文摘
对生态环境友好的和可靠的开发过程的合成纳米粒子已经吸引了相当大的兴趣在纳米技术由于其巨大的动力调节金属变成纳米他们潜在的使用对人类的好处。在这项研究中一个植物内生真菌,青霉菌sp,从健康的叶子中分离出来的姜黄(姜黄)受到细胞外生物合成的银纳米粒子对MDR (AgNps)和他们的活动大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。的biosynthesized AgNps优化研究和紫外可见光谱、傅里叶变换红外光谱(FTIR)和透射电子显微镜(TEM)。然后产生了AgNps对MDR进行测试大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。植物内生真菌的青霉菌sp.从健康的叶子c·巴隆(姜黄)被发现是一个很好的AgNps生产商。参数优化显示的最大吸光度在pH-7 420 - 425海里,与1毫米AgNO 25°C3浓度和15 - 20克湿生物质。进一步的TEM显示球的形成,说法纳米粒子与大小介于25 - 30 nm,红外光谱显示了乐队在1644和1538厘米−1绑定对应的振动酰胺I和II的蛋白质,分别。抗菌活性对MDR大肠杆菌和金黄色葡萄球菌显示出好的结果显示最大抑制区17毫米和16毫米,分别在80µL AgNps。
1。介绍
抵抗人类病原体的制药和生物医学领域的一大挑战。抗生素耐药性资料导致担心的出现和再度出现耐多药(MDR)的病原体1]。这些MDR病原体需要多种广谱抗生素治疗,不那么有效,毒性更强,更昂贵的(2]。因此,提高杀菌抗菌化合物或修改的发展潜力是一个优先级的研究领域在现代(3]。纳米技术是一个新兴领域,在科学技术中的应用为目的的合成和纳米材料在纳米尺度上的发展水平(4]。金属纳米粒子的使用是获得动力在目前世纪因其光学、电子和催化特性。利用和优化物理性质的纳米尺度的金属颗粒大光谱的研究已经集中控制大小和形状,在优化他们的身体是至关重要的,化学和光学性质(5- - - - - -7]。
各种技术,如化学、物理和机械技术,开发了金属纳米粒子做准备,因为这些方法都是昂贵的,有毒,nonecofriendly。绿色合成的纳米粒子与生物如植物和微生物来源的帮助下进行,因为它们对人类和环境的毒性要小(8]。不同类型的金属纳米粒子产生、铜、锌、钛(9)、镁、金(10),海藻酸(11),和银;的银纳米粒子(AgNps)已被证明是最有效的,因为他们有良好的抗菌功效对细菌,病毒和其他真核微生物(12]。研究人员正在向纳米颗粒尤其是新兴人类病原体的银纳米粒子来解决问题(13,14]。银纳米粒子更有效,因为高的表面积与体积比,这样大部分的银纳米颗粒是在直接接触他们的环境15]。利用真菌和细菌生物合成的银纳米粒子的各种研究已经证明(16,17];就是这样一个小团体的微生物的内生菌的潜在生物合成纳米颗粒完全没有被研究过。培根et al。18内生菌定义为“微生物殖民生活内部组织的植物没有造成任何直接、明显的负面影响,”而Strobel和他的同事们(19]建议的范围可以从互惠的关系近乎病原体。很少报道可在内生真菌被用于纳米粒子的合成。因此,在目前的研究中,我们使用了内生真菌青霉菌sp.从健康的叶子中分离出来的姜黄(姜黄)胞外生物合成的银纳米颗粒,其优化,和表征研究;获得单分散的银纳米颗粒对MDR的功效大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌株,进行了研究。
2。材料和方法
2.1。分离的内生真菌
健康的叶子姜黄(姜黄)收集的植物学、大学的古巴,古巴。树叶带到实验室运行下洗几次自来水和切成小块。这些作品被连续表面消毒冲洗到70%乙醇(C2H5哦),持续30秒,0.01%氯化汞(HgCl2)5分钟,0.5%次氯酸钠(NaOCl),并与无菌蒸馏水2 - 3分钟,然后在无菌条件下允许干燥。段的切割面放置在皮氏培养皿中(马铃薯葡萄糖琼脂)PDA补充硫酸链霉素(250μg / mL),在28°C的环境中3 - 4天,每天和监控发展的内生真菌菌落从叶段。增长从叶段分离的真菌和其他进入纯培养到PDA盘子。真菌分离是基于其形态和生殖字符识别使用标准识别手册(20.]。
2.2。细胞外的合成银纳米粒子
孤立的内生真菌,青霉菌sp,是生长在250毫升锥形烧瓶。大约100毫升的麦芽葡萄糖蛋白胨酵母(MGYP)肉汤21含有酵母提取物和麦芽提取物,0.3%,葡萄糖1%,蛋白胨,0.5%,25°C在静态位置。72 h后孵化广泛菌丝体生物量被过滤分离,然后用蒸馏水洗净去除媒体组件的痕迹。这个生物被带进烧瓶包含100毫升蒸馏水和孵化在同一位置48 h。暂停1号与绘画纸滤纸过滤,使用。进一步,真菌滤液混合水溶液AgNO31毫米的浓度的减少(20.]。
2.3。银纳米粒子生产优化研究
总有一个连续的生物体之间的相互作用和他们生活的环境。环境条件产生影响微生物的生长和发育。真菌的酶产量的影响条件下的生物培养(21,22]。因此,优化的研究将不仅支持良好的增长,而且提高产品产量。
2.3.1。AgNO效果3浓度
纳米颗粒的生产也依赖于底物浓度。AgNO的浓度3研究了从0.5到2.0毫米0.5毫米的差别。最优合成的纳米银浓度经紫外可见吸收光谱。
2.3.2。pH值的影响
pH值对经济增长有很强的影响和酶生产所需AgNps的生物合成。使用不同的pH值从4.0到8.0与1.0的差异研究pH值的影响对AgNps生产从植物内生真菌,青霉菌sp。
2.3.3。温度的影响
温度在所有反应中起着非常重要的作用。优化研究对温度进行温度从20°C到40°C的差异5°C植物内生真菌,青霉菌sp. AgNps生产。紫外可见吸收光谱的样品进行了分析,进一步研究了温度对纳米颗粒的影响。
2.3.4。生物量浓度的影响
生物量浓度的影响在细胞外合成研究了AgNps暴露5到20克的湿生物量的差异5 g的内生真菌青霉菌sp。生物合成的纳米银粒子在不同生物量浓度是紫外可见吸收光谱的特征。
2.4。银纳米粒子的表征研究
2.4.1。紫外可见光谱
形成初步证实了AgNps视觉观察颜色变化从苍白的到红棕色,进一步通过紫外可见光谱在不同的时间间隔。顶点的紫外可见光谱证实了银纳米颗粒的吸收范围在400到450纳米之间。
2.4.2。透射电子显微镜(TEM)
AgNps是由TEM表征(日立- h - 7500)知道纳米粒子的大小和形状。样本由drop-coating AgNps解决方案到碳涂层铜网格和被加载到一个标本夹。TEM显微图拍摄然后AgNps被确认的尺寸和形状。
2.4.3。傅里叶变换红外光谱(FTIR)
AgNps合成室温风干,进行红外光谱分析在500 - 4000厘米的范围−1。可能的生物分子负责减少、限制和有效稳定AgNps记录使用红外光谱分光光度计漫反射率模式。
2.5。纳米银的抗菌活性对MDR的分析大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌株
2.5.1。抗菌药物敏感性试验的临床分离株
收集临床分离株的诊断实验室的古巴地区和测试对不同抗生素敏感性通过接种细菌培养、孵化在37°C为5 - 6 h温和的浊度。草坪的病原菌制备营养琼脂板上用无菌棉签然后抗生素盘一直在草坪上无菌盘和孵化37°C 24 h,然后结果监控。
2.5.2。抗菌试验对MDR的银纳米粒子大肠杆菌和金黄色葡萄球菌
MDR抗菌试验完成大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌株使用琼脂扩散试验方法(23,24]。测试生物都生长在营养肉汤准备5 - 6 h草坪的MDR细菌在营养琼脂板用无菌棉签。琼脂井是在营养琼脂板使用凝胶穿刺和每一个满载着20μL, 40μL, 60μL, 80μL分别AgNps解决方案和孵化24小时37°C。抑制测量的区域。
3所示。结果与讨论
3.1。分离的内生真菌
表面消毒的叶段c·巴隆(姜黄)放置在PDA培养基和培养72 h。真菌从组织被带进纯培养,通过显微观察和形态学特征识别。研究表明,真菌青霉菌sp。1。
(一)
(b)
3.2。细胞外的合成银纳米粒子
真菌滤液与相同体积的1毫米AgNO治疗324小时孵化后的解决方案;外观颜色变化的灰色白色和棕色是一个明确的迹象的银纳米粒子的形成反应混合物。颜色的强度提高孵化期的人物2。棕色的出现是由于表面等离子体激发的振动(25]。
3.3。银纳米粒子生产优化研究
环境条件深刻调节真菌的生长和新陈代谢。培养条件的关键部件,直接影响生产率和经济过程。物理参数的优化将不仅支持良好的增长,而且提高产品产量(26]。生长条件,如底物浓度、pH值、温度和接种体大小,直接监测率反映了AgNps的合成的酶活性。
3.3.1。AgNO效果3浓度
生物合成与不同浓度的硝酸银溶液AgNps 0.5毫米到2毫米与真菌滤液进行了研究。最适底物浓度是预测1毫米的颜色变化和紫外可见光谱的最大吸收峰的425 nm数字3。当AgNO3浓度增加到2毫米粒度可能增加由于大型银纳米粒子的聚合(27]。我们的结果与Banu et al ., (25使用1.0毫米AgNO3使用真菌对AgNps的生产根霉stolonifer。
3.3.2。pH值的影响
生物合成AgNps由于不同不同pH值的影响从4到8的内生真菌青霉菌sp.如图4通过紫外可见吸收光谱。最大峰值显示ph - 7.0约为425纳米的纳米颗粒大小范围10至100海里。相反的pH值下降到4.0没有任何高峰。在低pH值、蛋白质结构影响,蛋白质变性,失去活动;因此,纳米粒子的聚合是观察到的28]。它可以得出的结论是,蛋白质分泌Penicillumsp. AgNps的解决方案限制在pH值- 7.0时是稳定的,但不是在酸性pH值可归因于限制蛋白质的稳定性。我们的结果与Banu et al。25,28),显示最大吸收峰在422 nm ph - 7.0和耆那教等。29日),用答:flavus在ph - 7.0。
3.3.3。温度的影响
温度影响AgNps生产是一个重要的因素。不同的温度对AgNps生产的影响通过内生真菌,青霉菌sp,在不同的温度下进行从25°C到45°C 5°C的差异了解银离子减少的现象。的最大生产AgNps出席25°C通过颜色的变化在12 - 14 h更快相比与其他温度也被紫外可见吸收光谱的最大峰值在390海里这表明AgNps[的生产16,29日]。另一方面在高温下40°C,酶活性得到低的合成减慢AgNps反应图5。
3.3.4。生物量浓度的影响
细胞外的合成AgNps由暴露5 g - 20 g的湿生物质与5 g的内生真菌的区别青霉菌AgNO sp. 1毫米的水溶液3。紫外可见吸收光谱代表15和20克的湿生物质显示了最大峰值在410海里没有扩大或吸光度的红移;粒子分离没有结块,是由于酶的可用性是充分的生产的纳米银粒子在pH-7和温度25°C图6。我们的结果与Sunkar和Nachiyar[的报告30.]在他们用健康叶内生真菌分离的藤黄属植物xanthochymus和Aravae lanataAgNps的合成。
3.4。银纳米粒子的表征研究
3.4.1。紫外可见光谱
AgNps利用内生真菌的细胞外合成青霉菌sp.包括bioreduction滤液中的银离子。反应溶液被定期监控以固定时间间隔采样的反应混合物用紫外可见光谱。合成AgNps显示最大吸收峰在420 nm数字7。AgNps形成非常稳定的120 h后的反应。AgNps特征,证实了TEM分析。也观察到类似的结果Ninganagouda et al ., (24]透露AgNps 380至450海里的等离子体共振和Sunkar Nachiyar, (31日]显示吸收峰在400 nm和423 nm内生真菌分离叶片的样本藤黄属植物Xanthochymus和Aravae lanata。
3.4.2。透射电子显微镜(TEM)
TEM测量进行了确定AgNps的形态和形状。TEM显微照片图8显示没有凝聚粒子是球形和分散。AgNps合成粒径的内生真菌青霉菌sp.范围从25到30 nm。细胞外的各种报告提供了证据合成的AgNps TEM图像。Ganachari et al。32]报道均匀球面形状AgNps 30纳米的范围青霉菌diversum和Raheman et al。33还揭示了球形和polydispersive AgNps从10到40 nm,植物内生真菌Pestalotia sp。从叶子中分离出来的气味清香cumini。(Banu et al。25]显示球面形状AgNps,大小介于3和20海里根霉stolonifer。
3.4.3。傅里叶变换红外光谱(FTIR)
红外光谱测量干和粉样品进行了识别可能的银和生物活性分子之间的相互作用,这可能是负责AgNps合成和稳定。红外光谱谱显示八个乐队在1074,1233,1393,1454,1538,1644,2933,3290厘米−1图9。乐队在1644、1538和3290厘米−1对应绑定的振动酰胺我和二酰胺乐队的蛋白质,分别与h伸展,而2923厘米−1代表碳氢键的伸缩振动。观察到的乐队在1393、1233和1074厘米−1可以分配给碳氮伸展振动芳香族和脂肪族胺,分别。观察表明,蛋白质分子不仅作为还原剂,也可以作为稳定剂通过绑定AgNps自由氨基酸组或半胱氨酸残基或通过静电吸引带负电荷的羧酸盐组织细胞外酶滤液从真菌菌丝34]。
3.5。分析对MDR AgNps的抗菌活性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌株
3.5.1。抗菌药物敏感性试验
抗生素敏感性试验是由使用不同抗生素的光盘大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。为大肠杆菌应变等抗生素光盘阿米卡星(AK),诺氟沙星(NF) Pefloxacin (PF)、环丙沙星(CI),头孢呋辛钠(CR)、氧氟沙星(的)、萘啶酸(NA)、庆大霉素(GM)、头孢噻肟(CX)、头孢他啶(CZ),头孢曲松钠(FR),头孢克肟(外汇),Cefdinir (CN),和呋喃妥英(AT)被使用,其中只有阿米卡星(AK)显示敏感地带15毫米,对其他抗生素的抵抗能力的人物10(a)光盘的环丙沙星(CI),头孢呋辛钠(CR)、氧氟沙星(的),青霉素(PG),阿莫西林(AX),阿莫西林+克拉维(AC)、复方磺胺甲恶唑(CT),头孢氨苄(CP)、头孢唑啉(CF)、红霉素(ER),氯霉素(CK)、哌拉西林(PC),阿奇霉素(AZ)和四环素(TE)被用于金黄色葡萄球菌;意外只有氯霉素(CK)显示灵敏度金黄色葡萄球菌图18毫米的抑制区10(b)。
3.5.2。抗菌试验对MDR的银纳米颗粒大肠杆菌和金黄色葡萄球菌
抗菌试验biosynthesized AgNps对MDR致病性菌株(临床分离株)进行了研究大肠杆菌和金黄色葡萄球菌用琼脂扩散法和抑制区是描绘在图10(B)和表1)。AgNps与不同浓度的解决方案是加载到井20μL, 40μL, 60μL, 80μL,分别大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。结果显示,对MDR AgNps最有效大肠杆菌。它是80年17毫米μL浓度。对于耐多药金黄色葡萄球菌,然而,AgNps显示16毫米的温和增长的抑制作用即使在高浓度的80μL MDR相比大肠杆菌压力。相似的影响大肠杆菌和金黄色葡萄球菌致病菌株被金正日观察et al ., (35和也Ninganagouda et al。24)报道,良好的抗菌活性大肠杆菌利用AgNps合成了黄曲霉。由于滥用抗生素微生物对许多的抗生素产生了耐药性,因此耐多药菌株涌现。一个好的替代来源是环保的和成本有效的只有通过AgNps因为他们的抑制和杀菌效果。
4所示。结论
人类病原体耐药性的发展是在制药和生物医学领域的一个挑战。抗生素耐药性资料导致担心MDR病原体的出现和再度出现。开发或修改提高杀菌抗菌化合物可能是一个优先的领域在这个现代。纳米技术提供了一个良好的平台,修改和开发纳米结构在各领域的应用前景。因此,植物内生真菌,青霉菌sp,从健康的叶子中分离出来的姜黄(姜黄)被发现是一个很好的生产商AgNps依然没有纳米颗粒生产除了丰富的次生代谢产物的来源。这些AgNps对MDR被证明是强大的武器e .线圈和金黄色葡萄球菌面部。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。