生物无机化学与应用

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体积2011年| 文章的ID674149年| https://doi.org/10.1155/2011/674149

超氧化物阴离子的作用氧化还原变化影响生理上发生铜(I)谷胱甘肽复杂

赫尔南Speisky ,^1、2 卡米洛·Lopez-Alarcon,³ 克劳迪奥·Olea-Azar,² 克里斯蒂安·Sandoval-Acuna,¹ 和玛格丽塔·e·阿里³

学术编辑器: Zhe-Sheng陈

收到了 07年6月2011年

接受 2011年7月15日

发表 2011年9月20日

文摘

生理上发生copper-glutathione复杂,[铜(I) -(谷胱甘肽)₂),有能力不断与氧反应,生成过氧化物阴离子()。这里解决的影响,除过氧化物的氧化还原状态铜(I)、谷胱甘肽存在于这样的复杂和评估的形成铜(II) -GSSG最后氧化产品。此外,我们研究的一个来源的潜力外部的铜(I) -(谷胱甘肽)₂复杂的,以防止其氧化。删除从铜(I) -(谷胱甘肽)₂包含解决方案,无论是自发或Tempol-induced,导致谷胱甘肽时间损失大于那些影响的金属。谷胱甘肽的损失并没有伴随着GSSG增量,但很大程度上是由铜(II)的累积形成-GSSG分子。值得注意的是,铜(I)、谷胱甘肽的氧化还原变化时完全避免铜(I) -(谷胱甘肽)₂coincubated了次黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶。数据表明,生成的铜(I) -(谷胱甘肽)₂意味着必须形成一个中间的后续氧化成铜(II) -GSSG或还原成铜(I) -(谷胱甘肽)₂青睐的删除或增加,分别。

1。介绍

铜(I)细胞内谷胱甘肽复杂的形成被认为是在铜之间的互动^{2 +}离子和减少谷胱甘肽(GSH)。事实上,暴露后的人类肝癌细胞(hac) [1,2]或肠道上皮细胞(Caco-2) [3)铜、大部分的金属是恢复绑定到谷胱甘肽分子,形成,最有可能的是,铜(I) -(谷胱甘肽)₂复杂。后者复杂的确切生物学作用尚未完全建立。然而,一些研究表明,它可能扮演一个角色作为承运人的铜(I) copper-dependent酶、SOD等(4),和copper-storing copper-transporting蛋白质,如金属硫蛋白(5,6)和血浆铜蓝蛋白(7),分别。

在无细胞的系统研究表明,混合铜^{2 +}离子和谷胱甘肽在摩尔比率等于或大于1:3导致迅速形成铜(I) -(谷胱甘肽)₂(8- - - - - -10),(Rx。)

铜(I)谷胱甘肽的形成复杂的支持了¹h - nmr、电子顺磁共振研究[4,11),需要一个初始化学计量减少铜^{2 +}谷胱甘肽和随后的亚铜离子螯合两个额外的谷胱甘肽分子(10]。谷胱甘肽的绑定建议稳定铜(I)的形式,对长时间,被认为redox-inactive由于复杂的展品在含氧的相对稳定的解决方案(4,12- - - - - -14]。认为这样的概念,我们最近提供了证据来支持论点,而不是redox-inactive铜(I) -(谷胱甘肽)₂复杂的能与氧气反应,可逆反应导致超氧化物自由基的形成和一个“中间氧化情结”(IOC) (15,16)(Rx。)

一个重要的“例外”的可逆性(Rx。)将由superoxide-interceptor在媒体的存在。事实上,我们最近描述(16),增加SOD溶液含铜(I) -(谷胱甘肽)₂导致形成一个稳定的产品的核磁共振光谱相同的预成型的铜(II) -GSSG复杂。因此,清除超氧化物(Rx。)似乎把氧化奥委会转化为铜(II) -GSSG大概是不可逆转的方式。在目前的研究中,我们解决了氧化还原变化,导致条件下超氧化物清除,影响金属和硫醇在铜(I) -(谷胱甘肽)₂复杂的在其氧化转换成铜(II) -GSSG。此外,我们调查的潜在来源的超氧化物阴离子,外部(Rx。),以防止氧化的铜(I) -(谷胱甘肽)₂铜(II) -GSSG。

2。实验

2.1。化学药品和试剂

氯化铜(),减少谷胱甘肽(GSH)、氧化谷胱甘肽(GSSG)、谷胱甘肽还原酶(GR);提到过1.6.4.2。从面包酵母),β烟酰胺腺嘌呤二核苷酸2′磷降低水合物四钠盐(NADPH),次黄嘌呤(HX)、黄嘌呤氧化酶(XO);提到过1.17.3.2。从牛牛奶),bathocuproine二磺酸(BCS)和5 - (3-carboxy-4-nitrophenyl) disulfanyl-2-nitrobenzoic酸(DTNB)都从Sigma-Aldrich购买。4-hydroxy-2 2 6 6 -tetramethylpiperidine-1-oxyl (Tempol)从Calbiochem购买。EDTA Bio-Rad实验室。所有准备在水溶液chelex - 100治疗三羟甲基氨基甲烷缓冲液(20毫米;pH值7.4)。

2.2。Copper-Glutathione复合物的制备

铜(I) -(谷胱甘肽)₂复杂的准备之前报道(15),混合CuCI₂与谷胱甘肽1:3摩尔比率。每当指给定浓度的复杂,应该被理解,它反映了铜的浓度用于准备。铜(II) -GSSG复杂(在预成型的复杂)被直接混合CuCI准备₂和GSSG 1: 1摩尔比率如前所述[17]。除非另有指示,解决方案包含铜(I) -(谷胱甘肽)₂和铜(II) -GSSG复合物总是准备立即使用前(90秒)。

2.3。测定Thiol-Titratable组

Thiol-titratable团体(TTG)量化用人DTNB硫醇反应剂(18,19]。O的增加与形成的5′-thio-2-nitrobenzoic酸(TNB)监测在30°C 96孔板使用多模标(协同HT),正如前面做的(20.]。试验是由样本的铜(I) -(谷胱甘肽)₂复杂的(Tempol-treated和控制)解决方案包含DTNB(24的混合物μM) + EDTA(2毫米)。结果估计使用摩尔吸光系数的14.15毫米⁻¹厘米⁻¹(21),表示为谷胱甘肽的等价物。控制实验使用谷胱甘肽,而不是复杂的。

2.4。确定铜(II) -GSSG复杂

铜(II)的浓度-GSSG在解决方案包含的复杂所描述被评估为邮政et al。17),测量光密度在625 nm Unicam他λiosα分光光度计。同样,如此复杂的形成在一个解决方案包含一个混合的铜(I) -(谷胱甘肽)₂复杂+ Tempol(0 - 90分钟期间孵化)也被评估在625海里。无论是铜^{2 +}谷胱甘肽,铜(I) -(谷胱甘肽)₂,或在这些波长Tempol表现出显著的吸光度。结果使用60米的摩尔吸光系数的估计⁻¹厘米⁻¹(17),表示为毫克分子浓度的铜(II) -GSSG。

2.5。测定EDTA-Releasable氧化谷胱甘肽

铜(II) -GSSG评估采用NADPH /谷胱甘肽还原酶测定,所描述的研究院和蒂策(资助22),但在添加EDTA(2毫米)。O的衰变与辅酶ii的形成有关⁺监控在30°C。试验开始后NADPH,谷胱甘肽还原酶和EDTA试管包含一个刚做好的铜(I) -(谷胱甘肽)₂复杂,铜(I) -(谷胱甘肽)₂复杂preincubated Tempol在90分钟,或预制铜(II) -GSSG复杂。结果估计使用摩尔吸光系数的6.22毫米⁻¹厘米⁻¹NADPH [23),表示为微摩尔的浓度。因此,他们代表的总和自由GSSG加上GSSG释放通过添加EDTA铜(II) -GSSG复杂试验中媒体。

2.6。亚铜离子的测定

铜(I)是评估如前所述24),使用bathocuproine铜(I)螯合剂。O的增加相关的铜(I) - (BCS)₂复杂的形成是监控30°C。试验是由添加BCS (500μ米)样本含有铜(I) -(谷胱甘肽)₂复杂,preincubated 0-60 min)中(Tempol的存在或没有。结果估计使用摩尔吸光系数的12.25毫米⁻¹厘米⁻¹(24),表示为微摩尔的浓度的铜(I) -bathocuproine。

2.7。测定Thiol-Titratable团体和铜(I)的混合铜(I) -(谷胱甘肽)₂+次黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶

铜(I) -(谷胱甘肽)₂复杂是孵化的次黄嘌呤(HX;0.2毫米)+黄嘌呤氧化酶(XO;2 U /毫升)在1-60 min (30°C)。自XO被发现显著贡献自己的硫醇TTG化验,切除是必要的。因此,混合物含酶的离心机(4000×g, 40分钟4°C)通过Ultrafree-CL管(离心过滤设备;100000年NMWL微孔)。超滤液因此获得受到above-referred TTG, EDTA-releasable GSSG和铜(I)化验。

2.8。数据表达和分析

数据点代表的至少3独立运营的实验中,进行了一式三份。为了简单起见,因为标准差值代表了不到5%的手段,这些都是省略了从所有角度图(即。,数据1,2,4,6)。的数字3,5,7酒吧图表(策划),然而,因为一些意味着展出标准差大于5%,后者包括。评估时,酒吧的统计显著性区别使用学生的评估t以及。GraphPad棱镜4作为统计软件。

图1

Tempol对thiol-titratable组铜(I) -(谷胱甘肽)₂复杂。Tempol被添加到解决方案包含铜(I) -(谷胱甘肽)₂复杂的混合物在30°C的环境0-60分钟。这样的样本添加了孵化DTNB (24μ米)和OD的增加_412海里注册后5分钟。结果表示为谷胱甘肽等价物(μ米)。这些符号代表(■):谷胱甘肽(30μ米);(○)铜(I) -(谷胱甘肽)₂(10μ米);(●)铜(I) -(谷胱甘肽)₂(10μM) + Tempol (8μ米)。插入的图中显示结果进行同样的实验,但37°C,在0 30分钟。

图2

时间形成铜(II) -GSSG Tempol添加后的铜(I) -(谷胱甘肽)₂复杂。Tempol被添加到解决方案包含铜(I) -(谷胱甘肽)₂复杂的混合物在37°C的环境0 - 90分钟。采集标本在孵化和增加O注册。结果表示为毫米铜(II) -GSSG浓度。这些符号代表:(♦)铜(II) -GSSG(5毫米);(■)谷胱甘肽(15毫米);(○)铜(I) -(谷胱甘肽)₂(5毫米);(●)铜(I) -(谷胱甘肽)₂(5毫米)加上Tempol(4毫米)。

图3

EDTA对经济复苏的影响铜(II)的GSSG -GSSG NADPH /谷胱甘肽还原酶测定复杂的化验。NADPH(0.2毫米),谷胱甘肽还原酶(2 U /毫升),和EDTA (2 mM)被添加到解决方案包含GSSG (36μ米)或预制铜(II) -GSSG复杂(36μ米)。减少O注册和结果表示为μM GSSG浓度。酒吧的星号表明这样的值在统计上不同,在一个水平从所有其他值。

图4

评估的GSSG EDTA-modified NADPH /谷胱甘肽还原酶测定:GSSG与铜(II) -GSSG之间的相关性。NADPH(0.2毫米),谷胱甘肽还原酶(2 U /毫升),和EDTA (2 mM)被添加到解决方案包含增加浓度的铜(II) (5-60 -GSSG复杂μ米)。结果表示为μM GSSG浓度。符号代表:解决方案包含铜(II) (5-60 -GSSG复杂μ米)化验在(■)或在缺乏EDTA (□)。

图5

复苏的GSSG Tempol-treated铜(I) -(谷胱甘肽)₂复杂的使用EDTA-modified NADPH /谷胱甘肽还原酶测定。GSSG评估应用NADPH /谷胱甘肽还原酶试验解决方案包含纯GSSG(18或54μ米),铜(I) -(谷胱甘肽)₂复杂(36μ米)或Tempol-treated铜(I) -(谷胱甘肽)₂复杂(36μM)。分析运行的存在或缺乏EDTA(2毫米)。结果表示为μM GSSG浓度。酒吧的星号表明这样的值在统计上不同,在一个水平从所有其他值。

(一)

(b)

图6

(a)的变化thiol-titratable团体和EDTA-releasable GSSG在暴露的铜(I) -(谷胱甘肽)₂Tempol复杂。决心的TTG(圈),DTNB(24的混合物μ米)+ EDTA(2毫米),的GSSG(三角形),NADPH的混合物(0.2毫米)+谷胱甘肽还原酶(2 U /毫升)和EDTA(2毫米)被添加到从孵化获得样本(0-60分钟30°C)的铜(I) -(谷胱甘肽)₂复杂的(10μ米)的存在(符号)关闭或没有(符号)开放Tempol (8μ米)。结果表示为谷胱甘肽等价物(μ米)。(b)铜(I)的变化在暴露的铜(I) -(谷胱甘肽)₂Tempol复杂。铜(I)的测定(圈),bathocuproine (500μ米)被添加到从孵化获得样本(0-60最小,在30°C)的铜(I) -(谷胱甘肽)₂复杂的(10μ米)的存在(符号)关闭或没有(符号)开放Tempol (8μ米)。铜(I)在O化验结果表示为铜(I) -bathocuproine (μ米)。

(一)

(b)

图7

(a)的影响的铜(I) -(谷胱甘肽)₂上的外源性超氧化物自由基来源thiol-titratable团体和EDTA-releasable GSSG。次黄嘌呤(0.2毫米)+黄嘌呤氧化酶(XO);2 U /毫升)被添加到解决方案包含铜(I) -(谷胱甘肽)₂复杂的(10μ米),混合是孵化0-60分钟,30°C。样本取自孵化媒体1后,30和60分钟测试和分析(浅灰色栏)和EDTA-releasable GSSG(深灰色栏)的水平。结果表示为谷胱甘肽等价物(μ米)。(b)的影响的铜(I) -(谷胱甘肽)₂对外源性超氧化物自由基的来源在铜(I)的浓度。次黄嘌呤(0.2毫米)+黄嘌呤氧化酶(XO;2 U /毫升)被添加到解决方案包含铜(I) -(谷胱甘肽)₂复杂的(10μ米)和混合孵化0-60分钟,30°C。样本取自孵化媒体1后,30和60分钟和分析铜(I)的浓度。结果表示为铜(I) -bathocuproine (μ米)。酒吧的星号表明这样的值在统计上不同,在一个水平从所有其他值。

3所示。结果与讨论

先前的研究表明谷胱甘肽和铜之间的交互^{2 +}离子导致的迅速形成1:2 copper-glutathione复杂,大概是铜(I) -(谷胱甘肽)₂(所示(Rx。))(8,10,25]。按照提出的化学计量学等近20μM thiol-titratable浓度组(TTG)可以恢复解决方案包含一个刚做好的10μM浓度的铜(I) -(谷胱甘肽)₂复杂(图1)。然而,相同的图所示,硫醇的稳定性可以显著影响这些解决方案的唯一孵化30°C。事实上,TTG开始稳步下降的水平,达到60分钟后三分之一的初始值(近7μ米)。这样的降幅明显增加时,解决方案包含铜(I) -(谷胱甘肽)₂复杂coincubated在30°C,但在Tempol (8μ米)。事实上,TTG水平下降了75%,达到5μM浓度15分钟和30分钟后完全消失后孵化。因为Tempol没有氧化谷胱甘肽分子(图中未显示),影响其TTG-declining效果将归因于其过氧化物dismutase-mimetic属性(26,27]。一座类似的但是明显更加速TTG-declining Tempol效果观察,当铜(I) -(谷胱甘肽)₂复杂和Tempol coincubated 37°C,而不是30°C(插入图1)。在这种情况下,的浓度thiol-titratable组10分钟后已经可以忽略不计了。从图中,很明显,然而,唯一孵化在37°C本身具有相当大的TTG-declining效果。这种“Tempol-like效应”的温度可以解释最近报道随温度而变的速率的增加超氧化物自由基生成的复杂(Rx。)进行自发的歧化作用[16,28]。

评估TTG Tempol引起的损失是否出现氧化的谷胱甘肽分子绑定到铜(I)(在复杂),GSSG量化在样本above-referred Tempol-treated复杂使用特定NADPH GSSG /谷胱甘肽还原酶测定(22]。说20μM TTG图中观察到的损失1仅仅来自铜(I)绑定的氧化谷胱甘肽分子,10的增量μ米GSSG将预期的浓度。然而,我们发现,在孵化后的复杂与Tempol 30分钟(30°C)的浓度GSSG assayable在媒体上只有5μM(没有显示)。值得注意的是,这样的浓度已经出现在时间为零,当解决方案包含刚做好的复杂没有孵化或Tempol的存在。因此,GSSG的“有限复苏”,也就是说,只有5μM(而不是最初的和5μM +预期10μM增量GSSG)表明测试的实际损失包括代GSSG分子不能直接量化的NADPH /谷胱甘肽还原酶测定。

最近,利用EPR和核磁共振技术,我们观察到孵化的铜(I) -(谷胱甘肽)₂与SOD导致总消失的如此复杂和伴随的积累新的复杂被确认为铜(II) -GSSG [16]。因此above-referred只有部分复苏的TTG GSSG的形式从Tempol-treated铜(I) -(谷胱甘肽)₂复杂的假设可以解释所有新成立的GSSG分子最终必将铜(II)离子。在这样的形式,GSSG分子可以避免直接量化的NADPH /谷胱甘肽还原酶测定。在后者的观点考虑,我们利用早期的报道能力的铜(II) -GSSG复杂吸收625海里(17]。如图2孵化的铜(I) -(谷胱甘肽)₂(5毫米)Tempol(在37°C)导致了时间,持续和线性形成铜(II) -GSSG。90分钟后,近80%的初始浓度的铜(I) -(谷胱甘肽)₂被转换成铜(II) -GSSG。同样的实验在插入图1测试,评估,我们观察到的唯一孵化铜(I) -(谷胱甘肽)₂在37°C, 90分钟后,接近30%的氧化(图2)。因此,条件加速产生的超氧化物阴离子的歧化作用(Rx。)(是否Tempol-mediated或温度引起)似乎忙不可逆转换的铜(I) -(谷胱甘肽)₂在铜(II) -GSSG ((Rx。)和(Rx。))

虽然测量OD在625 nm似乎有用的评估铜(II)的发生和形成-GSSG,其应用仅限于只有毫克分子浓度的这样复杂的估计()[17]。因此,为了评估微摩尔的浓度的氧化(Tempol-mediated)转换(将发生在生物系统)的铜(I) -(谷胱甘肽)₂铜(II) -GSSG,我们进行了实验旨在量化这些GSSG分子绑定到铜(II)。等已经表明,分子似乎没有可量化的NADPH /谷胱甘肽还原酶测定。图3显示的水平GSSG获得在应用这种分析的样品免费GSSG分子和预制铜(II) -GSSG复杂。如图所示,几乎没有恢复GSSG分子(少于1%)的样品含有铜(II) -GSSG (36μ然而,米)。后者是完全逆转NADPH /谷胱甘肽还原酶测定时在EDTA的存在。事实上,在这样的试验条件下,100%的铜(II)中包含GSSG -GSSG复杂的恢复(图3)。因此,EDTA并不影响GSSG康复解决方案包含二硫化完全免费。因此,全面复苏GSSG从溶液含铜(II) -GSSG表明EDTA使GSSG分子免费与还原酶反应。两种EDTA (29日]和GSSG [30.能够螯合铜(II)。铜(II) edta(的稳定常数)[29日),然而,五个数量级高于铜(II) -GSSG ()[30.]。因此,在EDTA、铜(II)离子最有可能被有效地清除铜(II) -GSSG。如图4应用NADPH /谷胱甘肽还原酶+ EDTA浓度测定各种预制的铜(II) -GSSG复杂允许复杂的间接和总量化。线性5-60等试验条件成立μ米范围内的浓度(图4)。

利用EDTA的能力释放GSSG绑定到铜(II)、铜(II)的形成-GSSG Tempol-treated铜(I) -(谷胱甘肽)₂定量的解决方案是重新。区分自由和铜(II)绑定GSSG分子,二硫化的水平进行评估没有和EDTA分析媒体的存在,分别(图5)。当一个36μ米铜(I) -(谷胱甘肽)₂解决方案(由混合36μ米的铜^{2 +}+ 108μ谷胱甘肽的M)在缺乏EDTA的化验,一个18岁μ米二硫化GSSG是恢复自由的浓度。这种浓度完全对应,将发生,如果在(Rx。)、谷胱甘肽氧化已出现专门从最初的铜的还原^{2 +}离子需要形成铜(I) -(谷胱甘肽)₂复杂。一个相同的结果被发现GSSG化验时,也没有EDTA, Tempol-treated铜(I) -(谷胱甘肽)₂解决方案(图5)。反过来,当后者的解决方案是化验的EDTA, GSSG恢复的总浓度从18岁μM - 54μm .后者价值对应完全18的总和μM(发生自由GSSG) + 36μ米(EDTA GSSG发布的铜(II) -GSSG复杂)。根据这些结果,可以估计GSSG绑定到铜(II)的浓度,即铜(II) -GSSG复杂,通过减去GSSG化验的浓度估计的缺席EDTA的存在。图6(一)显示的结果应用这种EDTA-dependent GSSG复苏化验铜(I) -(谷胱甘肽)₂包含解决方案没有孵化或Tempol的存在。而图的下行曲线6(一)描述TTG影响复杂的损失在60分钟的孵化(数据图1),提升的节目中相应的增量EDTA-releasable GSSG。在这两种情况下,结果表示为谷胱甘肽的等价物,进行对比。有趣的是,无论Tempol添加到复杂,TTG沿着时间的损失伴随着相伴,但只有quantitatively-partial获得EDTA-releasable GSSG(图6(一))。例如,在Tempol-treated解决方案的情况下,复杂了全损的TTG 30分钟后,减少从20μM为0μ谷胱甘肽eq。反过来,GSSG的获得是只有一半的损失,所体现的谷胱甘肽eq.从10增加μ米到20μm .因此,30分钟后,只有50%的TTG消失可以占的形成EDTA-releasable GSSG。相对,60分钟的孵化后,谷胱甘肽的损失完全由GSSG估计增量。事实上,GSSG从10的浓度μ米至30μ20 M谷胱甘肽情商,平整μ谷胱甘肽的M eq.早已经失去了作为测试。缺乏谷胱甘肽之间的对应eq.失去一样TTG和那些获得EDTA-releasable GSSG看到后30分钟可以解释假设Tempol加速氧化的变化铜(I) -(谷胱甘肽)₂分子导致的形成一个“中间氧化情结”。据推测,这种中间的结构将包括某种形式的硫醇,并非DTNB反应(即。,not titratable as TTG) or disulfides that are not susceptible to be quantified by the EDTA/NADPH/glutathione reductase assay (different from Cu(II)-bound GSSG molecules). The formation of such intermediate (referred to as IOC in (Rx。)将先于并可能导致铜(II)的形成-GSSG复杂。

我们进一步理解的改变参与氧化转换铜(I) -(谷胱甘肽)₂铜(II) -GSSG,我们调查是否暴露前复杂Tempol涉及时间变化对铜与谷胱甘肽。如图6 (b),Tempol导致了时间的浓度减少铜(I)、铜(I)评估的-bathocuproine试验(24]。有趣的是,经过30分钟的孵化,几乎50%的铜(I)仍。后者形成鲜明对比的是,在指定的时间,100%的TTG已经消失(数据图6(一))。之间缺乏对应的氧化变化的大小影响铜(I)和内谷胱甘肽铜(I) -(谷胱甘肽)₂复杂表明,30分钟后,铜(I),因此将不再形式如此复杂的一部分。至于TTG,铜(I)的消失的程度如图6 (b)也加速了Tempol。这两个变化支持清除超氧化物的概念(Rx。)倾向于假定的中间的转换成铜(II) -GSSG (Rx。从图)和符合数据2所示,Tempol加速如此复杂的形成。

此外,当铜(I) -的孵化(谷胱甘肽)₂加上Tempol延伸至60分钟,时间100%的铜(I)(图消失了6 (b)),一个失去了100%的TTG在等时间可以恢复EDTA-releasable GSSG(图6(一))。后者变化表明,60分钟后,清除超氧化物的Tempol保证铜的总转化率(I) -(谷胱甘肽)₂复杂(及其氧化中间)到铜(II) -GSSG。有趣的是,这样的转换也发生即使没有Tempol,但是速度要慢得多,这表明超氧化物自由基生成(Rx。)也接受这样的孵化条件下自发的歧化作用(30°C)。

基于上述结果,我们建议删除超氧化物阴离子(Rx。)(是否自发或Tempol-induced)时间依赖性导致谷胱甘肽的氧化消失(证明通过损失TTG和形成EDTA-releasable GSSG)和铜(I)铜(I) -(谷胱甘肽)₂。基于这样的观点,我们追求额外的实验调查superoxide-dependent可逆性(Rx。)。具体来说,我们评估是否增加超氧化物的流在这样的反应,通过一个外生等自由基的来源,可以缓慢的速率铜(I) -(谷胱甘肽)₂复杂的经历氧化谷胱甘肽和铜(I)。因此,解决方案包含铜(I) -(谷胱甘肽)₂是孵化(在1日30或60分钟)没有或次黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶的存在(HX / XO)。图7(一)描述了变化在TTG和EDTA-releasable GSSG水平,表达两方面的变化谷胱甘肽的等价物。的孵化,铜(I) -(谷胱甘肽)₂+ h / XO阻止了近70%和72%的损失TTG观察否则30和60分钟,分别。关于成立EDTA-releasable GSSG, HX / XO完全避免复杂的时间增量进行了过氧化物的没有额外的来源。与这些结果一致,HX / XO混合物也完全阻止时间损失bathocuproine assayable铜(I)离子(图7 (b))。因此,数据从数据7(一)和7 (b)支持的概念(Rx。)确实是可逆的,建议,防止产生的超氧化物阴离子的清除这样的反应是维持平衡的关键和安全,在相同的反应,国际奥委会提出,而不是转向铜(II)的形成-GSSG复杂(Rx。),将主要再生铜(I) -(谷胱甘肽)₂复杂(Rx。)。大多数细胞含有大量的SOD和许多其他分子容易与过氧化物反应,如谷胱甘肽和抗坏血酸盐浓度可以达到毫克分子在细胞内。除了后者superoxide-reacting分子,铁蛋白,主要的细胞发生iron-storing蛋白质最近被报道与生成的超氧化物阴离子反应铜(I) -(谷胱甘肽)₂复杂的(31日]。因此,可以推测,由于存在各种过氧化物清除或反应分子,铜(I) -(谷胱甘肽)₂复杂的细胞内可能发生,不仅如此,而且铜(II) -GSSG, end-oxidation产品。

4所示。结论

清除超氧化物阴离子的解决方案包含铜(I) -(谷胱甘肽)₂复杂导致谷胱甘肽分子是更大的损失比大小影响金属铜(I)。自从TTG只有部分的损失占的铜(II) -GSSG分子积累,一个“中间氧化情结”的形成,其硫醇既不向DTNB反应也不容易被量化的EDTA / NADPH /谷胱甘肽还原酶测定,可以假定。自氧化谷胱甘肽下降和铜(I)是完全避免接触的铜(I) -(谷胱甘肽)₂复杂的外部源的过氧化物,建议过氧化物的生成(Rx。)意味着一个义务above-referred中级的形成。结果支持论点,中间的后续氧化成铜(II) -GSSG或其还原回铜(I) -(谷胱甘肽)₂可以被删除或添加支持超氧化物阴离子的媒体,分别。

承认

这项工作由FONDECYT赠款支持。1110018也没有。11090115。

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