研究合成和天然黑色素和铁(III)离子的亲和力

文摘

在这项工作中,我们测量了网站与天然和合成dihydroxyindole(济)黑色素和各自与铁(III)离子的相互作用。除了两个酸组发现济系统:苯邻二酚(猫)和quinone-imine(气),醋酸组中发现的天然低聚物电位滴定。在酸性pH值、铁(III)络合黑色素合成中检测出一个铁(OH)(导管₂猫)交互。与pH值的增加,三个新的交互发生:dihydroxide diprotonated儿茶酚,Fe(哦)₂(导管₂猫)⁻,dihydroxide monoprotonated儿茶酚,Fe(哦)₂(CatHCat)]²⁻协会,一个交互产生的一个quinone-imine和儿茶酚集团(Fe(哦)₂(气⁻)(CatHCat))³⁻。黑色素在自然系统中,我们发现同样的交互涉及儿茶酚和quinone-imine组还金属醋酸与组pH值低于4.0。此外,合成系统的相互作用也表现为通过儿茶酚的特征振动红外光谱和quinone-imine组。最后,扫描电子显微镜(SEM)和能量色散x射线(EDS)分析被用来检查这两个系统的形态学上的差异在缺乏和铁(III)离子的存在。金属原子和捐助的摩尔比是通过EDS分析。

1。介绍

黑色素是一种无处不在的低聚物的色素在植物和头发,皮肤(真黑素),和大脑(neuromelanins)的动物。两个主要的化学单体,6-dihydroxyindole(济)和5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic酸(DHICA)如图1(1,2]。可以合成色素,通常由tyrosinase-catalyzed儿茶酚的自动氧化或氧化酪氨酸或二羟基苯丙氨酸(3,4),给低聚物的表如图2。在这项工作中,我们也使用隔离的一个酶的过程真黑素从人类的黑色的头发,第一次被他et al。5),它允许隔离完整的色素颗粒结构特征。

先前的报道表明,二阶的亲和力等金属铜(II)和锌(II)黑色素黑色素聚集的结构有显著的影响(6]。金属离子的绑定黑色素也加速其漂白在空气或过氧化;例如,melanin-copper络合牵连Fenton-like催化氧化反应(7]。其他研究人员已经研究了铁(III)的绑定(黑色素8- - - - - -10]和证明,这种离子加速空气氧化济和DHICA建议类似iron-promoted氧化应激增加黑质与黑色素的观察在帕金森病(11- - - - - -15]。在相关的研究中,我们已经表明,金属离子复合物,而诱发的被动吸收金属离子进入细胞,显示显著的毒性对melanin-producing黑色素瘤细胞(16]。

在这项工作中,我们测量合成黑色素的交互(济)和天然黑色素使用电位滴定与铁(III)离子结合数学拟合函数。结果与红外光谱和扫描电子显微镜和能量色散x射线分析量化结合位点和看到这些类型的黑色素的形态差异。

2。实验

2.1。济黑色素

股票的解决方案5的合成黑色素来源于空气氧化,6-dihydroxyindole(济),原位生成的水解5 6-diacetoxyindole(戴)从TCI获得美国波特兰。傣族起始物料(120毫克,0.5145更易)处理20%摩尔过剩的KOH在250毫升(1.28更易与去离子水),戴和大力搅拌直到混合物完全反应(6]。戴不溶于水,但随着反应的进行6小时,戴所有的消费。

2.2。天然黑色素提取

头发黑色素被他描述的方法获得的et al。5]。黑色的头发和丙酮洗几次,蒸馏水,氯仿的几部分。后来,头发是干在室温和乐队约5厘米。大约5 g的头发是均质玻璃杵在50毫升0.1磷酸盐缓冲剂的pH值7.5,和匀浆提交以下治疗:二硫苏糖醇(0.5 g)添加和由此产生的混合物搅拌在37°C下一连串的氩18 h。然后,蛋白酶K(10毫克)和二硫苏糖醇(0.5 g)被添加到混合,搅拌在37°C下氩额外18 h。混合物是离心10分钟,由此产生的颗粒广泛用水冲洗。然后沉淀悬浮在30毫升0.1磷酸缓冲pH值7.5,与木瓜蛋白酶(10毫克)和二硫苏糖醇(50毫克)。这种混合物搅拌18 h在37°C下氩和离心机。收集到的黑色颗粒,经过6用水洗,resuspended在10毫升的0.1 M磷酸盐缓冲剂,pH值7.5,与蛋白酶(10毫克)和二硫苏糖醇(20毫克)补充道,和混合搅拌18 h在37°C下氩气流。氧解2% w / v Triton x - 100是补充道,和混合物在室温下搅拌4 h下氩然后离心机(4000 rpm) 20分钟。 After washing once with water : methanol 1 : 1 v/v, and four times with water, the black pellet was treated again with protease and dithiothreitol as described earlier. The pigment pellet, collected by centrifugation (4000 rpm for 20 min), was dried over NaOH in presence of CaCl₂24小时提供200毫克的黑色素。

2.3。电位滴定

电位的研究进行了水溶液与瑞士万通Titrino + 350自动滴定仪结合Ag / AgCl电极。实验样本分析的50毫升密封恒温器细胞维持在25°C,与氩冒气泡,确保一个惰性气氛。实验溶液的pH值(20毫升的济黑色素)被调整到11 0.100 KOH(有限公司₂免费的,支持者Dilut-It)和back-titrated 0.100 M盐酸。本机黑色素,黑色素颗粒的40毫克样品从头发中提取在20毫升上采用水分散。铁(III)处理样品,黑色素的解决方案被滴定的金属离子在黑色素:金属离子的摩尔比2:1。铁(III)的解决方案与EDTA标准(17),和盐酸的添加量,避免金属水解由格兰的情节18]。黑色素样本均质前30分钟,以保证总平衡测量。实验方案的pH值是11.0和回滴定整除为0.100 M盐酸直到pH值3.0。达到平衡的时间每个实验数据是大约15分钟。

2.4。红外研究

IR研究合成黑色素是第一个包裹着铁(III) Korytowski方法(19与小修改);该方法用于复合物形成的低聚物和双分子的系统。部分股票(40毫升)济解决方案是混合着FeCl 5毫升的0.01米₃解决方案,解决方案的pH值为4.0和10.0,调整了0.1 M盐酸或0.1 M氢氧化钠溶液。FeCl₃·6小时₂啊,(Vetec有限公司)使用。3 h后的混合物在0°C和过滤、沉淀固体在真空上采用水清洗和干燥。

分析在KBr丸进行大约5 - 10毫克的样本在分光计1600年优秀的傅立叶变换红外光谱计算机检测系统,在该地区500至4000厘米⁻¹。

2.5。扫描电镜和EDS分析

与纯合成黑色素和协调样品铁(III)(详见2.4)与银玻璃和涂上金准备。飞利浦XL 30 SEM是用来检查样品在30 kV和20°倾斜。使用数字图像捕获图像采集软件,用SEM荣誉。EDS频谱得到同样的仪器。

2.6。电化学研究

5,6.0毫克的一部分6-diacetoxyindole溶解在12.5毫升乙醇脱气氮下手套箱,0.55毫升0.1 M氢氧化钠添加。解决方案都惊动了,站1小时,然后稀释25毫升与pH值7.0,50毫米磷酸盐缓冲剂。ITO板就淹没在解决方案,聚合板上的济是15周期使用循环伏安法扫描速度50 mV⁻¹从−0.4 V至0.6 V和Ag / AgCl。0.1 CuCl的解决方案₂,ZnSO₄h·7₂O, FeCl₃和铁(₄)₂(NH₄)₂h·6₂啊,准备在大气、脱气和加载到手套箱。新鲜poly-DHI电影被浸泡在了金属离子在一夜之间解决方案,然后用去离子水冲洗并储存在氮气。紫外可见光谱记录使用2-neck紫外可见电化电池0.1氯化锂溶液pH值,50 mM磷酸盐缓冲剂。电极连接,spectroelectrochemical测量用散装在不同电位和电解Ag / AgCl。

3所示。结果与讨论

3.1。济黑色素系统

济黑色素的滴定曲线的存在和缺乏铜(II)、锌(II)、铁(III)如图3。上面的缓冲区域pH值9在自由济黑色素可以归因于酸碱平衡涉及catecholic组出现在黑色素。强劲的缓冲pH值低于7可以归因于quinone-imine集团的酸碱平衡(6]。乙酸分子出现在解决方案由于戴水解包括济pKa的计算和交互与铁(III)常量离子。每组的数量计算使用的最佳平衡常数Best7程序。还铁(III)分布曲线的交互复杂网站DHI-melanin计算使用物种项目[20.]。

金属曲线(图3)以下免费济黑色素曲线。曲线的铁(III)远低于那些在铜(II)和锌(II)离子,表明铁(III)离子相互作用更强比铜(II)和锌(II)离子与黑色素。分析了实验数据与BEST7 [20.)程序和测定的平衡常数如表所示1。相互作用的平衡常数与铜(II)和锌(II)离子计算之前(6]。济的平衡检测系统与铁(III)所示方案1。

济黑色素中的分布曲线的交互系统(图4)表明,在酸性pH值,monohydroxide Fe (OH)(导管₂猫)交互主导。在更高的pH值,dihydroxide (Fe(哦)₂(导管₂猫)⁻增加互动和pH值在8.4 - -10.3是主要的交互。pH值高于9,另外两个交互出现:dihydroxide铁(III) monoprotonated多酚(Fe(哦)₂(CatHCat)]⁻,dihydroxide铁(III) quinone-imine monoprotonated儿茶酚,(Fe(哦)₂(气⁻)(CatHCat))³⁻。这些平衡图所示4。

3.2。自然黑色素系统

与合成黑色素,天然黑色素上面显示了相同的缓冲区域pH值9这是一个苯邻二酚组的存在(图的特征5)。铁(III)离子之间的相互作用是通过比较显示两条曲线(金属离子)的存在和缺失。同时,我们可以看到缓冲区在pH值6黑色素铁(III)曲线;它代表的络合铁(III) quinone-imine组。

天然黑色素的主要组织儿茶酚,和这组发现的电位滴定是每克3.977更易与黑色素;解释的主要集团的前身自然天然氨基酸酪氨酸是黑色素,从而通过羟基化反应催化酪氨酸酶导致黑色素儿茶酚组织结构的形成。我们还发现quinone-imine更易与每克0.300和1.188更易与乙酸组每克的黑色素。pKa值主要群体出现在天然黑色素在表2。

的分布曲线的交互检测电位滴定图所示6。的交互中发现低pH值2 - 4是造成铁(III)的竞争quinone-imine,醋酸,和苯邻二酚组(a、b和c),由铁(Ac)^{2 +}、铁(气)^{2 +}和铁(哦)(猫)⁺。铁(III)的交互与儿茶酚集团占主导地位在pH值高于3.0。这些相互作用是由铁(OH)(猫),铁(OH) (Cat)(七)⁻、铁(哦)₂(Cat)(七)²⁻和铁(哦)₂(猫)₂³⁻发现,所有交互的平衡常数如表所示3。

黑色素的强络合铁(III)的解决方案是弗朗茨和他的同事所示(8)使用大脑黑色素,neuromelanins,发现黑色素酸性pH值是1:1配合铁(III)。在我们的工作中,我们详细协调组织这个比例的pH值范围:Fe (Ac)^{2 +}、铁(气)^{2 +}和铁(哦)(猫)⁺pH值4 - 8,黑色素的形成2:1种黑色素:金属,在我们的系统所代表的物种Fe (OH) (Cat)(七)⁻,和更高的pH值促进二羟基物种的形成。

3.3。红外研究

合成黑色素的红外光谱在缺乏和铁(III)的离子在图所示7。Shurygina et al。21)的第一个黑色素的红外分析和识别三个特征峰:~ 3300厘米⁻¹,儿茶酚的代表团体,~ 1625厘米⁻¹,代表芳香C = C和/或羧酸盐组以及含氮杂环化合物,,~ 1470厘米⁻¹代表o-hydroxy醌组。的络合铁(III)标识的转移3313厘米⁻¹峰,黑色素的特征没有铁(III), 3395厘米⁻¹在pH值4和3407厘米⁻¹在pH值为10黑色素在金属离子的存在。quinone-imine显示在1472厘米的存在⁻¹对黑色素。在金属离子的存在,这个峰值转向低波数(1468厘米⁻¹在pH值4和1350厘米⁻¹在pH值10)。转变有机化合物的C = O拉伸低波数由金属络合报道Nakamoto et al。22]。铁(III)的交互quinone-imime电位研究中被发现(图组3)。

3.4。扫描电镜和EDS分析

合成和天然黑色素的扫描电子显微镜图像数据所示8和9。西蒙et al。23)使用SEM研究自然和合成真黑素的结构。据报道,合成样品似乎非晶态固体而自然样本似乎小球体。在我们的研究中,合成黑色素似乎是无定形的,组织层的黑色素。天然黑色素提取头发似乎小警棍而非球体在文献报道[18]。存在的铁(III)离子,合成黑色素的层被破坏(图10),非晶态组织成为主流。

3.5。EDS分析

3.5.1。黑色素复合物与铁(III)

电位的结果在pH值7儿茶酚复杂,(Fe (OH)(导管₂猫)],C: Fe原子比15:1所示方案1。表4显示semiqualitative分析和图11显示了济黑色素的EDS光谱包裹着铁(III),使一个15.1:1原子比C: Fe(原子%列),确认电位的结果。这些结果证实,结构是一样的在溶液和固体状态。钾的存在是由于隔离的固体氯化钾,和2 keV的峰值是由于非盟,作为样本对EDS分析的支持。

3.6。电化学研究

黑色素的氧化还原活动很难研究解决方案,(6,7),但它已经表明,黑色素可以聚合到电极的电化学性能,黑色素可以更好的学习7,24]。碳管分散(ITO)电极上涂上一层聚合济电影并处理铜(II)和锌(II)先前研究[7]。比较,治疗黑色素合成的铜(II)、铁(II)和铁(III),特征是通过紫外可见光谱和spectroelectrochemical平衡研究。

简单地对待poly-DHI ITO板与金属离子解决方案倾向于增加黑色素的整体吸光度,如图12。铁(III)治疗板有一个吸光度在~ 500纳米铜(II)治疗板鲱鱼在~ 680 nm额外的吸光度。这些结果与先前的报道是一致的,解释为金属离子的平衡协调改变气/猫在黑色素氧化还原状态,从而影响其强大的吸光度在500纳米7]。治疗poly-DHI电影的铁(II)造成的损失电影稳定;的电影退化和倾向于分层表面即使厌氧处理。但值得注意的是,测量在铁(II)对待电影显示吸光度在500 nm的丧失。

吸光度的变化在500 nm poly-DHI黑色素板之间有和没有应用潜力从700−+ 500 mV如图13。这些吸光度值后得到poly-DHI板电极得到平衡的应用潜力,通常10分钟后初始充电。结果spectroelectrochemical吸光度与潜在的曲线可以被解释为金属离子的影响绑定不同的氧化还原状态的黑色素。行为poly-DHI黑色素和Cu-treated黑色素是相似的,有两个明显的氧化还原平衡(ca。−−−500之间150 mV和600 mV)。

铁(III)的行为对待样本是独一无二的,和一个非常不同的过渡是观察到约250−mV,较低的潜力比类似的过渡poly-DHI和Cu-treated黑色素。锋利的吸光度增加在大约60 mV跨度也意味着均匀poly-DHI中的铁结合位点,与SEM和EDS结果一致表明,黑色素的整理在接触铁(III),也许更大的亲和力的醌互变异构体。明显较低值铁(III)治疗黑色素表明它是更容易降低,但我们认为这黑色素减少和没有一个涉及铁(III / II)氧化还原的夫妇。

4所示。结论

在这个工作中,电位滴定,结合红外光谱和EDS,被用来量化捐助团体和描述的交互合成和天然黑色素的铁(III)。这种离子的亲和力的捐助组织黑色素,反映的平衡常数的交互。邻苯二酚的主要组与铁(III)交互形式的黑色素。天然黑色素的交互产品中性和基本的pH值(Fe(哦)₂(猫²⁻)]⁻和(Fe(哦)₂(猫⁻)₂]³⁻,分别。在这个系统里出现的物种(Fe(气))^{2 +}pH值高于4,但在济黑色素,计算物种存在于这个pH值不是因为寡聚物的沉淀。红外光谱结果表明物种的形成特点乐队:3300厘米⁻¹归因于儿茶酚,1625厘米⁻¹和1470厘米⁻¹归因于quinone-imine组,这些组与金属离子的相互作用。

SEM照片表明,合成济黑色素是一种非晶态固体,天然黑色素接力棒的形状。然而,在铁(III)离子的存在,黑色素层被破坏,非晶态组织保存。电化学测量确认黑色素是由铁治疗重组^{3 +}。EDS分析显示了金属原子的摩尔比在系统确认铁(哦)(导管的结果₂猫被电位滴定)交互。

承认

作者感谢中心实验室UFSC电子显微镜和CNPq(巴西)奖学金。

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