文摘
Alginate-gelatin混合凝胶应用于固定化漆酶等一些合成染料脱色结晶紫。固定化过程是通过添加海藻酸凝胶溶液含有酶和随后的一滴一滴地添加混合搅拌CaCl2解决方案。获得的数据表明,固定化和自由酶是在50°C下结晶紫,但裹入酶显示更高的热稳定性比游离酶。在pH值8所代表的固定化酶最佳脱色。可重用性的裹入漆酶也研究和结果显示ca。85%活动后保留五个连续的周期。最好的去除条件申请其他七个合成染料的脱色。结果表明,最大和最小染料去除与氨基黑10 b和伊红,分别。
介绍
在化学过程改善了传统方法在过去的几十年,广泛受到关注替代技术,利用酶包括优秀的特点,如高活动,选择性和特异性。此外,酶在温和条件下的pH值,压力和温度提出了它们作为候选人合适催化剂在工业低成本、节约能源,和简单性是很重要的1,2]。然而,尽管这些优势,限制其使用一些实际问题,如高成本的分离和净化过程和不稳定的有机媒体和高温。为了克服这些限制,几种方法已经被提出,其中最重要的是固定化技术3,4]。酶截留使用天然和合成聚合物,如琼脂糖、琼脂、明胶、海藻酸通过thermoreversal聚合,聚醋酸乙烯酯、丙烯酸和β由ionotropic卡拉胶凝胶(5]。
明胶是由蛋白质和肽胶原蛋白的变性,分解成更小的碎片。由于其独特的物理性质,如熔点接近生理温度、凝胶用于各种各样的应用程序,特别是在食品和制药行业(6]。凝胶固定化方法已经开发微生物细胞和酶的圈套,尤其是当这种酶是放置在一个完整的细胞。在凝胶过程是可逆的温度并显示没有有效的固定,除了在- 35°C,一些方法研究了实现一个不可逆的凝胶化过程,比如使用交联剂(7,8]。单步固定夹是最常用的方法之一,可由简单的生物聚合物凝胶通过降低或提高温度,如琼脂、琼脂糖、κ角叉菜胶、壳聚糖。虽然很容易实现,但这种准备遭受低的机械强度和热损失。因此,必须产生一个替代方法更多的多孔结构,更高的机械稳定性和理想的弹性行为。也有一些技术稳定的海藻酸伯恩和他的同事们提出的由海藻酸的治疗与polyethyleneimine-HCl珠子,激活的海藻酸的混合物1-ethyl-3——(3-dimethyl-amino-propyl)碳化二亚胺和N-hydroxysuccinimide,和添加海藻酸钠metaperiodate9]。
漆酶(benzenediol:氧气氧化还原酶,提到过1.10.3.2)是一个有趣的群multicopper高等植物和真菌产生的酶催化氧化的广泛的有机化合物,如酚类、在分子氧的存在10,11]。讨论了漆酶最重要的应用包括制药和食品行业,纺织废水转换和废水解毒生物传感器。漆酶的独特性质,如溶液中的稳定性高,反应条件温和,选择性酚醛结构,使他们有吸引力的用于化学合成12]。酚环由漆酶氧化的机理一直先前描述。释放分子氮,而不是低分子量的形成芳香胺,很容易通过皮肤吸收,称为强大的致癌物质和诱变剂,可以被视为一种优势利用漆酶合成染料的解毒特别是芳香族偶氮染料(13]。
使用合成染料的废水发布的各种行业由于其低成本,易于合成,颜色品种可以污染和危害水生环境。合成染料的脱色使用特殊的生物催化剂受到极大关注,因为高效脱色和无毒产品代14,15]。结晶紫是一个广泛使用的人工合成色素进行染色处理。它是稳定的和非降解性,传统的方法已被确定为工业废水污染的主要因素。纺织厂在压力下应用环保技术来消除它16]。
本研究的目的是应用alginate-gelatin混合凝胶固定漆酶,这是进一步用于合成染料的脱色,如结晶紫,在水的解决方案。最佳pH值、温度、和适当的酶固定化漆酶对脱色的内容也进行了研究。据我们所知,使用alginate-gelatin混合凝胶之前没有检查的目的酶截留。
实验
2.1。化学和仪器
结晶紫、蓝色coomassie g - 250,溴百里酚蓝,氨基黑10 b、甲基红、伊红和孔雀石绿(表1)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。胶和海藻酸钠从默克公司(达姆施塔特,德国)。所有其他试剂和化学物质纯度最高的可用。胞外漆酶纯化分离子囊菌深层发酵的土壤Paraconiothyrium variabile(10,17,18]。脱色是紫外可见光谱监测的。吸光度是由PC 2501双光束紫外可见分光光度计扫描(日本岛津公司、日本)。机械力将珠子是用张力计测量(茨威格/ Roell 030,德国)。gelatin-alginate珠子的光学图像是用一个USB数码显微镜Pro (Dino-Lite、台湾)。扫描电子显微镜(SEM、日立s - 2400、日本)应用研究的尺寸和表面的珠子。
2.2。制备的混合凝胶、漆酶的固定化,脱色结晶紫
gelatin-alginate混合凝胶制备的方法Panouille和Larreta-Garde19),做了一些调整。短暂,截留gelatin-alginate漆酶的混合凝胶是由添加0.1克海藻酸钠10毫升的解决方案包含10% (w / v)明胶和漆酶在5-50毫克(1毫克酶= 1.25 U)在连续在室温下搅拌。混合物是搅拌CaCl注射器2解决方案(200毫米),以及由此产生的珠子被左硬化1 h在相同条件下,由去离子水清洗三次,然后储存在4°C之前被用于脱色研究。绑定蛋白的数量是由布拉德福德的方法(20.),使用下面的公式:,在那里是酶酶(毫克/ g珠子),和最初和最后的酶浓度(毫克/毫升)的解决方案,解决方案的体积(mL),然后呢是珠子的质量(g),固定化漆酶(10 g)转移到20毫升缓冲溶液,在pH值3 - 9,含有结晶紫(最终浓度0.083毫米),在30 - 70°C的温度范围内,20分钟。最大吸光度是根据监测染料(表1)。相对消色是由以下方程:计算相对消色(%)=×100,最初的吸光度和吗是最后一个在给定波长吸光度。
2.3。最适温度、PH值和酶固定化漆酶的浓度
pH值对酶脱色的效果监控与染料浓度为0.25毫克/毫升3 - 9 pH值范围调整由柠檬酸或氨缓冲。确定温度对酶固定化的影响,反应混合物在热的孵化30 - 70°C,在步骤10°C。为了评估酶量对脱色的影响,反应开始用不同的酶量,从0.25到0.5毫克/毫升,在0.05毫克/毫升的增量。实验进行了一式三份;显示结果意味着±标准差。
2.4。机械强度、光学图像和扫描电镜
破裂所需的力的珠子被压缩记录使用张力计的珠子;结果平均力来自20个独立测试。光学显微镜是用来评估的形状,表面上看,和珠子的大小,扫描电子显微镜(SEM)也适用于研究装配式结构的珠子。
2.5。可重用性
可重用性的gelatin-alginate固定化酶研究pH值在醋酸盐缓冲溶液0.1 8和45°C。使用珠子被过滤在每个周期和清洗三次相同的缓冲将在下一个新鲜的解决方案。可重用性研究进行了一式三份。
2.6。合成染料的脱色
其他染料的脱色溶液solution-coomassie蓝g - 250(0.086毫米),溴百里酚蓝(0.095毫米),氨基黑10 b(0.045毫米),甲基红(0.125毫米),伊红(0.038毫米),和孔雀石绿(0.112毫米)是研究通过添加柠檬酸缓冲溶液10 g固定化漆酶20毫升(0.1米,pH值4.5)包含染料,在45°C为20分钟。计算相对脱色结晶紫的如上所述。一些属性的应用除合成染料和染料的百分比如表所示1。标准差和均值三个独立实验的结果计算SigmaPlot Windows(版本10.0)。
结果与讨论
3.1。实验参数对结晶紫的影响脱色
得到了球形和regular-shaped gelatin-alginate珠子用ionotropic凝胶;珠子的直径2.0 - -2.5毫米(图1(一))。结果,如表所示2表示,断裂力增加与海藻酸浓度的增加。准备的珠子含有5%海藻酸表现出最高的机械稳定性。藻朊酸盐可以提供一个非常强大的网络,需要0.204 kgf力破裂。早期的研究也报道之间的直接相关性断裂力和海藻酸浓度(21]。
(一)
(b)
在研究参数,pH值在染料脱色中扮演关键的角色。pH值对染料脱色的影响研究在pH值从3至9,使用醋酸(pH值3 - 6)和氨(pH值7 - 9)缓冲区。粗酶明显呈现出较高的脱色的活动基本的pH值(图2)大幅增加在酸碱值高于6和最大活动9。固定化酶活动的最佳pH值8。这表明环境pH值具有显著影响脱色这表明凝胶的质量传递矩阵可能取决于运输散装H+离子进入凝胶矩阵(22]。
温度对染料脱色的影响研究通过改变反应混合物的温度在30 - 70°C的范围内。结果显然表明,脱色增加温度提高到50°C;在更高的温度,脱色效率明显下降,通常归因于酶的变性。然而,脱色的比较结果表明固定化酶的热稳定性高,证实alginate-gelatin混合凝胶的保护性作用维持酶活性。在50°C,原油和固定化酶表现出更多的活动,如图3。同样,Forootanfar和他的同事们(10)报道,漆酶活动的最适温度是50°C。其他研究已经报道的最佳温度范围45 - 50°C固定化漆酶活动的共价结合和吸附(23,24]。
确定最大脱色,所需的适量的酶酶量对染料脱色的影响也进行了研究。如图4,脱色随着酶量的增加,增加从0.5到5毫克/毫升。然而,结果表明,最小的酶量,以达到最大的脱色是2.5毫克/毫升。
如上所述的最优条件,申请其他合成染料的脱色(表1)。值得注意的是,漆酶酶的效率对消除这些合成染料和解毒之前报道和讨论(13,25,26]。结果表明,氨基黑10 b和伊红表现出最大和最小染料去除,分别。观察到,固定化漆酶能够使脱色超过80%的氨基黑10 b,而Selvam和他的同事们(27]报道15%脱色了漆酶。然而,所有的染料被氧化的最大速度在pH值8。动力学研究(表1)认为染料基质用于酶切除中,甲基红和孔雀石绿是首选,相比之下,伊红是一个贫穷的衬底(13]。
3.2。固定化漆酶的可重用性
固定化酶的可重用性展品为工业应用最重要的方面,因为固定酶的生产成本降低,因为他们反复连续使用。在这个工作中,可重用性的固定化酶研究7周期;剩余活动呈现在图5。在酶促反应中,alginate-gelatin混合物可能会导致降低网络的孔隙大小,导致底物的扩散困难和产品矩阵的凝胶。这一限制可能会导致降低漆酶的有效活动禁锢在凝胶后重复使用。在文献中,有报道称,成功的各种固定化漆酶系统的重用,60%十周期后活动等共价固定化漆酶激活聚乙烯醇(28- - - - - -30.)和80% 5周期对漆酶固定化后amine-terminated磁性纳米复合材料通过交联方法(31日]。
结论
固定化漆酶已收到越来越多的关注在染料废水等去除水的解决方案。Gelatin-alginate珠子是准备作为一个矩阵系统对漆酶截留;固定化酶表现出更多的稳定操作期间与自由酶相比,因此在废水处理可以被视为一种优势。此外,gelatin-alginate珠子的可重用性提供了用于大型应用程序时的经济效益。未来的调查可能会专注于不同类型的染料的脱色,广泛应用于化工和纺织行业。
承认
这项工作是财务支持的批准号90-04-33-16360从德黑兰大学医学科学院,德黑兰,伊朗。