文摘

钛及其合金目前所使用的主要材料生产骨科植入物由于其良好的机械性能和耐腐蚀性能。虽然这些材料是bioinert,改善生物属性(例如,骨植入物接触)可以通过应用程序模拟骨细胞外基质的物质。这一目标,本工作描述新方法生产纳米复合材料在钛合金collagen-apatite衬底,通过结合电纺的仿生矿化。表征结果表明,获得的矿化支架形态,结构,和化学成分特征类似于自然骨细胞外基质。最后,在矿化的化学成分的地形分布矩阵评估通过傅里叶变换红外显微镜表明,磷灰石纳米晶体的胶原纤维组装电纺。

1。介绍

钛及其合金材料目前主要用于生物医学和牙科植入物的力学性能好,高耐腐蚀性能和良好的生物相容性(1]。然而,这些材料是bioinert因为它们可以是非生物反应表达下调。出于这个原因,研究定向到这些材料的表面改性来改善骨植入物接触,他们的生物学性质。在不同材料表面改性的钛基板,最好的方法可能是涂层的应用,取代了细胞外基质(ECM)的骨骼,基本上构成了仿生磷灰石纳米晶体(HA)和胶原纤维2]。

骨骼和牙齿的矿物质阶段由板状形状的非化学计量carbonated-HA晶体长度约100海里,20 - 30 nm的宽度,厚度3 - 6纳米,和不同的类型,和外国离子替换包括钠、镁、氟化钾、碳酸盐,(3,4]。有几种方法来合成羟磷灰石但主要可以区分两种类型的羟磷灰石基于合成的温度:一种高温烧结(> 900°C)和低温沉淀(~ 37°C)。在低温合成的化合物表现出更多的溶解度,更大的表面积,他们本质上是更积极地生物系统与生物惰性烧结版本(5]。在整形外科植入物承重烧结羟磷灰石是最常用的,但另一方面它并不像它们bioresorbable稳定个人的一生。自骨矿化过程发生在基本的pH值和生理温度(37°C),使用这些参数的合成过程称为仿生矿化。最后哈形成,尽管有变量组成,主要是碳酸磷灰石结晶度较低,它非常类似于表单中发现的骨头,一个有利的因素从组织工程学的角度来看(6]。

最近的研究关于胶原蛋白涂层钛植入了他们的有效作用,刺激细胞反应,增加骨重建,改善骨骼生长和骨植入物接触(7,8]。因此,混合动力车胶原/ HA临床应用有更大的潜力比纯HA或胶原蛋白类似,因为它们受益于有利的两种材料的性质。胶原蛋白复合,组件可以作为一个矩阵嵌入HA粒子,减轻HA的脆性和促进粒子的附着力钛衬底(9]。同时,蛋白质的HA作为填料可以提高机械强度和生物胶原蛋白的性能。

电纺的过程中吸引了大量的注意力在过去几年来繁殖的天然ECM的结构通过生产纤维在纳米尺度10]。这种技术被用来制造nanofibrous结构从天然和合成聚合物如胶原蛋白、壳聚糖、蚕丝蛋白、聚(丙交酯),聚氨酯,聚已酸内酯等等11- - - - - -14]。一些报纸报道nanofibrous材料生产的胶原蛋白与生物相容性的聚合物混合使用电纺的技术,以及HA-polymeric纤维(15- - - - - -18]。这些研究显示增强的复合材料的生物活性,特别是在nanofibrous构造(19,20.]。然而,纯纳米结构的数据生产胶原纤维和electrospining HA-collagen复合材料,以及沉积在钛合金上的数据或其他骨科植入物,是极其稀缺或没有被调查。

本研究的目的是开发一个方法生产纳米胶原/ HA复合与天然骨类似特征ECM的钛合金基体,通过结合电纺和仿生矿化,研究涂层表面的化学成分分布利用傅里叶变换红外显微镜。

2。材料和方法

2.1。材料

常见的高纯度化学试剂提供从西格玛奥德里奇(意大利米兰)。超纯水(0.22女士,25°C)是用于实验。

2.2。处理的纯胶原蛋白支架

这项工作中使用的电纺的设备包括三个部分:(i)喷丝板,(ii)收集器,(iii)高压电力系统。吐丝器直接连接到一个注射器,充当水库胶原蛋白溶液。(I型胶原蛋白,提取使用的生产方法从马跟腱Opocrin公司(Corlo di Formigine,意大利)21])分解成了CH3羧基浓度的0.1米2.5 wt %。解决方案是在10毫升玻璃注射器连接到一个不锈钢针使用聚四氟乙烯管内径约1.0毫米,由注射泵控制(KDS200 KD科学Inc .)、美国),0.01毫升/分钟的速度喂养。平板型钛合金(ASTMF136 ELI钛国际集团开发。,Sala Bolognese, Italy) was used as collector as well as substrate for the electrospun fibers. The distance between the spinneret tip and the collector was adjusted to 18 cm. A voltage of 15 kV was applied across the spinneret and the collector by a voltage-regulated DC power supply (SL150, Spellman High Voltage Electronics, USA) to generate the electrically charged collagen jet. The titanium coated with the electrospun collagen fibers was vacuum dried overnight before carrying out the characterizations.

2.3。矿化胶原支架的处理

处理涉及的步骤实际上电纺纤维的制备collagen-hydroxyapatite示意图见图1。电纺的胶原蛋白是由上述相同的方法,但是对矿化胶原蛋白的制备,收集器沉浸在10毫升的一个Ca的水溶液(CH3首席运营官)28.5毫米和NH4H2阿宝45.1毫米3.0 pH值,保持恒定的Ca / P摩尔比率为1.67。的胶原蛋白沉积,反应混合物与氢氧化钠滴定溶液的pH值9。老化了15分钟后,钛涂层与复合反复用超纯水洗净和收获之前真空干燥的特征。

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(c)
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图1
方案的处理步骤实际上电纺纳米纤维collagen-hydroxyapatite准备:(a)电纺的CH的胶原蛋白3羧基解成水钙和磷酸盐前体的解决方案(Ca (CH3首席运营官)2和NH4H2阿宝4在pH值、职责)3;(b)与氢氧化钠水解,pH值9;(c)老化的复合反应混合物为15分钟,其次是收获和真空干燥。
2.4。支架特征

实际上电纺胶原蛋白的表面形态和collagen-HA支架是研究利用扫描电子显微镜(SEM)(卡尔蔡司EVO, 40 XVP显微镜)使用二次电子25 kV,配备一个能量色散x射线检测仪(EDAX;印加人250年,牛津大学)。

无机相是由X射线衍射分析(XRD)使用PanAnalytical 'Pert Pro配备了一个X 'Celerator探测器,使用铜Kα辐射产生40 kV和40 mA。仪器配置了1/2°散度和接收狭缝。2θ范围从20°到60°步长(2°θ)的0.05和3 s的计算时间。

水晶域大小沿着哈轴方向计算应用谢勒方程: 在哪里θ的衍射角(hkl)平面, 和 弧度的宽度反射(hkl)一半高度的合成和纯羟磷灰石(标准参考材料,羟磷灰石钙,NIST),分别 一个。

热重分析(TGA)进行干样品从钛合金板使用热分析中删除项Q 600 (TA仪器、纽卡斯尔、德,美国)。加热氮气流中执行(100毫升分钟−1)使用一个铝样品架。温度增加到700°C使用加热速度10°C /分钟。样品的重量是大约3毫克。

透射电子显微镜(TEM)调查进行了使用仪器(80 kV) 100厘米(飞利浦、埃因霍温、荷兰)。样本从钛合金板和悬浮在超纯水。一滴涂料悬浮沉积在holey-carbon衬托支持传统铜微型电网。在室温下样品染色后观察30分钟铀酰乙酸水溶液为0.5%。

红外显微光谱数据记录的一个优秀的光谱傅里叶变换红外光谱仪(ir)配备了优秀的Autoimage显微镜。空间分辨率是50×50μ米2和光谱分辨率是4厘米−1。50×50的空间分辨率μ米2被选为了优化信噪比和考虑样本的同质性高。钛板上反射的光谱收集模式和它们相关的样品的表面。感兴趣的特定领域通过显微镜电视摄像机,并对于每一个人,一个红外图像使用液氮冷却,收购16-pixel碲化镉汞(MCT-A)探测器在25μ米/像素的分辨率。基线(多项式适合行),平滑,酰胺的标准化进行了在所有情况下(22]。相关地图允许证据的化学地形分布选择光谱分析领域。根据比色,白色的颜色对应于一个区最大吸收,而深色是指一个区域对应的吸收带是缺席22]。

2.5。统计分析

所有实验进行至少三次。HA微晶域大小的确定c设在沿垂直于它进行了5次相同的合成产品。

3所示。结果与讨论

为了保持聚合物的纤维结构,实际上电纺胶原蛋白的形式nanofibrous支架。纺丝条件获取胶原蛋白支架进行了优化通过操纵实验参数,如浓度的溶液,喷丝头与收集器之间的距离,和流量,以生产纤维结构没有任何珠的形成。通过优化(见部分2),均匀的纤维与三维孔隙结构与孔隙度高,适合自我组装的矿化,已经形成。这些发现与结果报告的博兰等。23]实际上电纺I型胶原纤维平均纤维直径范围从约100海里,至4.6μ根据浓度。符合之前的报道其他高分子材料(24),我们得出这样的结论:电纺的胶原蛋白的浓度高于2.5 wt %将产生光滑和均匀的纤维直径的几百纳米。相比之下,电纺的低浓度会导致小纤维,但珠子。

有核的HA晶体自组装过程取决于带负电荷的羧基化学组胶原蛋白可以结合Ca2 +和反应介质的pH值。最后的pH值9.0已经选择为了诱导HA结晶在最优条件25]。为了优化HA结晶,不同的实验进行了使用一些钙和磷酸盐在不同浓度保持Ca / P比值恒定,等于1.67公顷化学计量的价值。使用Ca (CH3首席运营官)28.5毫米和NH4H2阿宝45.1毫米被发现的最优组合HA晶体沉淀。此外,这些值被选择为了保持联形态,事实上,在HA含量越高,相当水平的珠子成立而不是纤维形态的发展(26]。合理,HA含量高时,胶原蛋白不能有效地分配在降水过程中HA纳米晶体由于其氨基酸链的密度相对较低。因此,一些HA纳米晶体可以沉淀在大型集群没有直接参与氨基酸的胶原蛋白。为了量化中的磷灰石矿化胶原蛋白、TGA调查进行(图2)。TGA曲线的纯胶原蛋白和矿化胶原蛋白显示出类似的概要文件的损失从室温到200°C由于physisorbed水的蒸发和减肥之间的200和500°C与胶原蛋白分子的分解,后跟一个轻微损失500至700°C的燃烧产生的残余有机成分(27]。考虑到剩余的纯胶原蛋白(~ 17 wt %),在矿化复合决心apatitic内容大约20 wt %。


图2
TGA曲线实际上电纺纯胶原蛋白(直线)和collagen-hydroxyapatite复合(虚线)。

实际上电纺材料的形态学研究了SEM、和纯胶原蛋白和矿化胶原支架的显微图如图所示3。实际上电纺纤维的纯胶原蛋白有面向随机特性槽出矩阵,以及矿化纤维。聚合物中形成电纺纤维的平均直径和没有哈,由SEM,约200海里。这些值都比得上ECM纤维,在50 - 500纳米的范围(2]。最后,两种材料显得非常相似的形态和尺寸的纤维,和可视化的HA晶体不被允许通过SEM大概是因为他们非常小的尺寸在20 - 30纳米的范围28]。

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图3
扫描电子显微镜(SEM)图像和能量色散x射线分析(EDAX)实际上电纺纯胶原蛋白(a)和collagen-hydroxyapatite复合(b)。

沉积公顷的存在证明了EDAX光谱采集的矿化(插图图示例3 (b))。这个光谱表明,Ca和P信号的强度比与生物的价值公顷(约1.5前后一致地3]。

TEM图像重组实际上电纺的胶原蛋白和collagen-hydroxyapatite数据所示4(一)和4 (b),分别。聚合物纤维的平均直径非常相似(大约200海里)协议的扫描电镜观察。纯胶原纤维染色显示高度的原纤维大会,证明d带模式特点与常规沿长轴段67海里的原纤维29日]。相反,矿化纤维没有显示d带模式由于HA的存在。图4 (b)清楚地说明了存在约20 - 30海里HA纳米晶体的大小,完全覆盖胶原纤维的表面。

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图4
透射电子显微镜(TEM)的图像实际上电纺纯胶原蛋白(a)和collagen-hydroxyapatite复合(b)。

清楚地识别矿物阶段发达在实际上电纺的矿化胶原蛋白纤维,采用XRD和模式如图5。所有的矿物衍射峰被索引HA纯相位(JCPDS文件编号9 - 432),未发现其它杂质阶段。最激烈的峰值为43.7°和50.8°2θ由于钛合金基体(标有*图5)[30.]。HA展品的衍射模式不明确的衍射极限,实际上相对应的峰值晶体飞机(211),(121)和(300)都组合到一个广泛的高峰集中在32°2左右θ相对较低,表明结晶度和纳米尺度的维度4]。水晶域大小的c设在(D002年沿着垂直于它(D)和310年),使用2θ= 26°(002)和2θ= 39°(310)衍射峰,分别是25±5和11±3 nm。这些值与TEM观察一致。值得注意的是,HA衍射模式非常相似,记录deproteinated骨磷灰石,这也证实了沿着水晶域的相似度大小c设在(21海里)(3]。


图5
x射线衍射(XRD)模式collagen-hydroxyapatite复合;*表示钛合金衍射峰。

实际上电纺的傅立叶变换红外光谱纯胶原蛋白和矿化胶原蛋白是描绘在图6。实际上电纺胶原蛋白的光谱显示所有特征的胶原蛋白在1204,1240,1280,1338厘米−1因哦拉伸模式和1400和1450厘米−1与不对称和对称CH3弯曲振动(4]。乐队的吸光度比1240/1450厘米−1这是一个衡量的三重螺旋结构的完整性31日)是大约1.0表明胶原蛋白三螺旋二级结构是守恒的。的光谱collagen-HA复合显示水晶carbonate-HA不善的乐队,一个复杂的带集中在1040厘米−1(磷酸基的不对称拉伸模式)和一个乐队在1422厘米−1切断(反对称拉伸模式,与碳酸盐type-B-substituted磷灰石相符,碳酸根离子取代磷酸离子晶格)(4),而胶原蛋白改变立场的乐队和他们的相对强度。这一发现可能意味着,在成矿过程中,胶原蛋白的二级结构被修改了HA纳米晶体的有效互动。碳酸盐岩的有限HA源自有限公司2溶解在媒体和吸附在材料表面制备前存储。存在碳酸磷灰石的结构是故意保留,为了更好地模拟生物的(3]。在先前的傅立叶变换红外光谱研究中比较“散装”胶原蛋白与胶原蛋白实际上电纺支架,Stanishevsky et al。32]报道转向低波数实际上电纺胶原蛋白的主要峰值酰胺我乐队从1667厘米−1(纤维)到1642厘米−1(散装),以及酰胺二世的峰值乐队从1574厘米−1(纤维)到1544厘米−1(大部分)。类似酰胺我和二酰胺峰转变为我们的纯胶原蛋白支架观察(波长的乐队与酰胺我和酰胺二世是1642和1547厘米−1、职责)。建议改变胶原原纤维在纤维的三重螺旋结构图纸的电气化喷气机可能占了这红外转变。其他报告了红外光谱的变化(如蓝色转变我乐队的酰胺)的磷灰石纳米粒子实际上电纺胶原纤维(32]。类似峰值的变化酰胺collagen-apatite支架显然是观察我和酰胺二世(1642到1658厘米−1和1547至1555厘米−1、职责)。红外光谱中观察到的变化与化学磷灰石纳米粒子间的相互作用和胶原蛋白,特别是他们是由于化学胶原羧基组之间的联系和HA的钙。


图6
傅立叶变换红外光谱实际上电纺纯胶原蛋白(红色)和collagen-hydroxyapatite复合(黑)在该地区的1800 - 700厘米−1。

傅立叶变换红外显微镜是用来分析实际上电纺涂料与目标地图和样品的化学分布的特点。傅立叶变换红外显微镜允许定义结构HA纳米晶体和重组胶原纤维之间的相互作用。此外,这种技术能够验证组件的地形和定量分布的样本。

在数据7(一)和7 (b)相关地图加载代表光谱得到的胶原蛋白(图6,红色光谱)实际上电纺纯胶原蛋白的化学地图(1300×1900μ米)和矿化胶原蛋白(1200×1100μ米)样本,分别显示。图中一个黑暗区域的优势7 (b)与纯胶原蛋白缺失的情况下,由于矿化的胶原纤维。相反,图7 (c)显示了加载collagen-HA的光谱获得的相关地图(图6,黑色光谱)在同一矿化胶原蛋白样品的化学地图(1200×1100μ米)在图表示7 (b)。在这种情况下,代表乐队HA说服那些纯胶原蛋白和大型白色区域允许可视化HA在蛋白质的结晶。

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图7
相关地图加载代表傅立叶变换红外光谱得到的胶原蛋白(图6化学的地图,红色光谱)实际上电纺纯胶原蛋白(a)和矿化胶原蛋白(b)和关联映射得到加载collagen-hydroxyapatite复合的傅立叶变换红外光谱(图6,黑色的频谱)化学矿化胶原蛋白(c)的地图。

广泛接受,HA的形成实际上电纺纤维的表面是由电荷密度控制在纤维表面的化学组。之前的调查对胶原纤维的HA晶体的成核网站表明,绑定的钙离子带负电羧酸盐组胶原蛋白是第一步的关键因素之一的HA晶体成核(33]。胶原蛋白有大量的带负电荷的羧基化学组绑定Ca2 +离子有核的HA晶体生长。羧基组出现在大约11%的胶原蛋白分子的氨基酸残基。此外,在一个中立的解决方案中,超过99%的羧基组天门冬氨酰谷酰基和电离有利于钙离子的螯合物。羧基组在外面的胶原蛋白三螺旋是一种网站胶原矿化(34]。这样,更高的内容和较小的HA晶体粒度可以形成纤维羧基密度较高的群体。羧基团体最初结合钙离子通过静电吸引,然后磷酸离子,被认为是促进成核的哈,直到整个报道的纤维与HA的主要层完成。这个假设很支持这项工作的红外光谱和透射电镜调查,特别是,蓝移的酰胺和二酰胺乐队在矿化胶原蛋白的光谱。此外,利用红外显微镜,我们发现哈外层纤维结晶的一部分,条理清楚地与电纺的技术允许胶原纤维的形成,在这种情况下,纤维外的羧基组负责哈成核。

4所示。结论

本文新方法生产collagen-HA钛合金基体复合材料,通过使用电纺的仿生矿化技术,已开发。结果表明,矿化支架最理想的形态,结构,和化学成分特征与天然骨基质相似,这是一个好的结果的组合方法的有效性研究。涂层的地形分布组件已经被使用傅立叶变换红外显微镜评估,强调这种方法的事实由胶原纤维支架,组装的电纺的,由差水晶HA纳米晶体(20 - 30 nm大小)。光谱的调查也表明,collagen-based材料的表面官能团,如羧基、矿化是至关重要的在体外。这些纤维共应该有潜在应用涂层材料改善钛医疗器械的生物性能,作为组织工程支架,并作为fiber-enforced复合材料的填料,目的是提高骨植入物接触和与生物的交互环境。

确认

作者要感谢国际米兰大学财团金属的化学研究生物系统(CIRCMSB)和Regione皮埃蒙特(Progetto Ricerca疗养地Finalizzata 2009年批准号30258 / DB2001)。m . Iafisco是收件人的奖学金Regione皮埃蒙特。