文摘
利什曼虫amazonensis是皮肤和分散的利什曼病的病原体通常与耐药有关。拉帕醇[2-hydroxy-3 - (3′-methyl-2-butenyl) 1, 4-naphthoquinone]显示广泛的抗菌性对许多病原体。在这项研究中,使用经典的微观在体外模型,我们分析了一系列拉帕醇的影响和氯化物复合物锑(V), (V)、铋、锡(IV)l . amazonensis。所有7个化合物antileishmanial展出活动,但大多数(V)锑和铋(V)复合物对人类有毒HepG2细胞和小鼠巨噬细胞。最好的集成电路50值(0.170.03和0.100.11g / mL)观察锡(IV)复合物(3)((Lp) (Ph值3Sn)和(6)(Ph值3SnCl2),分别。他们选择索引对HepG2细胞(SIs)分别为70.65和120.35,分别。然而,尽管分析小鼠巨噬细胞,如果降低了。这些化合物是适度对HepG2细胞毒性对小鼠巨噬细胞和有毒,还是潜在的需要这类化合物的化学改性。
1。介绍
利什曼虫amazonensis,一个新的世界物种,已被确定为一个dermotropic物种通常与耐药相关(1]。当前antileishmanial疗法是有毒的人类和一些简单的失败2,3]。在美洲,在六年了,肠外的五价锑的政府(Sb-V),钠stibogluconate (Pentostam)和葡甲胺antimoniate (Glucantime)已被用于治疗利什曼病。在锑的阻力是常见的地方,比如印度,其他化疗治疗包括两性霉素B和喷他脒(2,4]。因此,缺乏低毒性和安全的口服药物仍然凸显了需要新的antileishmanial化合物。
拉帕醇,[2-hydroxy-3 - (3′-methyl-2-butenyl) 1, 4-naphthoquinone](图1)是一种天然化合物提取紫葳科树木的核心。在利什曼虫、拉帕醇类似物、衍生品和复合体由几组进行测试。拉帕醇、isolapachol和他们的一些衍生品是活跃在体外和在活的有机体内对利什曼虫braziliensis和l . amazonensis分别为(5]。铋(ⅲ)、锑(V)和锡(IV)复合物是活跃的反对幽门螺杆菌,利什曼虫主要,杜氏利什曼虫分别为(6- - - - - -8]。
双功能金属复杂的设计,配体和金属发挥药理作用,是一种很有前途的战略实现更有效和选择性药物。在目前的研究中,拉帕醇是加上三个不同的金属:三苯基锡(IV), triphenylbismuth (V)和triphenylantimony (V),我们已经测试了在体外活性和细胞毒性的合成锑(V), (V)、铋、锡(IV)拉帕醇对细胞内和氯配合物l . amazonensisHepG2细胞和小鼠巨噬细胞。
2。材料和方法
2.1。拉帕醇合成的金属配合物和测试金属氯化物
(Lp) (Ph值3Bi) O0.5 和(Lp) (Ph值3某人)哦(2)配合物合成了以下描述的过程(9]。准备(Lp) (Ph值3Sn) (3)使用相同的程序。三乙胺(70μL)添加到拉帕醇的混合物(0.121克,0.5更易)和三苯基锡(IV)氯(193毫克,0.5更易)在氯仿(20毫升)。由此产生的混合物在室温下搅拌4 h。去除溶剂在真空下产生的固体材料。材料随后在水中溶解在丙酮和沉淀。反应过程中形成的盐酸triethylammonium被水溶解和删除。元素分析进行了使用优秀的240元素分析仪。原子吸收分析铋、锑、锡的内容上进行了日立原子吸收分光光度计(8200型)。
下面的方程可以提出说明(Lp) (Ph值的形成3某人)哦,复杂的如下:
相同的过程可以提出复合物。收益率、熔点、元素的化合物有较好的分析表1。
二氯化Triphenylbismuth (4)、二氯化triphenylantimony (5),氯化三苯基锡(6)和拉帕醇(7从奥尔德里奇)获得。三乙胺是来自σ。所有测试化合物的预测结构如图所示1。
2.2。寄生虫
世界卫生组织(世卫组织)参考应变l . amazonensis(IFLA / BR / 1967 / PH8)使用和类型如前所述10]。Promastigote形式增长25°C M199介质(σ)补充heat-inactivated 10%胎牛血清(Cultilab), 40更易与L玫瑰(Amersham), 0.1 L更易与腺嘌呤(σ),0.0005%氯高铁血红素(σ),0.0002%的生物素(σ),50单位/毫升青霉素,链霉素50毫克/毫升(表达载体)11]。
2.3。在体外经典微观测试
动物被关在动物设施的Centro de尽管Rene Rachou / FIOCRUZ严格按照指南的护理和使用实验动物(12]。批准的程序内部在动物实验伦理委员会(CEUA) of Fundacao Oswaldo Cruz (FIOCRUZ),巴西(协议L-042/08)。小鼠安乐死与有限公司2在一个巨噬细胞清除前感应室。Balb / c小鼠腹腔注射2毫升3%巯乙酸钠介质。72 h后,腹膜巨噬细胞被洗冷RPMI 1640中型和丰富了坚持圆玻璃盖玻片(13毫米)放置在一个4文化板块。细胞(2×105细胞/)培养(37°C, 5%的公司2,18 h)与10% heat-inactivated RPMI补充的边后卫(胎牛血清)之前感染寄生虫。巨噬细胞暴露在固定相promastigotes (2×106/)最后一个比1:10。板块在37°C,孵化有限公司5%2,5 h在BOD允许内化的寄生虫13]。然后,剩余的媒介被noninternalized寄生虫。负控制包括只被感染的巨噬细胞和介质。孵化项目测试在两个独立的重复实验(14,15]。物质与RPMI 1640系列稀释介质补充的边后卫在五个不同浓度为10% (50→3.1μg / mL)。化合物(3)和(60.016),稀释10→μ克/毫升。两性霉素B药物被用来作为参考。感染巨噬细胞暴露在日常化合物连续3天。这一时期之后,收集盖玻片,沾展示全景的(Laborclin),然后安装与Entellan(默克公司)玻璃幻灯片。
2.4。细胞毒性测试
细胞谱系HepG2 A16源自人类肝癌细胞系HepG2(写明ATCC hb - 8065)和来自美国类型文化集合线(写明ATCC) [16]。Balb / c小鼠腹腔巨噬细胞获得如上所述。细胞毒性测定使用MTT法(3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyl溴化四唑)(σ)。HepG2细胞保存在RPMI中补充10%的边后卫和汇合的单层膜使胰蛋白酶化,RPMI洗,转移到96 -微量滴定板(4×104细胞/)16 h。小鼠巨噬细胞被用于2×10浓度5细胞/在96 -微量滴定板。不同浓度的化合物系列稀释(10→0.16毫克/毫升)。在两个测试中,介质被,化合物孵化24 h (37°C, 5%有限公司2)。与MTT比色反应是发达后孵化(37°C, 5%的公司24 h)和增加酸化异丙醇(17]。反应是读spectrophotometrically (Spectramax M5、分子器件、旧金山,CA)和一个570纳米过滤和670海里的背景。孵化项目在两个独立的实验测试了一式三份。最低剂量50%的细胞死亡(MLD)50)确定18),和值绘制生成剂量反应曲线使用Microcal起源软件(北安普敦,妈,美国)15,19]。化合物的选择性索引(SIs)使用MLD计算50/集成电路50比率对HepG2和腹膜巨噬细胞20.,21]。
3所示。结果
的在体外经典微观测试允许直接计算确定感染细胞的百分比和/或无鞭毛体的数量(22]。在这里,集成电路50值计算百分比的基础上被感染的巨噬细胞(15]。的在体外antileishmanial活动、细胞毒性和拉帕醇的选择性索引(SIs)金属配合物和氯化物(1- - - - - -6)、拉帕醇(7)和两性霉素B表所示2。拉帕醇和化合物,(2)和(5(IC)被认为是无效的50> 10μg / mL)和有毒(SI20)对HepG2细胞和巨噬细胞(20.,21]。锡(IV)拉帕醇复杂(3)和氯(6对细胞内无鞭毛体形式的)活跃l . amazonensis(数据2(一个)和2 (b)(SIs)和更少的有毒HepG2细胞从70.65到120.35)(数据2 (d)和2 (e))(表2)。一个三苯基氯化铋(4)(图2 (c))也积极对HepG2细胞毒性(图2 (f))比(3)(图2 (d))和(6)(图2 (e)(SI) = 34.03)。所有化合物都是有毒的小鼠巨噬细胞(SI < 20)。两性霉素B, antileishmanial参考药物,表现出一个集成电路50价值大约四倍高于(3)和(6)(μg / mL)(表2)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
4所示。讨论
Leishmaniases认为世卫组织作为全球主要的六个重要的传染病之一。在过去的几年中,没有新药的研究和开发针对疾病影响人们在发展中国家已经成为全球关注(23]。目前,新药的发展,组合,或协议对热带和被忽视的疾病是非常重要的在公共卫生24- - - - - -27]。然而,副作用,治疗失败由于寄生电阻,艾滋病毒合并感染,静脉管理的主要问题是阻碍利什曼病化疗(2,3]。
拉帕醇衍生物和复合物表现出抗肿瘤,抗炎,抗血管新生,镇痛,抗菌性6,28- - - - - -32]。拉帕醇及其类似物展示活动在体外对原虫和l . amazonensis(5]。金属配合物的使用利什曼虫可能代表一个潜在的选择对疾病由于antimony-based方案往往非常有毒。在这种情况下,我们已经探索出拉帕醇的使用和氯化锑(V)金属配合物,(V)、铋、锡(IV)]l . amazonensis。
先前的研究的数据相比,拉帕醇(7)没有表现出显著的antileishmanial活动l . amazonensis(与μg / mL) (5]。这种集成电路50观察到的值接近原虫(μg / mL)。这种差异可以归因于的压力l . amazonensis使用(MHOM / BR / 77 / LTB0016)和实验条件。对细胞内的抗增殖活性最高l . amazonensis观察氯化锡(IV)拉帕醇复合物(3)和(6)(数据2(一个)和2 (b))和一个(V)氯化铋化合物(4)(图2 (c))。更重要的是,化合物(3)和(6)比两性霉素B更积极和更少的毒性在所有物质测试在使用HepG2细胞(SIs的70.65和120.35,分别地。)。有趣的是,生成的化合物的拉帕醇、锡(IV)显示显著降低金属毒性比单独拉帕醇(SIs为70.65和13.03,分别地。)。的可能性可以证明这种现象可能是由于增加的亲油性lapachol-complexed分子。另一个假设是,拉帕醇络合可能影响化合物的氧化还原电位,因此,因此改变其活动。符合这个想法,这些活动的机制与活性氧自由基的生成(罗斯)诱导的bioreduction醌型的核通过特定的酶和氧(33- - - - - -35]。ROS机制引起的拉帕醇已经与化疗对许多原生动物等活动鲁兹锥体(30.)和肿瘤细胞(31日]。同样,在所有金属氯化物质,三苯基氯化锡(IV)化合物表现出较低的毒性比铋(V)和氯化锑(V)的。最后,化合物(4)表现出温和的毒性与IC (SI = 34.03)50值7倍高于两性霉素b。然而,对小鼠巨噬细胞的细胞毒性测试时,宿主细胞利什曼虫,所有的化合物都是有毒的。这些数据表明化学修改的需要这类化合物在搜索小说antileishmanial分子。
5。结论
拉帕醇以及一系列的氯化六拉帕醇,金属配合物已经评估的在体外对细胞内无鞭毛体形式的活动l . amazonensis。锡拉帕醇(IV)和氯配合物(3和6)表现出更高antileishmanial活动相比,两性霉素b的三苯基(V)铋化合物(4)也表现出antileishmanial活动和适度的细胞毒性。拉帕醇化合物(V)和锡铋(IV)没有对HepG2细胞毒性与单独拉帕醇相比。总之,锡,在较少的程度上,铋复合物是中度毒性对小鼠巨噬细胞HepG2细胞毒性。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突的存在。
金融支持
作者收到以下基金。
确认
r·p·苏亚雷斯c . Demicheli f . Frezard, m . n .梅洛支持巴西的国家的发展研究委员会(CNPq) (305042/2010-6, 303866/2010-1, 303046/2009-1)。支持m . n .罗查CNPq (142361/2009-7)。这项工作是由Fundacao德帕罗尽管做Estado de米纳斯吉拉斯(FAPEMIG) (apq - 00197 - 11, apq - 01123 - 09年,PRONEX, ppm - 00382 - 11)。作者想感谢博士黛博拉Sullivan-Davis审查。