文摘

本文描述了一个比较研究的两个亚硝酰铁配合物的分解(nic)与青霉胺硫羟配体(Fe₂(SC₅H₁₁没有₂)₂(没有)₄所以₄h·5₂O (我()、谷胱甘肽)-谷胱甘肽-配体(Fe₂(SC₁₀H₁₇N₃O₆)₂(没有)₄所以₄h·2₂O (二世),自发进化在水介质。没有形成测量传感器电极和光谱光度测量的方法通过测量一个血红蛋白(Hb)的形成不复杂。没有进化反应速率(我)= (4.6±0.1)·10⁻³年代⁻¹和青霉胺配体的消除速率常数= (1.8±0.2)·10⁻³年代⁻¹在25°C 0.05磷酸盐缓冲剂,pH值7.0,计算使用动力学建模基于实验数据。反应都是可逆的。分光光度法和质谱仪方法有坚定地表明,GS的青霉胺配体交换⁻在1.5·10的分解⁻⁴米(我)在10⁻³在24 h M谷胱甘肽,与76%的收益率。已经建立,这种行为是由电阻(二世)分解的高亲和力铁谷胱甘肽的复杂。发现反应可能阻碍S-glutathionylation至关重要的酶系统的存在(我),对网卡代谢很重要,与它的抗肿瘤活性。

1。介绍

密集的最近的研究基本一氧化氮(NO)化学作为一个必要的和普遍的监管机构的细胞代谢功能(1,2)包括调查的性质合成nonheme亚硝酰铁复合物(nic)仿生学细胞NO-intermediates [3- - - - - -8]。网卡与功能性含硫配体是一类高效NO-donating化合物(9),可以使用作为新一代的基础药用产品:高效的抗肿瘤药物(10- - - - - -12),原始血管舒张药品治疗急性冠脉综合征(13- - - - - -16),等等。在不治疗的情况下尤为重要,研究合成网卡的作用机制及其生物转化在活的有机体内作为潜在NO-donating药物(抗肿瘤溶瘤、降压和antiaggregation动作)和生理功能显著的血红素蛋白质。激烈的研究新外生的捐助者的一氧化氮(NO),近年来进行了,一直指向创建生产没有的新方法。临床使用的配方,生产没有在生理条件下硝酸有严重缺点有关他们的宽容。活性中心模型nonheme iron-sulfur蛋白质,网卡与功能性加压法配体合成的化学物理研究所俄罗斯科学院(17,18],自发进化没有在水介质分解的结果,似乎未来promedicines新一代的19,20.]。这些物质具有双重药物效应引起的生物活性硫醇一方面和一氧化氮。他们表现出抗肿瘤和cardiologic活动在临床前测试。

我们发现复杂(我),合成和组合的描述(14,21),进化没有和青霉胺thiolyl在分解(21]。

本文的目标是分解的动力学建模(我)来确定青霉胺的消除速率常数。目的研究还探讨巯基配体交换反应的(我)(作为一个有效的外生的捐赠者没有14谷胱甘肽),这是一个重要的过程可能的NIC硫醇配体交换反应生物硫醇在活的有机体内。我们选择减少谷胱甘肽(GSH)研究配体交换反应(我)。谷胱甘肽是一种水溶性三肽氨基酸组成的:谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸。谷胱甘肽是最常见的非蛋白硫醇在动物,和人体组织浓度从0.1到10毫米不等。最高浓度存在于肝脏、脾脏、肾脏、晶状体,红细胞和白细胞。谷胱甘肽的功能是至关重要的。其半胱氨酸硫醇作为亲核试剂与内源性和外源性化合物的反应。其主要功能是抗氧化剂,大量的细胞质酶辅助因子,硫醇盐剂在许多细胞的重要posttranslation修改3蛋白质。谷胱甘肽代谢等之间的相关性疾病如癌症,神经退行性疾病,囊性纤维化,艾滋病毒,和衰老22已经建立。此外谷胱甘肽可以促进S-glutathionylation基本酶,受体,结构蛋白、转录因子和运输蛋白(23]。

2。实验

2.1。材料

我们使用牛Hb三(美国赛瓦,德国),乙腈质等级(Panreac、西班牙),减少L-glutathione, KI(美国奥尔德里奇),Na₂HPO₄h·6₂O和不₂阿宝₄·H₂FeSO O (MP生物医学,德国)₄H·7₂美国啊,D-penicillamine(σ),交联葡聚糖G-25(法玛西亚,瑞典),和亚硫酸氢钠(默克公司、德国)。水被蒸馏纯化Bi /双蒸馏器(德国)。

合成、结构(CCDC 680286)和物理化学数据的(我)(图1)描述了其他地方14,21)和(二世)是由类似的方法合成14]。复杂(我)已经获得的硫酸亚铁反应(II)与水溶液中D-penicillamine的摩尔比率1:3。使用标准执行的反应是真空线和Schlenk技术下氩。以前,氧气从水中移除了三重冻结和真空抽水。干燥的混合物,含有0.42克(1.5更易FeSO)₄H·7₂O和0.68克(4.5更易)D-penicillamine添加10毫升水,准备如上所述,一氧化氮是通过在室温下产生的深紫色的解决方案。细红针出现在反应容器的墙壁后10 - 12分钟,逐渐填满整个解决方案的体积。混合物被关了三天在6 - 8°C,过滤,干燥真空下氩。产量是198毫克(20%)。复杂(二世)是由相同的合成路线。元素分析、穆斯鲍尔和电子顺磁共振光谱证实,复杂的结构类似于(我),而是青霉胺硫醇配体存在两个分子谷胱甘肽(21]。

元素分析(我)和(二世)多晶体是由多路存取分析IPCP RAS的中心。

红外光谱 (我)和(二世)是记录在PerkinElmer光谱在室温下100 x。(我)发现:铁,15.60;C, 16.72;H, 4.50;N, 11.75;啊,38.02;年代,13.40%。菲₂C₁₀H₃₂N₆O₁₇年代₃要求:铁、15.64;C, 16.76;H, 4.47;N, 11.73;啊,37.99;年代,13.41%;红外光谱:ν/厘米⁻¹= 1771 (s);1723(年代,没有)。(二世)发现:铁,11.40;C, 24.52;H, 3.91;N, 14.28;啊,36.02;年代,9.79%。菲₂C_20.H₃₈N₁₀O₂₂年代₃要求:铁、11.45;C, 24.54;H, 3.89;N, 14.31;啊,35.99;年代,9.82%。红外光谱:ν/厘米⁻¹= 1771 (s);1728(年代,没有)。

2.2。操作技术在惰性气体气氛(24]

下的所有程序进行了氮(高纯级),此外纯化的铬镍催化剂通过一列。氮是清除磁搅拌解决方案(缓冲,水)解决方案工作了30分钟。以下这些解决方案命名厌氧。使用的所有船只和石英电池密封橡胶隔膜密封(美国σ),这允许引入气体通过一根针和其他必要的组件。解决方案从一个容器转移到另一个使用注射器与焊接针头或氮过剩压力下使用两个针头与聚四氟乙烯毛细血管。超压排放通过额外的针用聚四氟乙烯毛细管浸到水封顶。细胞和血管的体积4和5毫升,分别包含重样本网卡或其它试剂与氮气通过针30分钟。

2.3。电化学测定的浓度没有进化(我)解决方案在考试

测量电流的传感器电极的氨基- 700没有一氧化氮测量系统(创新工具,Inc .)、美国)是用来测量的浓度没有生成的(我)。没有在水中浓度的解决方案被记录为ca 500年代(使用0.2 s增量)任何捐助者不等于浓度的解决方案M。氮气气氛下的实验。一个标准的纳米水解决方案₂(0.01米),补充20毫克的KI溶液和2毫升1 M H₂所以₄(c.p。)在18毫升的水由制造商推荐(25),是用于电化学传感器的标定。传感器校准和实验进行了25°C和密集的搅拌。使用磷酸缓冲0.05米pH值7.0。氧气从缓冲区中删除了三重冰冻和脱气实验在厌氧条件下的真空技术,使用标准Schlenk行之后,缓冲存储24 h在玻璃塞的玻璃瓶。的样品(我)在充氮船0.05厌氧磷酸盐缓冲剂pH值7.0为了获得(我)米的解决方案是添加和搅拌10到15分钟直到完全溶解(我)。同时惰性气体传播通过测量30 - 40分钟电化电池配备橡胶隔膜(σ,美国海豹和连接到一个恒温器,包含准备49.5毫升的磷酸缓冲用浸热传感器和电极。后0.5毫升的解决方案是包含(从容器中删除我)解决方案和送入测量细胞虽然橡胶密封。记录的形成没有在系统开始在同一时间。

2.4。准备一个乙肝的解决方案

一个齐次制备得到牛Hb的牛血红蛋白(MP生物医学、德国),这是一个混合的高铁血红蛋白(metHb)和氧合血红蛋白(HbO₂)。0.05 Mphosphate缓冲区(pH值7.0)使用Hb的准备阶段,在所有实验与Hb。将与HbO metHb的混合物₂Hb,第2列×15厘米挤满了交联葡聚糖G-25制备和转化为厌氧状态。为此,50毫升(列)的体积的缓冲区的厌氧缓冲然后40毫升含亚硫酸氢钠(5毫升,100毫克毫升⁻¹)是通过列。列了亚硫酸氢站3分钟,然后洗和50毫升厌氧缓冲直到亚硫酸氢的负面反应(甲基紫罗碱)。商业血红蛋白(0.5 g)与搅拌溶解在缓冲(5毫升),氮净化与搅拌30分钟,连二亚硫酸盐溶液(2毫升,100毫克毫升⁻¹)补充道。解决方案的整除的吸收光谱表明,整个metHb与HbO的混合物₂已经变成了Hb。然后多余的连二亚硫酸盐和产品的分解被交联葡聚糖G-25列。Hb(5毫升)的溶液的浓度M是筛选了。Hb的解决方案是存储在冻结状态在液氮整除。之前使用Hb的解决方案是在5毫升thawn烧瓶在氮气流中。纯洁和Hb的同质性的指标是摩尔吸光系数的比值的吸收最大值与发表的数据。

2.5。分解复杂的(我)或(2)在pH值为7.0

实验进行了使用相同的原创M NIC的解决方案。网卡的样品在充氮船0.05厌氧Tris-HCl缓冲pH值7.0为了获得一个网卡米的解决方案是添加,溶解了15分钟,然后在液态氮冷冻球的形状。以下实验NIC的目的是解冻氮流约20分钟,直到完全融化的球,然后解决方案能整除0.75毫升被插入一个4毫升厌氧测试试管(光路的1厘米),含2.25毫升0.05厌氧缓冲pH值7.0实现网卡最终的浓度M。参考电池包含3毫升的缓冲区。吸收光谱被记录在250 - 500和300 - 650 nm范围在适当时间间隔25°C。

2.6。动力学(我)与谷胱甘肽

实验氮气氛下进行。一个 米(我)解决方案,如上所述用于实验和准备谷胱甘肽的解决方案在0.1 M Tris-HCl缓冲pH值7.0。1.95毫升的厌氧缓冲和0.75毫升米(我)解决方案4毫升厌氧测试试管插入。反应是由添加0.3毫升谷胱甘肽的解决方案。最后的浓度(我在测试电池)M。参考电池含有厌氧缓冲pH值7.0,(我)相同浓度的测试试管。差分吸收光谱是注册在适当间隔,显示的数字。

2.7。NIC动力学交互((我)或(2))与乙肝

我们使用的解决方案(我)或(二世)0.05厌氧Tris-HCl-buffer pH值7.0后除霜氮气流量下,如上所述。0.75毫升的网卡解决氮转移到下一个厌氧测试试管和一个4毫升比较试管,包含这样的数量的0.05厌氧缓冲pH值7.0,所以引入后所产生的反应溶液的体积约为0.11毫升的Hb解决方案测试试管将3.0毫升。反应是由添加Hb测试试管达成解决方案米的浓度。网卡解决方案的最终浓度在测试电池和参考试管M。进一步吸收光谱的区别是注册在适当间隔,显示的数字。同样Hb与网卡之间的交互谷胱甘肽的存在研究了厌氧Tris-HCl缓冲pH值7.0。缓冲溶液是插入到厌氧比色皿(1.84毫升和1.95毫升的测试和参考试管,职责),0.75毫升网卡M和0.3毫升谷胱甘肽的解决方案在0.1 M Tris-HCl缓冲pH值7.0。Hb溶液的反应是由添加测试试管了M。然后吸收光谱的区别是注册在适当间隔,显示的数字。

2.8。吸收光谱

吸收光谱被记录在25°C使用Specord M-40分光光度计配备一个接口,用于计算机辅助登记的光谱和恒温小型管固定器。

2.9。Hb和HbNO

Hb和HbNO spectrophotometrically评估。为此吸收光谱中描述被组件分解为文献[17]。确定HbNO浓度、反应体系的吸收光谱包含Hb和HbNO deconvoluted到组件(Hb的光谱和HbNO)使用MathCad程序由计算机处理。解决方案应该满足标准偏差的平方和最小的混合物的实验谱的计算: 在哪里是均方根偏差;实验数据(吸光度)在一个特定的时间时刻;所需的函数吗,,,值;和分别Hb和HbNO最初的吸光度;和分别是HbNO的分数和Hb。计算了在波长450 - 650纳米的地区到200年实验分。在一系列的实验中,值范围从来,表明高质量的模拟反应混合物在每一刻的吸收光谱和高Hb和HbNO浓度测定的准确性。

2.10。质谱分析

质谱分析进行了使用2020日本岛津公司质仪器,包括液相色谱仪LC-20突出与矩阵检测器SPD-M20A照片(200 - 800 nm)和mass-selective四极检测器(扫描质量范围:50 - 2000;电离模式:酒后驾车/ ESI / APCI)。分析条件如下:method-electrospray电离,电离质,样本输入method-direct solvent-acetonitrile,孵化(25°C),暴露mode-positive模式,或消极的模式。分析样本准备在氮气氛下0.05米Tris-HCl-buffer pH值7.0。2毫升船只与聚四氟乙烯/硅胶/聚四氟乙烯密封允许样本插入注射器,用氮气吹大约10分钟前样本插入。

2.11。穆斯堡尔吸收光谱(我)和(2)记录在恒定加速度WissEl操作模式

⁵⁷Co Rh矩阵作为源。光谱测量在低温下使用连续流氦低温恒温器cf - 506(牛津仪器)和可控的温度。穆斯堡尔谱是由最小二乘法处理假设个人的洛伦兹形式光谱组件。⁵⁷菲多晶体的穆斯堡尔谱(我)和(二世)是一个对比;参数(四极分裂mm / s,异构体转变mm / s,吸收谱线的宽度毫米/秒(我),毫米/秒,mm / s,吸收谱线的宽度毫米/秒(二世在温度85 K)。他们是类似于其他复合物的”- s“结构类型。这表明两个铁原子的结构等效(我)和(二世)。

2.12。提议的反应描述分解计划(我)动力学模型被认为是吗

速率常数的值确定使用最小二乘法的基础上相应的微分方程组的数值解。的浓度没有和(我),由一个传感器电极或吸收光谱,被用作实验数据。

3所示。结果与讨论

3.1。分解(我)

复杂(我)(图1)自发发展没有分解的结果。本文涵盖了分解(我)使用两种方法:通过直接测定的数量没有通过传感器电极和发布spectrophotometrically通过观察吸收光谱的变化(我)。

3.1.1。分解(我)在0.05米磷酸缓冲pH值7.0。没有使用一个传感器测量电极

传感器电极许可措施总额没有在系统,解决方案,和吸附电极:。在电化电池反应混合物的体积相当于50毫升。(不)是没有集中在解决方案,也没有_年代在电极的数量没有摩尔。图2代表了空间的动力学曲线失踪没有积累在细胞传感器电极记录。初始浓度(我)=M。看到的是曲线迅速到达高原,这是远低于。这表明进化的反应是可逆的,系统处于一个平衡状态: 没有绑定到电极平衡过程: 没有积累方程如下: 所需的参数和,在那里是没有绑定到电极的平衡常数。参数描述(的可逆性我)分解的存在没有绑定到电极。再多,吸附在电极上远小于的数量没有在溶液中(电极)的性质,,。由于实验曲线的近似(4)取得了以下值所需的速率常数:;(图2)。

3.1.2。分解(我)在0.05米磷酸缓冲pH值7.0。测量(我)集中使用分光光度法

吸收光谱的变化(我在这个实验)监控。吸收光谱在450 - 650纳米范围内记录每隔10 - 15分钟,记住的摩尔吸收灭绝(我在最大吸收点在这个范围- 450纳米(图3),我们建立了动力吸光度变化的关系(减少)底物浓度(图4)。已经建立,在厌氧条件下分解率的增加受到浓度的增加(我)(图4)。然而,在(我)吸收光谱的变化不仅由于没有组织进化的地方,但通过消除青霉胺配体(L)。假设消除从配体(我)和P₁产品,结果没有进化后(我可以建议),下面的反应机理: 获得的结果与传感器电极显示 ;。所需的参数。(我)和P₁spectrophotometrically难以区分,所以实验测量值吗。

相对应的方程组,反应计划: 通过解方程组使用动力学建模方法,速率常数(表所需的值1)已发现令人满意地描述图的曲线4(近似实线所示)。基于表1 (青霉胺配体的反应速率(淘汰我)有良好的精度决定。实验数据误差的价值,。

3.2。配位体交换(我)谷胱甘肽基于光谱光度测量的数据

在本文中,我们研究的相互作用(我与谷胱甘肽)。除了谷胱甘肽的重要性,这种选择也解释说,我们为了获得一个网卡产品相同的结构(我)(图1),但与谷胱甘肽硫羟配体,国际清算银行——(glutathione-2-thiolate) tetranitrosyl diiron (二世)。根据我们的数据,(二世(图)被证明是极其耐分解5)。我们使用0.05 Tris-HCl缓冲区作为溶剂由于同时进行样品的质谱分析。在磷酸缓冲,NIC(早些时候溶解17),磷酸频谱叠加剖面的测试样品的光谱多个峰值。所有氮气氛下进行了调查,因为没有及时与O₂和速率常数,产生氮氧化物 在25°C (26]。图5显示数据对吸收光谱的变化(二世)在溶液中,而图6(曲线1)显示了没有进化动力学HbNO的形成。

相比之下,同样的调查进行了(我)(图7,图6曲线3)。Hb演示了一个特定的吸收光谱,改变没有连接。因此,论文中描述(14,17]这类没有捐赠者,进化不可以追踪HbNO的形成。因为所有网卡在可见光谱吸收,缓冲区的实验记录差异吸收光谱测试系统和包含网卡Hb浓度相等。反应混合物的成分中所描述的实验。通过记录HbNO积累和吸收光谱的一部分组件,我们测量HbNO形成的动力学(图6)。使用以下方程:我们获得有效的一级速率常数(),这些反应(表中给出2)。它已经建立,没有进化而来(二世)近25倍慢于(我)(表2,图6),而吸收光谱(二世慢慢减少3.4倍比(我)(数据5和7)。反应计划包含(我)、谷胱甘肽(图8)的吸收光谱,其中的参数匹配的吸收光谱(二世)(图5),做了。最大限度的吸收增加发生在24小时内。同时产生的浓度(二世)(考虑到在315海里等于米⁻¹厘米⁻¹,图5)是米,而原来的浓度(我)是M;输出是76%。输出不能达到100%,因为(二世)衰变发生在平行和输出(二世)应该由平衡常数的比值(我)和(二世)。(Hb在场时我谷胱甘肽系统,HbNO积累平等的年代⁻¹(数据6曲线2);也就是说,没有输出率介于(我)hb(图6曲线3)和(二世)hb(数据6曲线1)系统没有进化从(我)和(二世)。

见图6曲线3,有些HbNO的痕迹(反应是由添加Hb)在时间为零,与初始浓度(我高)。这可以解释为,解散NIC(见实验)花了一定时间,~ 15分钟。部分分解释放没有发生在这段时间里,然后发现了新成立的HbNO在第一个记录的吸收光谱。原来的网卡解决方案(米)被冻结,确保一个NIC的解决方案相同的使用浓度。

3.3。质谱仪分析

Mass-spectral反应混合物的分析(我与谷胱甘肽(图)8、表3)执行。在分析的过程中产品的交互(我与谷胱甘肽(图)8)24小时孵化后25°C,这对应于最大的输出这些化合物(图之间的相互作用的产物8),(二世)阳离子检测。此外,光谱显示了一定的分解的产品(二世)、谷胱甘肽的氧化形式,GS-SG。因此,mass-spectral分析的结果的反应混合物(我)与谷胱甘肽定性对应光谱光度测量的研究中获得的数据。

4所示。结论

本文第一次表明,NIC硫醇的青霉胺配体(我)可逆版本没有和硫醇配体在水介质。这些一级反应速率常数测定。分解平衡(我)明显变化不需要消耗在反应细胞代谢功能的通用监管机构(1,2]。网卡的令人信服的证据表明,青霉胺配体(我)在溶液中存在的谷胱甘肽取代原硫羟和GS -配体,从而形成新的网卡,(二世),这是相当decomposition-resistant,如图所示。我们认为这可能影响的重要作用(我在生物转化),与抗肿瘤活性。thiol-Fe键的强度(二世)是令人印象深刻。它可能可以解释为谷胱甘肽是一种三肽和半胱氨酸与s组保税,位于谷氨酸和甘氨酸之间。这两种氨基酸可能“盾牌”Fe-S债券(二世)的袭击硫醇和水。

缩写

(我):	复杂的(铁2(SC5H11没有2)2(没有)4所以4h·52O
(二世):	Vomplex(铁2(SC10H17N3O6)2(没有)4所以4h·22O
网卡:	亚硝酰铁复杂。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

承认

本研究在经济上支持的RFBR(批准号13-03-00549)。作者要感谢a . v .丘季诺夫博士的准备程序的计算机处理吸收光谱的最小二乘法MathCad使用程序。

补充材料