文摘

工党(II)复杂的竞购₂(下降)(浸=螯合双氮配体:4、7-diphenyl-1 10-phenanthroline),合成并通过元素分析(中文)和特征核磁共振和常用技术。这个复杂的绑定小牛胸腺DNA研究使用各种物理化学方法,如光谱光度测量的圆二色性,spectrofluorometric,熔化温度,viscosimetric技术。经复杂,除了重要的变化观察特征紫外可见乐队(hyperchromism)的小牛胸腺DNA (CT-DNA):增加熔化温度,特定的DNA,粘度急剧增加,诱导CD光谱变化。的荧光光谱特性和交互Pt与DNA研究了复杂。Pt绑定到DNA显示荧光强度显著降低。结果表明,复杂和NR分子可以插入竞争力成DNA双螺旋结构的发现。的实验结果表明,该模式绑定这个复杂的DNA是经典夹层。

1。介绍

过渡金属配合物与DNA的相互作用一直是强烈的主题调查与开发新的生物技术和医学试剂(1- - - - - -3]。在这些配合物,金属或配体可以多种多样的容易控制的方法,从而有利于个人应用程序。有几种类型的网站在绑定的DNA分子金属配合物的两个碱基对之间可以发生(我)(夹层),(2)在小沟,在主要槽(3),(4)外的螺旋4]。中性的铂配合物,抑制细胞分裂和生长产生了浓厚的兴趣的潜在价值无机药物领域的癌症化疗(5- - - - - -10]。顺铂具有强力的抗肿瘤活性,已被证明是现在通常用于治疗一些癌症(11- - - - - -21]。然而,由于其严重的副作用需要新的铂配合物出现了,和几个新衍生品已经合成并对各种肿瘤模型系统测试,希望发现新的药物和改进的属性(9]。最成功的第二代顺铂类似物(即。,carboplatin), the chloride ligands have been replaced by a carboxylate. This structural variation in carboplatin seems to be responsible for the reduced toxicity of this compound [18,19,22]。在这篇文章中,工党(II)复杂的竞购₂(下降)(7-diphenyl-1浸=螯合双氮配体:4日,10邻二氮杂菲)(图1),合成和光谱的特征(¹H,¹³C NMR)和元素分析技术。绑定这个复杂的相互作用与小牛胸腺DNA (CT)研究了紫外吸收分光光度法、圆二色性spectropolarimetry,熔化温度,粘度测量法的方法。

2。材料和方法

2.1。材料

工业纯的化学物质,例如4 7-diphenyl-1 10邻二氮杂菲(默克公司),中性红(第三试剂厂、上海),Tris-HCl(σ有限公司、马德里西班牙),用作购买。实验进行了Tris-HCl缓冲区(10毫米,pH值7.2)。解决办法是用蒸馏水。高度聚合的小牛胸腺DNA (CT-DNA)从西格玛有限公司购买(竞购₂(DMSO)₂)(DMSO =二甲亚砜)准备已经描述(23]。

DNA的股票的解决方案是由溶解的DNA在10毫米Tris-HCl缓冲区的pH值7.2。CT-DNA给溶液的紫外吸光度比260和280海里超过1.8,表明DNA从蛋白质充分自由。

DNA浓度(单体)股票的解决方案是由紫外线spectrophotometery决定,在适当稀释样品,使用摩尔吸收系数6600米¹厘米⁻¹在260纳米24]。股票的解决方案是储存在4°C。

研究铂复杂的相互作用与DNA、股票的解决方案是由溶解的复杂Tris-HCl缓冲区用于这项研究最终浓度为0.5毫克毫升⁻¹和孵化后24 h在37°C DNA。

2.2。合成的竞购₂(下降)

适当数量的二苯邻二氮杂菲配体(DIP)(1更易)在甲醇(5毫升)添加一滴一滴地[PtC1搅拌的解决方案₂(DMSO)](1更易)在同一溶剂(30毫升)。12 h(搅拌后光红色固体收集,用甲醇和乙醚洗净,干空气中。频频出现83%。肛交。Calc。对于C₂₄H₁₆N₂Cl₂Pt: C, 48.0;H, 2.67;4.67 N,。发现:C, 48.5;H, 2.9;4.5 N,。¹H NMR的复杂:苯酚的配体(d, 2 H原子),苯酚的配体(d, 2 h原子),苯酚的配体(d, 2 h原子),(m、10 H原子的苯组)。¹H NMR倾斜的配体:苯酚的配体(d, 2 H原子),苯酚的配体(d, 2 h原子),苯酚的配体(d, 2 h原子),(m、10 H原子的苯组)。在¹Pt (DIP) Cl H NMR谱₂4的信号由于各种质子,7-diphenyl-1 10邻二氮杂菲配体被认为与相应的自由配体和转移络合。

2.3。方法

获得的复杂的特点是通过元素分析、紫外-¹H NMR光谱。元素分析进行使用贺利氏中文元素分析。的¹H NMR光谱被记录下来的力量皇冠DPX 200 MHz(4.7特斯拉)使用CDCl光谱仪₃溶剂和钠3 -(三甲基硅烷基)tetradeuteriopropionate内部标准。

吸光度光谱记录使用惠普分光光度计(安捷伦8453)。圆二色性(CD)测量记录在JASCO (j - 810)分光偏振计。解决方案的DNA和铂,准备如前所述,在0.5厘米(1毫升)扫描石英试管。孵化后的光谱记录24小时的37°C。测量粘度,粘度计(散粒AVS 450)恒温器在25°C的恒温浴使用。流时间与数字秒表测量;三个重复的平均值测量被用来评估粘度的样本。数据被报道与那= (DNA) /(竞购₂(DIP))比(25),是DNA溶液的粘度。DNA融化的研究中,我们使用一个卡里(UV 100生物)分光光度计配有温度控制器(复杂分100生物)和电池座的温度变化为:35岁,40岁,45岁,50岁,55岁,60岁,65,70,75,80,85,90°C。

所有荧光测量进行了JASCO荧光谱仪(FP6200)。

3所示。结果与讨论

3.1。电子光谱

电子吸收光谱最初是用来研究DNA复合物的绑定。在目前的研究中,Pt(2)复杂的交互CT-DNA一直在监视水溶液。整除的DNA溶液以恒定浓度等于孵化与Pt复杂0.1 - -0.7的值在10毫米Tris-HCl缓冲区,在37°C (pH值7.2)。的值计算从以下方程:。DNA约为260纳米的紫外线波段在没有监控,存在不同数量的Pt (II)复杂。“深色”效应和“浅色”效应是DNA有关其双螺旋结构的光谱特性(26]。相对应的光谱变化过程反映了DNA的变化在其构象和结构药物后绑定到DNA。减色性收缩的结果的DNA螺旋轴,以及DNA构象的变化;相比之下,hyperchromism来源于损害DNA双螺旋结构(27,28]。相比之下,如图2的吸收光谱DNA复杂浓度增高而增强。这是一个典型的“深色”效应表明,DNA双螺旋结构受损后复杂的绑定到DNA通过夹层模式。

3.2。热变性实验

加合物形成的后果在CT-DNA双螺旋结构的稳定性被记录的DNA化验融化概要文件。热行为的DNA复合物的存在能够让你了解他们的构象变化当温度提高,提供配合物与DNA的相互作用强度的信息。CT-DNA通过氢键和静电相互作用的稳定的共价复合物通过测量融化温度进一步评估。我们测量吸光度的变化在260 nm作为温度的函数对小牛胸腺DNA在没有和复杂的存在。我们的实验进行了CT-DNA没有和不同数量的白金复杂的存在。的变性温度增加复杂的DNA(比和0.4,分别地;图3)。变性温度增加为67、70、75和84.5°C的比例复杂DNA (和0.4,分别地)。的se results are due to the stabilization of the DNA helix in the presence of intercalative complex. This stabilizing action of complex is very similar to that of previously observed for daunomycin [29日],cryptolepine [30.]和Chlorobenzylidene [31日]。这提供了另一个支持复杂的DNA双螺旋结构的夹层。

3.3。圆二色性

圆二色性(CD)光谱学是一个非常有用的方法来分析结构的光学活性的蛋白质和DNA等材料;因此,CD技术被用来确定DNA构象变化引起的复杂的pt。需要注意的是,《铂(II)复杂的光学活性,因此不表现出任何CD光谱。CD光谱测量在不同比率的复杂的DNA。小牛胸腺DNA的观察到CD谱由一个积极的乐队在275海里由于基地叠加和消极的乐队在245 nm由于螺旋性,在右撇子B DNA的特征形式,在紫外区域(32]。CD研究的结果表明,通过增加(复杂的)/ (DNA)比,明显的变化发生在CD光谱B-DNA(图4)。-带的强度降低(转向零水平)以及一个增色效应(红移)约4.0纳米,而积极的乐队显著增加没有任何波长的变化(图4)。类似CD光谱的变化与不同的解释报告。例如,一些研究人员认为,这种类型的CD光谱的变化可能反映了一个从b DNA结构转向一些贡献从一个像构象(33,34),但这种现象可能是由于槽绑定稳定DNA的右手B形式(35]。这种增强的CD的DNA在275海里是由于扭曲诱导DNA结构(36]。我们认为CD信号的增加大约275海里连同增加的白金复杂是一个重要的证据的夹层复杂的碱基对,他与其他研究者报道的数据(37,38),也证实了我们的其他证据。此外,CD光谱的红移245海里表明芳香环之间存在相互作用的复杂和DNA碱基对37]。此外,摩尔椭圆率值是根据公式计算(39]: 在哪里是摩尔椭圆率值在一个特定的波长以度表示厘米吗²dmol⁻¹,核苷酸磷酸的摩尔浓度每升,细胞的长度在dm,(°)中观察到的旋转度。结果总结在表1。

3.4。粘度测量

作为一种手段进一步探索复杂的绑定DNA,粘度测量是由不同的DNA的浓度增加了复杂的解决方案。的值相对特定的粘度与()没有在三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液复杂的存在,被绘制(图5)。图5显示特定的DNA样本的粘度明显增加的复杂。粘度的研究提供了一个强有力的论点夹层(40]。众所周知,槽粘合剂像赫斯特33258年不会引起的轴向长度增加DNA,因此没有改变的相对粘度。相比之下,顺铂是已知扭结DNA通过共价结合,缩短双螺旋结构的轴向长度,造成溶液的相对粘度下降。也部分intercalators减少轴向长度观察相对粘度降低,而经典的有机intercalators如溴化乙锭的轴向长度增加DNA和它变得更加刚性导致增加相对粘度(41]。结果证实粘度测量灵敏度的DNA结合的不同模式。本文观察到,提高铂复杂铅浓度DNA的粘度增加。因此,我们可以推断出[竞购₂(浸)]复杂,当然是一个DNA intercalator。从本质上说,b形式的线性段DNA的长度是由堆叠的碱基对的厚度沿螺旋轴在范德瓦耳斯相互接触。另一个芳香分子引入到堆栈因此增加了长度。所以,我们认为造成的DNA的粘度增加的复杂的可以提供进一步支持的intercalative模式绑定。自交互铂(II)与DNA可以让DNA不再复杂,我们可以期待DNA相对粘度的增加,边坡在0到0.96之间(测量值为溴化乙锭(42)如果Pt (II)的夹层复杂要么只有一个交互模式或强于其他交互(年代)。但是,在这项研究中,DNA的相对粘度增加斜率为0.71(图5)和合理的认为,可能是其他DNA之间的相互作用(s)和Pt(2)复杂的发生和合理的减少的斜率。这些结果清楚地表明,使用一些技术来确定夹层的重要性。

3.5。荧光研究

激发波长为280 nm用于发射光谱的荧光测量和记录在300到500纳米之间。激发和发射缝都是10 nm,和扫描速度是200 nm分钟⁻¹。荧光滴定实验由保持复杂浓度恒定和化学计量的不同DNA浓度。每个光谱扫描三次获得最终的荧光发射光谱。我们的结果(图6)表明,在存在过剩的DNA的荧光强度完全熄灭。这表明,所有分数的复杂与DNA的结合位点。Stern-Volmer情节进行DNA淬火获得通过使用Stern-Volmer方程: 在哪里=荧光团的荧光强度没有淬火;=荧光团的荧光强度淬火的存在;= Stern-Volmer常数;=弄熄的浓度。然而,Stern-Volmer地块进行淬火DNA的荧光强度偏离线性弄熄的浓度比M。此外,通过增加温度,复杂的荧光强度增加是否存在DNA溶液中,和随着温度的上升下降。这些结果表明,可能由DNA荧光的猝灭机理是一个静态猝灭过程(43),也就是说,一个复杂的形成和DNA碱基对之间的复杂。因为它是静态猝灭,猝灭常数被认为是复杂和DNA的形成常数(44,45]。

3.5.1。热力学测量

获得一个详细视图铂复杂和DNA之间的相互作用,一个强大的方法是解析绑定反应的自由能到它的组件。共价相互作用的四类,可以在绑定中发挥作用的药物分子生物分子氢键、范德华力、静电相互作用和疏水键相互作用。

在设置过程中,一个平面芳香发色团之间插入两个相邻螺旋DNA碱基对。另外,在小沟结合,isohelical药物分子结合在DNA小沟的诱导DNA显著的结构变化(46]。而复杂的由夹层形成稳定通过疏水相互作用和范德华力,复杂的由小沟结合形成稳定主要是通过疏水相互作用[46]。

因此,在这项研究中,形成常数complex-DNA加合物形成评估在四个不同的温度下(310年298年277年,27日,)允许焓等热力学参数的确定()和熵(范托夫方程)。绑定常数()从实验结果得到的值在四个不同的温度。热力学参数和计算从这些绑定常量。罗斯和同事(47)报道称,当或和,静电力主导互动;当和范德瓦耳斯相互作用或氢键主导反应;当和,疏水相互作用占主导地位的绑定过程。范霍夫的正斜率图表明,DNA的复杂的反应放热焓青睐。的和值complex-DNA加合物的−64.12焦每摩尔和−127.74 J /摩尔,分别。从热力学数据,很明显,虽然复杂的形成焓青睐,熵也是不好的。形成的复杂因此导致更加有序的状态,可能是由于冻结(修复)的动态复杂和DNA分子的自由。总之,熵和焓的变化证实的夹层模式绑定。

为了调查Pt复杂的模式绑定到DNA,中性红(NR)已经被用于检测反应的,NR大概最初结合DNA的夹层。中性红是一种平面吩嗪染料,一般来说,在结构上类似于其他平面染料,例如,那些吖啶,噻嗪、氧杂蒽类。近年来,荧光NR染料与DNA的相互作用已经证明了光谱光度测量的(48和电化学49)技术。与常见的荧光探针相比,溴化乙锭(EB) [50,51),NR染料提供了低毒性、高稳定性和方便使用的52]。此外,它的解决方案保持稳定长达2年。荧光光谱收集固定(NR)从溶液和不同浓度(DNA)。因此,NR可以用来探测小分子与DNA的相互作用。的Pt NR-DNA复杂解决方案,一些NR分子被释放到溶液与Pt复杂交换后,这导致荧光猝灭(图7)。这支持复杂的视图插入到DNA (53]。

4所示。结论

新铂(II)复杂CT-DNA高亲和力的表现。不同的仪器方法被用来研究的互动机制。结果支持了这样的观点,即复杂可以绑定CT-DNA夹层。DNA的吸收光谱显示hyperchromism发展很大程度上的光谱。Hyperchromism通常是DNA之间的相互作用的特征和复杂的强烈叠加芳发色团之间的交互和碱基对。荧光研究显示一个明显的减少排放的DNA。范霍夫阴谋的正斜率之间的反应表明,复杂和DNA enthalpy-favored (焦每摩尔)。CD结果显示深CT-DNA双螺旋构象变化在绑定的复杂。相对粘度的增加以及熔化温度的CT-DNA复杂显示夹层的存在必须绑定的主要形式。

承认

金融Razi大学研究中心的支持。