文摘
chromium-resistant真菌隔离受污染的空气与工业蒸汽可用于减少有毒铬(VI)铬(III)。本研究分析使用的细胞进行体外减少六价铬自由提取(s)的真菌特征基于最佳温度,pH值,使用电子给体,金属离子和初始铬(VI)浓度在反应混合物。这显示最高活动37°C和pH值7.0;有增加铬(VI)还原酶活动的NADH作为电子供体,它被汞柱高度抑制2 +、钙2 +和毫克2 +叠氮化、EDTA、KCN。
1。介绍
铬(Cr)毒性是环境污染的主要原因之一来自制革厂废水。这种金属用于皮革和皮革的鞣制,制造不锈钢、电镀、纺织印染和用作杀虫剂的冷却水核电站,导致铬排放造成环境问题(1]。Cr存在于九从−2 + 6价状态。这些国家中,只有六价铬铬(VI)和三价铬(铬(III))主要环境意义,因为他们是最稳定的氧化环境中的形式(2]。两者都是发现在不同的水和废水的尸体(3]。铬(VI)通常存在于这两种形式之一:铬酸()或重铬酸(),这取决于溶液的pH值(3]。这两个二阶oxyanions非常水溶性差被土壤吸附有机物,使它们移动在土壤和地下水2]。铬酸盐阴离子代表急性和慢性动物和人类健康风险,因为他们都是有毒物质,诱变,致癌、致畸4]。铬(VI)形式相比,铬(III)的物种,主要是氢氧化物、氧化物,或硫酸盐,水溶性较低,移动更少的有毒(100倍)5),(少1000倍)诱变6]。主要技术恢复或删除铬(VI),从废水化学还原沉淀,活性炭吸附,离子交换,反渗透,在基本培养基(7]。然而,这些方法有一定的缺点,即高成本,低效率,和一代的有毒污泥或其他需要处理的废物和意味着操作的复杂性8]。
这些方法的另一种选择是由微生物重金属污染物的去除。金属切削能力的微生物,包括细菌(2,6,8,9),微藻(7,10)和真菌(1,11),已被广泛的研究。真菌,总的来说,是众所周知的能力biosorb和生物蓄积金属(1,11,12),也被报道参与减少(生物转化)的铬(VI)铬(III)形式(11- - - - - -13]。常见的铬(VI)解毒机制报道Cr-resistant周质的生物吸附和微生物细胞内生物体内积累和通过直接酶生物转化反应14,15与代谢物)或间接(16]。在防铬(VI)丝状真菌,如拟青霉属(13),曲霉属真菌和青霉菌(17),而木霉属(18通过转换)、铬(VI)解毒铬(VI)的铬(III)形式观察由于细胞新陈代谢过程基于碳源的还原能力。另一方面,bioreduction铬(VI)已经在几个细菌种类包括了假单胞菌sp。19),大肠杆菌(20.),芽孢杆菌sp。21),脱磷孤菌属sp。22),小细菌属sp。23),而Shewanellasp。24),一些真菌答:尼日尔和答:寄生(11),拟青霉属(13),镰刀菌素sp。25),拟青霉属lilacinus(26),而Hypocrea塔洼村(27),和酵母假丝酵母maltosa(28),毕赤酵母属sp。29日),假丝酵母utilis(30.]。直接微生物减少铬(VI)铬(III)是最有前途的实践证明了生物修复的权宜之计。
本研究的目的是分析体外降低铬(VI)的细胞自由提取青霉菌sp.耐铬(VI)。
2。实验
2.1。微生物和文化条件
chromate-resistant丝状真菌是隔绝空气污染与工业蒸汽、化学科学学院附近,位于圣路易斯波多西,墨西哥,在培养皿中包含修改李的基本培养基(LMM, (31日))(KH的0.25%2阿宝4,0.20% MgSO4,0.50% (NH4)2所以4、0.50%氯化钠和0.25%葡萄糖)补充500 mg / L K2阴极射线示波器4;介质的pH值调整和维持在5.3 100更易与L citrate-phosphate缓冲区。文化是在28°C的环境为7天。压力被确定基于其形态结构等颜色,菌丝直径和显微观察孢子的形成(32]。真菌生长在文化thioglycolate肉汤被用作主要的培养液。
2.2。铬(VI)的静息细胞减少青霉菌sp。
文化的悬浮液青霉菌sp.增长了4天在100毫升thioglycolate肉汤(pH值7.0)和在3000×g离心收获而在4°C;细胞颗粒(10毫升)获得在离心与100毫米洗两次磷酸钾缓冲(pH值7.0)和resuspended相同的缓冲区。一式三份的悬浮细胞颗粒与铬(VI)浓度的上升2 - 10毫克/ 100毫升,涡30分钟,孵化30°C 6 h。Heat-killed(2毫升)文化丸被用作控制。6小时孵化后,离心管,和100年µL整除退出每个样本来估计剩下的铬(VI) 1, 5-diphenyl carbazide (DPC)方法(33]。
2.3。铬(VI)的Permeabilized细胞减少青霉菌sp。
细菌培养的青霉菌sp.增长了4天,收获,用磷酸钾缓冲(pH值7.0)如上所述。暂停文化丸治疗0.2% (w / v)钠十二烷基硫酸盐,80二层的0.2% (v / v),特里同x - 100年的0.2% (v / v)和0.2%的甲苯(v / v),通过涡流30分钟达到细胞透化作用。Permeabilized细胞悬浮液(0.5毫升)然后添加2 - 10毫克/ 100毫升的铬(VI)作为最终的浓度和孵化6 h在30°C。实验每组透化作用治疗和铬(VI)浓度进行了一式三份。
2.4。准备的无细胞提取物
无细胞提取物(CFE)青霉菌sp.准备通过修改以前公布的协议(34]。真菌悬浮液增长了4天在400毫升thioglycolate肉汤收获在4°C 3000×g 10分钟,洗,resuspended 100毫米磷酸钾缓冲(pH值7.0)。文化颗粒从而获得resuspended在5% (v / v)的原始文化在100毫米磷酸钾缓冲体积(pH值7.0)。这些细胞悬浊液放在冰浴和中断使用超声波迷你珠搅拌器探针(Densply)和15个周期为每一个60秒的。用近从而获得当时离心机在3000 g×10分钟在4°C。100毫米的颗粒是resuspended磷酸钾缓冲(pH值7.0,这是CFE)。
2.5。铬酸盐还原酶测定
铬酸酶降低使用标准曲线估计如前所述的铬(VI)[0 30毫米34]。分析混合物被修改的描述在先前的研究34]。反应系统(1.0毫升)是由不同铬(VI)的最终浓度(5 - 30毫米)700年µL 100毫米磷酸钾缓冲(pH值7.0)添加250µL整除的CFE减少铬酸和50µL NADH。1.0毫升的系统体积保持不变实验。
铬酸盐还原酶活性测定在不同的pH值37°C使用多个缓冲区(100毫米phosphate-citrate, pH值5.0;磷酸50 mM, pH值6.0 - -8.0,50 mM TRIS-HCl, pH值8 - 9)。温度的影响,研究了通过测量铬酸还原酶活性在不同的孵化温度20至60°C,在pH值最优。CFE样本也处理一些金属离子最终浓度1毫米的最佳pH值和温度;Na+、钙2 +、铜2 +、汞2 +、镁2 +、Cd2 +,菲3 +测试通过使用10毫米Na的解决方案2所以4,CaCl2,CuCl2,HgCl2,MgCl2,CdCl2,FeCl3。电子给体测试的NADH、葡萄糖、乙酸钠、甲酸,柠檬酸,胱氨酸、乳酸、抗坏血酸在最后一集中1毫米,和抑制剂EDTA, KCN, NaN3,β巯基乙醇的浓度。单位为铬酸还原酶酶活性是派生的酶量减少1更易与铬(VI)每分钟37°C。具体活动被定义为单位铬酸还原酶活动每分钟每毫克CFE的蛋白质浓度。蛋白质浓度估计使用Lowry方法(35]。
3所示。结果与讨论
3.1。除铬(VI)的静息细胞青霉菌sp。
真菌是权宜之计的静息细胞减少清廉毫克/ 100毫升铬(VI)浓度如图8个小时1。除真菌在53%和70%之间(2 - 10毫克/ 100 /毫升)的金属,和这些结果与报道答:尼日尔和答:寄生(11]腐皮镰孢霉菌(25),拟青霉属lilacinus(26),细菌假单胞菌sp。19]。biosorbent包括细胞支持的结构属性和其他几个因素会影响生物吸附率(36]。
3.2。铬(VI)的Permeabilized细胞减少青霉菌sp。
细胞透化作用增加了铬(VI)静息细胞减少,随着permeabilized细胞Triton x - 100可以减少57%,甲苯52% SDS 47.4%, 80年补间,40.4%(图230毫米)的铬(VI)在6 h,建议减少铬酸的高效的细胞内机制。CFE的铬(VI)还原酶活性细胞生长在无铬(VI)是94.07µmoles /分钟/毫克的蛋白质。这些结果表明,Cr (VI)还原酶与CFE相关联。真菌、酵母和细菌铬酸还原酶已经在CFE的本地化答:尼日尔和答:寄生(11),毕赤酵母属jadiniiM9,毕赤酵母属是M10 [37),毕赤酵母属sp。29日),和芽孢杆菌sp。21),胞质部分c . maltosa(28),毕赤酵母属sp。29日),而Pannonibacter phragmitetus(38)和膜分数假单胞菌sp。G1DM21 [19),芽孢杆菌megaterium(39),而肠杆菌属下水道(40]。
3.3。pH值对铬酸还原酶活性的影响
铬酸盐还原酶的功能青霉菌sp.在不同的特点在体外条件。定义最佳pH值、铬(VI)还原酶化验进行磷酸钾,磷酸柠檬酸,Tris-HCl缓冲区微分pH值范围;不同的缓冲区使用磷酸钾缓冲显示pH曲线的特征酶活性的最佳pH值7.0,如在图所示3,这些结果与报道的真菌答:尼日尔和答:寄生(11)和酵母p . jadiniM9 [37]。其他作者报道稳定在7.0和7.4之间的细菌假单胞菌sp。G1DM21 [19),6.5和7.5大肠杆菌《(41),在5.0至8.0的范围芽孢杆菌sp。42]。
3.4。温度对铬酸还原酶活性的影响
Cr (VI)还原酶的最适温度为活动是37°C,但还原酶活性显著改变在20°C抑制(39%),但当化验在50°C的温度下进行还原酶活动我们发现14.2%的抑制4。为p . jadiniiM9,孵化55°C生产活动的减少55%37]。在p是当孵化8°C时,观察活动减少25%,在50°C的活动是50%。为答:尼日尔和答:寄生(11),假单胞菌sp。G1DM21 [19),大肠杆菌(41),而芽孢杆菌sp。cf (42),30°C的热稳定性是(41,42]。相反,假单胞菌putidaCFE探测更强的抵抗力,保持其稳定50°C (43]。
3.5。不同的金属阳离子对铬酸还原酶活性的影响
不同的金属阳离子的影响在铬酸盐还原酶的活性青霉菌sp.决心,表现出图5。测试所有的金属离子抑制CFE的铬(VI)还原酶活性与铜的12%2 +与钠和40.2%+,这些比酵母报告的结果是不同的p . jadiniiM9铬酸还原酶因为只有铜2 +和钠+生产活动的增加30%和63,分别为(37),和所有其他离子测试有抑制作用,但在不同的水平。减少56.5%的观察与汞柱2 +,而添加毫克2 +、铁3 +、钙2 +和光盘2 +导致活动减少40%和51%之间。在p是M10铬酸还原酶,只有铜2 +了提高31%的活动。抑制了Hg2 +是高p是和假单胞菌sp.比青霉菌sp.活动下降85%和90%,分别为(19,37]。抑制由Ca2 +和毫克2 +大约是50%,而铁吗3 +活动减少了32%。这些结果同意那些报道节细菌属crystallopoietes(44),而芽孢杆菌sp。42]。另一方面,抑制了Hg2 +可以与sh配体的亲和力,然后怀疑这种化学物质的存在组酶的活性部位与铬酸盐还原酶活性(44]。
3.6。不同的电子给体对铬酸还原酶活性的影响
还原酶活性增加的补充反应混合物与电子给体。所有的电子给体分析增加了活动,和最有效的抗坏血酸,NADH、葡萄糖、柠檬酸,4.4,4.0,2.9,和2.87倍,分别(图6),这些结果与报道的酵母p . jadiniiM9和p是铬酸盐还原酶和NADH (37),假单胞菌sp.与柠檬酸酯、葡萄糖和甲酸(19]。在以前的报告芽孢杆菌sp,葡萄糖报道作为电子供体,并通过增加铬(VI)减少(45,46),还有formate-dependent铬(VI)还原酶已经被报道Shewanella putrefaciensMR-1 [47]。我们的工作支持其他研究报告NADH或NADPH-dependent酶减少铬(VI)在有氧条件下(19,20.,37,42,43]。根据Ramirez-Diaz et al。48],NADH氧化铬酸还原酶酶,将一个电子的电子转移到铬(VI)减少中间形式,Cr (V),最后接受两个电子从其他有机物质生产铬(III)。
3.7。不同的呼吸抑制剂对铬酸还原酶活性的影响
呼吸抑制剂如叠氮化(1毫米),EDTA(1毫米)和氰化物(1毫米)造成压抑的48%,47%,和32%,分别为(图7)、铬(VI)还原酶活性;这些结果证实了先前的研究,所得结果与观察,氰化物和叠氮化铬酸部分抑制纯化还原酶大肠杆菌(写明ATCC 33456 19日20.铬酸)和有氧减枯草芽孢杆菌(49)和抑制超过50%的膜铬酸还原酶的活性有关美国putrefaciensMR-1 [49]虽然没有观察CFE的抑制芽孢杆菌sp。ES29 [44]。呼吸抑制剂作用于新创蛋白质合成或影响呼吸链中间体负责减少铬(VI)、中铬(VI)作为一个终端电子受体(43]。
4所示。结论
本研究分析了一种非常有效的铬(VI)还原酶青霉菌sp。铬酸还原酶化验的无细胞提取物(CFE)显示高铬(VI)还原酶的活动。铬(VI)的还原电位静息细胞增加了细胞透化作用。最佳温度和pH值的铬酸还原酶活性的细菌被发现37°C和7.0,分别和活动是增强在0.1毫米的NADH和其他电子给体。1更易与铜等金属离子2 +,Na+、汞2 +、镁2 +、铁3 +、钙2 +和光盘2 +和呼吸抑制剂导致减少的活动。最后,较高的铬(VI)的结果减少CFE,铬(VI)的功能,显示一个潜在的应用青霉菌sp.铬(VI)生物修复。