dna结合蛋白和新颖的钒化合物Van-7 Topoisomerase-I-Suppressing活动

文摘

钒化合物研究了近年来被认为是代表一种新的nonplatinum金属抗癌药物结合低毒性。在这里,我们找到了钒化合物Van-7威尼斯平底渔船作为抑制剂,我除了威尼斯平底渔船II使用topoisomerase-mediated超螺旋DNA松弛试验。琼脂糖凝胶电泳和彗星试验表明,Van-7治疗没有产生劈得开的像羟基喜树碱复合物,从而表明威尼斯平底渔船我抑制发生上游的降级的一步。进一步的研究发现,Van-7抑制威尼斯平底渔船我DNA结合参与其插入DNA。Van-7并不影响催化活性的DNase我甚至达到μm . Van-7显著抑制癌细胞的生长线与IC₅₀在摩尔浓度和逮捕A549细胞的细胞周期在G2 / M期。这些结果表明,Van-7是一个潜在的选择性威尼斯平底渔船和抗癌活性抑制剂作为一种威尼斯平底渔船我抑制器,不是威尼斯平底渔船我毒药。

1。介绍

DNA拓扑异构酶催化互变现象的各种拓扑状态的DNA最初发现的活动变化的超螺旋结构封闭循环DNA (1]。根据他们的功能机制,DNA拓扑异构酶已被分为两种类型:第一类DNA拓扑异构酶(威尼斯平底渔船I)打破和答辩两股在催化过程中,只有一个,而II型DNA拓扑异构酶(威尼斯平底渔船II)打破和答辩两股DNA为每个strand-passing反应。研究表明,威尼斯平底渔船我与积极转录相关基因,而威尼斯平底渔船II是DNA复制和成功所需导线有丝分裂的2,3]。因此DNA拓扑异构酶修改DNA促进各种DNA的拓扑状态事务如DNA复制、重组,染色体缩合/ decondensation和染色体隔离。先前的研究已经表明,威尼斯平底渔船我不需要一个核苷酸辅因子或其他能源放松放松超螺旋DNA超螺旋DNA虽然威尼斯平底渔船二不能不ATP (4]。

研究发现DNA拓扑异构酶在癌症化疗作为治疗目标(5]。威尼斯平底渔船我是分子的目标hydroxycamptothecine(羟基喜树碱),而威尼斯平底渔船II是一个分子的目标数量的临床有用的抗癌药物,如依托泊苷(VP-16)、阿霉素、米托蒽醌和(N - [4 - (9-acridinylamino) 3-methoxyphenyl] methanesulphonanilide) (m-AMSA)。其他化合物如saintopin、intoplicine indoloquinolinedione衍生品,-lapachone和相关萘醌行动已被证明在威尼斯平底渔船我和威尼斯平底渔船二世(6- - - - - -9]。

铂金作为抗癌剂的成功刺激了搜索其他金属细胞毒性化合物相同或更大的抗癌活性和较低的毒性10]。三个铂类抗肿瘤药代理现在在常规临床实践:顺铂、卡铂和铂(11]。虽然这些重金属特工活跃在各种癌症,其临床应用与严重的副作用包括胃肠道症状(恶心、呕吐、腹泻和腹痛),肾小管损伤,neuron-muscular并发症和耳毒性。此外,铂金的使用是有限的,在许多肿瘤类型主要和获得性耐药这个代理(12]。这导致了一个持续的追求nonplatinum金属的发现可能延长金属药物的频谱活动(13]。钒化合物被广泛报道在动物对化学致癌作用起到预防作用,通过修改各种异型生物质酶和抑制carcinogen-derived活性代谢物(14,15]。在本文中,我们研究了一个新的钒化合物的影响,diaqua (2, 2′-diamino-4, 4′-bi-1, 3-thiazole) oxosulfato-vanadium (IV)四水合物(Van-7,图1)[16),抑制能力的威尼斯平底渔船我和体外抗癌活性。我们发现Van-7是一个潜在的威尼斯平底渔船我抑制剂作为一种威尼斯平底渔船抑制其他比威尼斯平底渔船毒药。

2。材料和方法

2.1。药品和试剂

Van-7在淡蓝色晶体是由药物化学提供第三部门的海洋和食品研究所、中国海洋大学和重蒸馏的水稀释。产物由纯度是99.0%以上。肛交。计算的风投₆H₁₈N₄O₁₁年代₃(469.36):C, 15.35;H, 3.86;N, 11.94%。发现:C, 15.30;H, 3.81;N, 11.92%。超螺旋质粒pBR322购买从豆类生物科技公司(中国大连)。3 - 4,5-dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)、蛋白酶K, SDS买来σ。VP16得到从浦东制药厂(中国)和羟基喜树碱飞云制药厂(中国)。其他化学制品都是分析试剂级。 Human DNA Topo I was gifted by ZHOU Shi-Ning (Sun Yat-Sen University, China) [17]。

2.2。威尼斯平底渔船II准备

威尼斯平底渔船二世是提取l - 1210白血病细胞腹腔手术后肿瘤接种后7天德伊莎贝拉et al。12,18]。总之,收获l - 1210细胞DBA / 2小鼠resuspended在10毫升的缓冲区(10毫米三羟甲基氨基甲烷(pH值7.5),液1.5毫米MgCl₂,10毫米氯化钠)和允许坐在0°C 10分钟。非离子去污剂(1毫升10%诺乃清洁剂p 40)补充道,和混合物轻轻磨碎,最后在0°C,持续15分钟。细胞被均质和离心10分钟,每分钟2500转,颗粒resuspended 2毫升的缓冲区B(50毫米三羟甲基氨基甲烷(pH值7.5)液,25毫米氯化钾,CaCl 2毫米₂3毫米MgCl₂和0.25米蔗糖)。细胞核因此获得分层超过0.6毫升的缓冲C(缓冲B 0.6蔗糖)和沉淀在7000转10分钟。颗粒在2毫升resuspended缓冲区没有CaCl D(缓冲B₂,5毫米MgCl₂在7000 rpm),离心10分钟,最后在0.3毫升的缓冲区resuspended E(缓冲D一样没有蔗糖)。解决方案增加了30μL 0.2 EDTA (pH值8.0)和0.66毫升的缓冲F(80毫米三羟甲基氨基甲烷(pH值7.5),液2毫米EDTA,德勤1毫米,0.53 M氯化钠和20%甘油(v / v))。这种混合物轻轻磨碎,在0°C 30分钟,在40000转离心20分钟。去年的上层清液离心包含威尼斯平底渔船二活动,由DNA放松化验检查。一个单位的威尼斯平底渔船二世被定义为0.5所需的酶完全放松μg(超螺旋DNA在下面描述的条件。

2.3。DNA松弛试验

拓扑异构酶被放松的超螺旋质粒DNA化验(19,20.]。放松250 ng的超螺旋的威尼斯平底渔船我在20 (2 U)执行μL威尼斯平底渔船我放松缓冲区(10毫米tris-HCl, pH值7.9,1毫米EDTA, 150毫米氯化钠,0.1% (w / v) BSA, 0.1毫米亚精胺,5% (v / v)甘油),在并没有多少不等的测试化合物,溶解在二甲亚砜(5% (v / v)最终浓度)。反应开始的DNA。对照组要么是DNA单独或DNA拓扑异构酶处理。放松的超螺旋DNA与威尼斯平底渔船二世是在威尼斯平底渔船II放松缓冲区(50 mM Tris-HCl, pH值8.0,0.5毫米ATP, MgCl 10毫米₂二硫苏糖醇、120毫米氯化钠和0.5毫米)。DNA添加之前的威尼斯平底渔船II。在37°C, 30分钟后的反应是终止添加1% (w / v) SDS和50毫克/毫升蛋白酶K消化30分钟的55°C。DNA提取与同等体积的氯仿/异戊醇(24:1)和1% (w / v)琼脂糖凝胶上分离在Tris-acetate-EDTA (TAE)缓冲区(40毫米trisacetate、pH值8.0和2毫米EDTA)在2 v /厘米3.5 h。凝胶是沾染了溴化乙锭5毫克/毫升,使退色,665年并使用宝丽来拍电影或gel-imaging系统数值量化的微扫描(Herolab Wiesloch,德国)。

2.4。彗星试验

细胞核被孵化整个细胞从P388细胞分离核MgCl缓冲区(5毫米₂KH 1毫米EGTA 1毫米₂阿宝₄150毫米氯化钠)20分钟在冰温柔的摇摆。质膜破坏和核的完整性是在显微镜下检查。的核暴露在Van-7或羟基喜树碱在40μM为30分钟37°C。如前所述(发现DNA断裂21]。短暂,细胞核被嵌入在琼脂糖凝胶,然后传播polylysinated显微镜幻灯片上。核细胞溶解在裂解缓冲(2.5 M氯化钠,10毫米Tris-HCl, 100毫米Na₂卫EDTA, 1%, 10% DMSO, pH值10)1 h在4°C。溶解后,核被preincubated 20分钟在4°C电泳缓冲(0.3 M氢氧化钠,1毫米Na₂EDTA, pH值13.5),然后被碱性凝胶电泳(300毫安,4°C, 20分钟)。幻灯片被激光扫描显微镜分析(LSM蔡司Ltd .)定量DNA损伤。尾巴的时刻,计算固美5.5软件(动态成像、浴、英国)彗星尾巴的总强度乘以迁移距离中心的彗星的头,用于测量DNA损伤。五十个核为每个实验点得分失明的两张幻灯片。频率分布定义为细胞的数量的比例带尾矩值总细胞得分。

2.5。测量Topo-I介导DNA乳沟

反应混合物包含pBR322 DNA (250 ng)和过剩的酶(即。100 U Topo-I 37°C)和药物孵化出了30分钟。样本包含测试药物,聚集在这个顺序:DNA, Topo-I, Van-7或羟基喜树碱。的反应是终止添加1% SDS和150毫克/毫升蛋白酶k .额外的30分钟孵化后37°,DNA样本在1%琼脂糖凝胶电泳含0.5毫克/毫升溴化乙锭。

2.6。EMSA威尼斯平底渔船I / DNA结合的分析

EMSA(电泳迁移率改变分析)基本上是执行所述其他地方(22]。总之,250 ng的超螺旋pBR322 DNA在20孵化μL放松的威尼斯平底渔船我缓冲区有或没有多余的威尼斯平底渔船(100 U)在测试化合物的存在37°C 6分钟。反应开始的DNA。包含测试化合物的样品在威尼斯平底渔船的顺序组装,羟基喜树碱或Van-7。样本立即装上0.8%的琼脂糖凝胶Tris-acetate-EDTA缓冲区1μg / mL溴化乙锭和电泳分离的6 h 2 V /厘米。

2.7。溴化乙锭位移荧光测定

溴化乙锭位移荧光分析(23)是用来确定Van-7结合DNA。荧光发射光谱(nm,激发波长546 nm)获得25°C贝克曼荧光分光光度计。分析包含1μ溴化乙锭,0 - 100μM Van-7, 1μg超螺旋DNA pBR322 2毫升的荧光缓冲区。

2.8。DNase我活动的测量

牛DNase我(4.0 U /毫升)孵化400 ng pBR322 DNA在20μL的缓冲区(50 mM Tris-HCl, pH值7.5,10毫米MnCl₂,50μg / mL BSA)的Van-7 (50 - 100μ米)为15分钟37°C。25毫米的反应是停在添加EDTA(最终浓度)和琼脂糖凝胶电泳紧随其后。

2.9。MTT试验

A549,海拉贝尔- 7402,P388, L-02细胞从美国购买类型文化集合(写明ATCC)。据写明ATCC培养基选择建议。执行增长实验细胞被播种(10000细胞/)在96 -平底盘子。24 h后,媒体所取代,一个洗后,媒体包含药物补充道。48 h后孵化在37°C,麻省理工的解决方案是添加在5毫克/毫升和孵化一个额外的4 h。文化上清液被删除了,150μL二甲亚砜(DMSO)添加/溶解甲瓒晶体。比色法是在使用标570海里(光谱彩虹、奥地利)。在每组6个平行样本准备,每个实验已经复制了三次。剂量反应研究计算50%抑制浓度(IC₅₀Van-7)。集成电路₅₀计算的应用,里德和Muench方法(24)如下: 在哪里一个日志浓度低于50%的死亡率,B是50−死亡率低于50%,C死亡率超过50%−死亡率低于50%,D−日志日志浓度超过50%浓度低于50%。

2.10。流式细胞术

人类肺癌细胞A549被播种(300000细胞/)在6-well平底盘子。孵化后F-12中含有10% FCS (v / v)在37°C 24 h, Van-7添加为100μ50米,μ25米,μ12.5米,μ(最终浓度)和羟基喜树碱在40μ除空白对照组。48 h后,A549细胞收获,洗了三次磷酸盐(PBS),沾染了π为30分钟,大门和分析了FCM(美国优势Becton和Dickinson)波长488纳米的激光激发和530海里排放过滤器。数据分析与Modfit 2.0和两个平行样品准备在每一组中,每个实验复制了三遍。

2.11。统计分析

比较显著的治疗结果进行了测试使用学生的差异以及成对数据。统计学意义是假定*,* *和* * *。

3所示。结果

3.1。抑制活性的威尼斯平底渔船我但不是威尼斯平底渔船Van-7 II

Van-7的影响在使用传统的质粒DNA拓扑异构酶进行了放松化验。羟基喜树碱,著名的威尼斯平底渔船抑制剂,采用积极的控制。一个代表性的实验如图2威尼斯平底渔船,抑制DNA的放松活动我通过羟基喜树碱或Van-7浓度。我们发现Van-7浓度的5μ米明显抑制DNA威尼斯平底渔船我放松活动,而羟基喜树碱等效果没有没有可见的超螺旋DNA电泳带显示在5μm .的额外Van-7威尼斯平底渔船也完全抑制DNA的放松活动,我在40岁的浓度μm .这些结果表明Van-7威尼斯平底渔船我比羟基喜树碱的有效抑制剂。

调查如果Van-7威尼斯平底渔船的选择性抑制剂,我们进一步测试了它对威尼斯平底渔船二世的催化活性的影响。如图2 (c)第二,没有观察到抑制活动反对威尼斯平底渔船,甚至多达160的浓度μ著名威尼斯平底渔船m .相反,VP16 II抑制剂,明显抑制威尼斯平底渔船的链段活动二世,享年100岁μM。

3.2。Van-7没有形成像羟基喜树碱诱导可分裂的复杂

威尼斯平底渔船我充当着一长串核酸内切酶和连接酶,和羟基喜树碱抑制连接酶而不影响解理的一步。因此,羟基喜树碱欺骗一个缓慢的迁移形成的复杂酶,药物,和DNA,命名为可分裂的复杂(25]。我们也进一步评估是否Van-7诱导可分裂的复合物的形成。如图3(一个),明显提高电泳带的开环羟基喜树碱治疗后观察,表明羟基喜树碱能诱导形成的可分裂的复杂;然而,Van-7并不像没有明显的类似于羟基喜树碱可分裂的复杂被发现与对照组相比,表明抑制机制对威尼斯平底渔船Van-7我是羟基喜树碱的不同。

进一步巩固上面的假设中,新分离细胞核治疗30分钟的化合物,和DNA断裂的发生是由彗星试验评估(图3 (b))。彗星化验,发现羟基喜树碱能诱导DNA形成了明显的彗星的尾巴,而Van-7无法产生类似的效果。

3.3。Van-7展品的dna结合蛋白通过Intercalative活动模式

我们下一个调查Van-7是否直接干扰DNA使用一个绑定的威尼斯平底渔船EMSA实验。这里,羟基喜树碱被选为控制,因为它可以抑制连接酶活动的绑定,不干扰酶DNA (26]。如图4(一)100年,Van-7μ米大大阻碍了酶的结合DNA,这不会发生与羟基喜树碱的预期。

溴化乙锭是一个大型的、平坦的基本分子就像一个DNA碱基对。由于其化学结构,它可以插入(或插入)成一个DNA链。溴化乙锭的位移与相应的ethidium DNA荧光被作为一种方法来检查是否复合可以插入到DNA。如图4 (b)大幅减少,Van-7的增加,荧光强度被发现因此,表明溴化乙锭可以从DNA链Van-7流离失所。这个结果表明Van-7可以插入到DNA和DNA结合。

3.4。Van-7并不影响DNase我的活动

我们进一步发现Van-7的影响催化活性的牛DNase如图5,Van-7甚至达到μM或没有Van-7 DNase我可以消化DNA无差别地,这表明Van-7 DNase我不会影响催化活性。

3.5。Van-7体外的细胞毒性的活动

Van-7测试四个人类癌症细胞系,观察其体外抗癌活动。数据表所示1;Van-7能够显著抑制癌症细胞系的生长,但显示微弱的抑制活动对人类正常肝细胞株L-02。

3.6。Van-7逮捕A549细胞株在G2 / M期

澄清的模式Van-7-induced生长抑制A549细胞治疗与羟基喜树碱或Van-7 48小时并通过流式细胞术分析。流式细胞仪分析显示Van-7治疗导致的积累在G2 / M期细胞群浓度的方式(图6),而羟基喜树碱封锁了在S期细胞(27]。与100年A549细胞的治疗μ50米,μ25米,μ12.5米,μM Van-7增加G2 / M期细胞的比例为49.36%,27.21%,21.10%,和15.31%,分别。

4所示。讨论

自从发现了独联体铂金,许多过渡金属配合物合成和化验抗肿瘤的活性。近年来,vanadium-based分子已成为有前途的抗癌和antimetastatic代理与潜在应用platinum-resistant肿瘤或替代铂(14]。在我们的DNA拓扑异构酶抑制剂筛选模型,我们发现Van-7,一种钒化合物,有强烈抑制活动威尼斯平底渔船,威尼斯平底渔船II。

威尼斯平底渔船我抑制剂包括威尼斯平底渔船毒药和威尼斯平底渔船抑制。他们都是代理商为了干扰拓扑异构酶的酶的作用,但机制是不同的。羟基喜树碱,一种喜树碱衍生物,是一个典型的威尼斯平底渔船我毒药。羟基喜树碱可以稳定DNA威尼斯平底渔船,形成药物DNA威尼斯平底渔船我复杂和抑制威尼斯平底渔船活动(28]。然而,抑制DNA接合体(比如Hoechst33258)或intercalator(比如aclacinomycin)。威尼斯平底渔船我抑制结合DNA或变形的结构DNA抑制威尼斯平底渔船的催化活性导致细胞死亡。为了产生这种效果,大多数威尼斯平底渔船我必须在相对较高的浓度,抑制DNA和活动接合体取决于其与DNA紧密绑定。在本文,Van-7发现抑制威尼斯平底渔船的活动我很明显;然而,在测试的药物威尼斯平底渔船我复杂的DNA凝胶电泳分析,Van-7不存在形式可分裂的复杂甚至高达100μm .为了进一步评估Van-7抑制拓扑异构酶的直接参与核独立在一些潜在的干扰,新鲜分离细胞核被使用,和可能发生的DNA被彗星试验评估。我们发现羟基喜树碱治疗显示明显的彗星的尾巴而Van-7没有。从上面的两个结果,我们确认Van-7威尼斯平底渔船我活动的抑制作用不同于羟基喜树碱,以及Van-7不能形成Drug-DNA威尼斯平底渔船我复杂表明Van-7不是毒药。因此,我们假定Van-7作用于上游的催化反应,可能扰乱我威尼斯平底渔船与DNA的结合。

DNA迁移转变分析(EMSA),也称为凝胶阻滞实验,可以用来检测DNA蛋白质体外相互作用。在电场中,DNA片段结合蛋白质比免费更慢迁移到正极DNA片段。我们进一步评估的影响化合物与DNA的结合威尼斯平底渔船在我们的测试中,我们发现Van-7 40岁μ明显抑制了威尼斯平底渔船的绑定我与免费的DNA片段DNA凝胶电泳带。但是这一现象并没有观察到羟基喜树碱的存在。在另外,Van-7显著降低的荧光强度取代溴化乙锭从DNA链。这些结果表明,Van-7插入DNA和发挥其抑制作用威尼斯平底渔船。

DNase我是一个劈开的核酸酶DNA优先嘧啶核苷酸磷酸二酯联系毗邻,收益率5′-phosphate-terminated多核苷酸与自由羟基位置3′,这类似于拓扑异构酶切割DNA的磷酸骨架;然而,Van-7并未发现影响Dnase我的活动,这表明Van-7抑制活动我有选择性的威尼斯平底渔船。

威尼斯平底渔船我具有显著影响癌症和癌症化疗通过抗增殖或cell-differentiating行动。从MTT测试的结果,发现Van-7强烈抑制肿瘤细胞的生长,如贝尔- 740,A549和海拉细胞,但不正常的细胞。作为威尼斯平底渔船的具体活动,我是4倍大细胞增殖(日志阶段)比nonproliferating(支流)细胞,在威尼斯平底渔船的变化相比,我的水平,威尼斯平底渔船的具体活动二世在增殖与核武器、没有可检测不同细胞(29日),因此,它是合理的,Van-7更有选择性的癌细胞比正常细胞增殖率更高。据报道,从喜树碱化合物表现出不同的抑制机制,可能诱发不同阶段细胞周期阻滞,小说威尼斯平底渔船和压抑的催化裂解活性抑制剂威尼斯平底渔船我而不是形成drug-enzyme-DNA共价三元复杂的逮捕在G2 / M期细胞周期K562细胞(30.]。我们的流式细胞仪分析结果Van-7 100年的浓度μ米可以阻止细胞周期G2-M除了S期与这份报告是一致的。

总的来说,我们认为Van-7是一个潜在的威尼斯平底渔船我抑制抑制剂作为一种威尼斯平底渔船。Van-7可以插入DNA碱基对,导致DNA结构扭曲,然后抑制DNA的绑定到威尼斯平底渔船1,最后影响催化活性的威尼斯平底渔船。我们所知,这是第一个报告关于澄清钒金属化合物的抑制能力Topo-I催化活性及其机制。然而,体内抗癌活性和细节Van-7机制需要进一步调查。

缩写

威尼斯平底渔船我:	拓扑异构酶我
威尼斯平底渔船II:	拓扑异构酶ⅱ
羟基喜树碱:	Hydroxycamptothecine
DMSO溶液:	二甲亚砜
VP16:	依托泊苷。

作者的贡献

X.-m。密苏里州和Z.-f。陈的贡献同样这项工作。

确认

这项工作是支持由国家高科技研发项目(2011 aa09070104)的中国和在大学长江学者和创新研究团队项目(IRT0944)。

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