备亚融合培养物，将其暴露于Se浓度为0.5、1.5和3 mM的SSe或SeMet中24小时。照射后用台台蓝测定细胞活力。实验重复三次，结果以均数±标准差(SD)报告。采用单因素方差分析进行统计分析。Tukey HSD(诚实显著差异)被用作一个事后确定处理之间显著差异的测试()， Minitab 17.0.1软件进行数据分析。

2.4.蛋白质图谱分析

将A549细胞暴露于0.5 mM浓度的硒化合物中24小时。之后，用2% SDS加抑制剂蛋白酶鸡尾酒溶解的PBS洗涤细胞三次(罗氏，德国)。样品(40μg/lane)， SDS-PAGE 10%凝胶在还原条件下分离[21]，考马斯蓝0.25% (Sigma，美国)。参考蛋白质标准(Sigma，美国)。

2．5．免疫细胞化学分析

对照细胞和暴露于硒化合物的细胞用4%对甲醛固定20分钟，用0.05% Triton缓冲液(含10 mM Tris、5 mM KCl和1 mM MgCl)渗透_2.，然后暴露于抗-β-微管蛋白/抗小鼠IgG-FITC抗体或FITC-phalloidin（Sigma-Aldrich）。使用Vecta Shield DAPI（Vector Laboratories，USA）安装制剂，并在荧光显微镜（徕卡，DMLS）下使用450–490显微镜进行观察 纳米B滤光片。

2.6。DNA制备

如前所述，细胞暴露于硒化合物中。为了进行细胞培养物的提取，将培养基移除了300μ添加1 L裂解缓冲液。根据Sambrook等人进行基因组DNA提取[22］.DNA样本在1.5%琼脂糖凝胶上分析，用溴化乙啶染色。用260-280 nm的紫外光(Gene Genius, Syngene)观察条带。

3.后果

3.1. 有机和无机硒对细胞生长的影响

采用单因素方差分析对细胞生长进行数据分析。Tukey HSD(诚实显著差异)被用作一个事后测试以确定不同处理中均值之间的显著差异()使用Minitab 17.0.1软件进行数据分析。暴露于SeMet和SSe的肺上皮细胞的细胞生长如图所示1（a）和1（b）,分别。在0 h时，每次治疗以6165个细胞/mL开始。数字1（a）24 h时，各组细胞生长无显著差异(SeMet)。然而，在这一点之后，显著的差异()与对照组相比，无论浓度如何，均观察到细胞内生长 h、 硒水平为0.5、1.5和3 mM减少的细胞生长减少分别为10%、30%和70%().96年后SeMet的生长抑制 h与72岁时相似 h、 其值约为30%、70%和90%。

在经SSe处理的肺上皮细胞中获得了不同的结果（图1（b））.生长抑制在24 h，其中1.5和3.0 mM Se显著()与对照组相比，细胞生长分别减少45%和60%。24岁以后 h、 在作为SSe提供的每种硒浓度中观察到细胞生长下降的趋势。此外，在72和98 h、 SSe的存在导致细胞生长减少90%以上。因此，SSe对细胞的毒性作用比SeMet更大。

3.2. 蛋白质图谱分析

数字2.显示控制细胞的肽概要(巷1)和那些接受0.5毫米Se提供SeMet(巷2)或SSe(巷3)。在这个图中,观察到在控制(巷1),主要的肽MW≥190,170,150,110,90,80,65,60岁,55岁,48岁,40岁,35岁和28 kDa。与此相反，SeMet和SSe处理的细胞显示，MW≥60、65、150、170和190 kDa的多肽在SeMet和SSe处理下降低。

3.3. 核分析

细胞核用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色3.（a） 及3.(a’))的荧光图案均匀。用0.5 mM和1.5 mM Se处理的细胞核中也观察到类似的结果(见图)3.(b)和3.(c))。与此相反，在0.5 mM和1.5 mM Se处理的细胞中，一些细胞核以SSe的形式出现核碎裂(图)3.（b′）和3.(c))。结果表明，SSe在核水平上的损伤依赖于浓度，提示细胞死亡诱导。然而，DNA的基因组分析(图4.)经有机硒或无机硒处理后，该结构没有改变。

3．4．微管分布

两种硒化合物处理48 h后，用免疫细胞化学方法分析细胞内微管分布。微管蛋白染色显示对照细胞微管模式，细胞质中的微管网勾勒出细胞形态(图)5.（a） 及5.('))。

用0.5和1.5处理的细胞 mM Se作为SeMet（图5.(b)和5.（c） ）表明细胞膜边缘的荧光分布发生改变。这种改变在暴露于1.5的细胞中更为明显 毫米级（图5.（c） ）。除细胞形态改变外，还观察到荧光损失。

微管网络在0.5和1.5处理细胞中的分布 mM Se作为SSe（图5.（b′）和5.（c′）显示，与对照细胞相比，荧光模式发生了严重变化（图5.（a） 及5.（a′）。形态的浓度依赖性损失是明显的（图5.(c’))，在核周区域有大量圆形细胞保留荧光。结果表明，微管网络同时受到SeMet和SSe的影响;然而，在暴露于SSe的细胞中，这个网络受到的影响更大。

3.5.微丝分布

使用特异性结合聚合肌动蛋白或F-肌动蛋白的phalloidin检查肌动蛋白微丝分布。对照细胞（图6.（a） ）在细胞质中向质膜方向显示典型的微丝束。在细胞间连接的边缘也观察到荧光（图6.（a′）。在0.5和1.5下暴露于SeMet的细胞中 mM-Se，膜边缘出现荧光斑（图6.(b)和6.（c） ）。在暴露于相同硒浓度的SSe的细胞中，荧光显示分布在细胞质中（图6.（b′）和6.我们的结果表明，SeMet和SSe改变了微丝排列，以浓度依赖的方式影响细胞形态的完整性。

4.讨论

无机硒、亚硒酸盐和硒酸盐对癌症发展的影响已被广泛分析[23,24］.在较小程度上，对硒的抗癌活性进行了探索。在有机硒化合物中，SeMet被广泛用于评估其抗癌活性，因为它是该元素在食品中的主要天然形式[11］.然而，比较有机硒和无机硒性能的研究很少。

元素形态与生物利用度和代谢转化密切相关。在硒的情况下，SSe(无机形式)的吸收低于SeMet(有机形式)[25].高浓度的SeMet会产生与无机硒类似的毒性作用[13］.

结果表明，硒的有机和无机形式对肺癌细胞的影响是浓度和形态依赖的。两种化合物均抑制细胞生长，并诱导细胞骨架组织和蛋白表达的变化。在这种情况下，高分子量蛋白的减少可能是微管结合蛋白(MBP)和/或肌动蛋白结合蛋白(ABP) [26]特别是，研究结果证明了荧光肌动蛋白纤维的显著变化，这些纤维由F-肌动蛋白斑块组成，由FITC phalloidin修饰。在这方面，一些ABP可能参与这些斑块的成核，如肌动蛋白凝胶[27]它诱导F-肌动蛋白凝胶化；该蛋白质由112000–115000道尔顿的亚单位组成。或者，其他ABP如vinculin或α-肌动蛋白可能参与其中[28].这方面值得研究。

总体而言，上证综指的影响更为明显。即使当SSe预期比SeMet的生物可利用性更低时，我们的结果表明，在相同的Se浓度下，SSe对细胞的毒性更大。

硒的基本营养重要性在于其通过谷胱甘肽过氧化物酶和硫氧还蛋白还原酶等酶的抗氧化作用，这些酶参与保护活性氧产生的损伤[2.,24]。充分供应硒的细胞不易受到内源或外源产生的氧自由基的损伤作用，这些氧自由基可能会攻击细胞DNA。这些情况在处理硒的预防活性时是有效的。在我们的研究中，我们使用了肺癌细胞。我们对DNA完整性的结果显示，DNA的细胞暴露于0.5℃时的结构 mM Se作为SeMet或SSe提供。

Staurosporine (St)是一种蛋白激酶的竞争性抑制剂，可与高亲和力和低选择性的激酶结合[29］.St被认为是研究细胞凋亡的有价值的工具，在几种细胞类型中，涉及细胞形态从扁平到星形的变化和核碎裂[30.–33］.综上所述，我们使用St作为对照来支持我们的核分裂结果(图)3.）.

细胞暴露于20μm星形孢菌素20小时的结果 h显示核碎裂（DAPI）和具有凋亡小体和改变分布的泡状肌动蛋白的凋亡特征的形态学变化（图A：图1（b）和图1（b'），见在线补充资料http://dx.doi.org/10.1155/2014/923834）.

基因组DNA分析显示，与未暴露于staurosporine的对照细胞相比，DNA完整性和核糖体RNA降解（补充材料，图1（b））。然而，90%的细胞显示碎片（补充材料，图2（a））因此，SSe和SeMet的核碎裂和DNA完整性结果不是“伪影”（图）3.和4.）.

这反映出经典的凋亡并不存在，尽管事实上凋亡细胞固有的形态改变，即肌动蛋白分布的改变，形成混合，或者可以由抗凋亡分子诱导并激活机制来恢复细胞内稳态[34］.

我们的结果与门特等人报道的结果不同[35他观察了用SeMet或SSe治疗的前列腺癌细胞的DNA片段。这为硒作用对细胞类型的依赖性提供了额外的证据。

文献中报道了无机硒的高细胞毒性[36]我们的结果与有机化合物SeMet的结果不一致，SeMet只显示了轻微的细胞骨架重组。

微管和微丝等细胞结构与运动、分泌和有丝分裂等重要功能有关。因此，这些结构的动力学在正常细胞生理学中至关重要[37–39］.因此，人们开发了多种对微管有作用的抗肿瘤药物[20.]我们的研究结果表明，SeMet和SSe都影响微管和微丝网络。在暴露于SSe的细胞中，损伤更为明显。Shi等人[20.表明SSe破坏了白血病HL60细胞的微管组装，但未发现SeMet对这类细胞的影响。

根据我们的研究结果，SSe可能用于癌症的治疗；然而，一个挑战是确定SSe输送到靶细胞的合适通路。最近，在胶质瘤细胞系中，与硒结合的烷基化剂替莫唑胺（TMZ）增加了其作为抗癌剂的潜力[40]此外，壳聚糖稳定的硒纳米粒（Ch-Se纳米粒）也为此进行了研究[40]比较了Ch-Se-NPs和其他硒化合物对肝癌细胞的作用。根据他们的研究结果，Ch-Se-NPs是一种新型化合物，可作为未来的化疗药物应用。因此，SSe可以作为NPs交付；但是，应进行进一步调查。

5.结论

本研究比较了营养上浓度有机硒(SeMet)和无机硒(SSe)对肺上皮细胞的影响。无机硒在降低细胞生长和涉及蛋白质、核、微丝和微管损伤的作用机制方面比SeMet更有效，即使SeMet比SSe更具有生物可用性。如果用于癌症的治疗，SSe可以通过靶向纳米颗粒直接传送到癌细胞。

利益冲突

作者声明，本论文的发表不存在利益冲突。

致谢

作者感谢瓜纳华托大学(Dirección de Apoyo a la Investigación y Posgrado)、CONACYT和PROMEP提供的资金支持。这项工作主要是在瓜纳华托大学的细胞生物学实验室进行的。

补充材料

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