文摘

锰过氧化物酶已被纯化培养滤液的同质性新真菌菌株传染媒介durissimusmtcc - 1173上使用浓度超滤和阴离子交换色谱diethylaminoethyl DEAE纤维素。纯化酶的分子质量被发现是42.0 kDa使用sds - page分析。的 值使用MnSO4和H2O2变量基质在50 mM乳酸acid-sodium乳酸缓冲pH值4.5 3 0 ∘ C 是59μM和32μM,分别。使用MnSO催化速率常数4和H2O2是22.4秒−1和14.0年代−1分别给出的值 c 一个 t / 0.38μ米−1年代−1和0.44μ米−1年代−1,分别。pH值和温度4和锰过氧化物酶的最适条件 2 6 ∘ C ,分别。的纯化MnP depolymerises腐殖酸在H2O2。锰过氧化物酶纯化展览haloperoxidase活动在低pH值。

1。介绍

锰过氧化物酶、MnP [E.C.1.11.1.13], heme-containing酶(1]。它已被证明在许多真菌菌株的培养滤液2- - - - - -5]。锰过氧化物酶的催化循环类似于其他血红素氧化酵素等辣根过氧化物酶(6)和木质素过氧化物酶(7,8),包括本机铁酶的活性中间体化合物和化合物II。催化循环可以如下所示: 米 n P + H 2 O 2 ⟶ 米 n P ( 我 ) + H 2 O ( 我 ) 米 n P ( 我 ) + 米 n 我 我 ⟶ 米 n P ( 我 我 ) + 米 n 我 我 我 ( 我 我 ) 米 n P ( 我 我 ) + 米 n 我 我 ⟶ 米 n P + 米 n 我 我 我 + H 2 O ( 我 我 我 )

H2O2氧化的酶两个电子形成MnP化合物(I) oxyferryl卟啉阳离子自由基(Fe4 += O P]+。锰(II)或酚类化合物可以作为还原剂MnP化合物(I)和表单MnP化合物(2)这是一个oxyferryl化学物种(Fe4 += O P),一个电子被氧化的酶。减少MnP的复合酶(II),锰(II)是绝对有必要的9,10]。

MnP是一个生物技术重要的酶在木质素的降解[广泛应用11),biopulping和纸行业的技术12),去除顽固的有机污染物(13),和酶促聚合14]。让这些在观点,我们从文化滤液净化锰过氧化物酶传染媒介durissimusmtcc - 1173及其酶的特点 温度、pH值和最适条件已经确定。解聚煤的纯化酶已经证明使用煤炭腐殖酸作为模型。MnP从f . durissimus也拥有haloperoxidase活动在低pH值。

2。材料和方法

2.1。化学物质

DEAE纤维素是σ化学公司,美国圣路易斯MnSO4、氯化钠和醋酸钠来自默克有限公司,孟买,印度,和乳酸,乳酸钠、丙二酸、丙二酸酯钠、草酸,草酸钠丁二酸、丁二酸钠,H2O2来自s.d精细化学。有限公司,孟买,印度,没有进一步的使用方法进行了净化。中使用的化学物质包括蛋白质分子量标记利用sds - page分析纯化后的酶从班加罗尔Genei经纪有限公司采购,班加罗尔,印度。

2.2。真菌菌株及其增长

土著木质素分解真菌菌株f . durissimus从MTCC MTCC - 1173采购中心和基因库,微生物技术研究所、昌迪加尔、印度。真菌菌株在生长介质是维护由“麦芽提取物20.0 g和琼脂20.0 g在1.0 L双重蒸馏水。“介质的pH值调整到6.5在温度25°C。

生产锰过氧化物酶的真菌菌株生长在一个中等15)含有葡萄糖10.0 g, KH每升”2阿宝40.2 g, CaCl20.11 g (NH4)2HPO40.264 g, MgSO4 ⋅ 7小时2O 0.05 g, ZnSO4 ⋅ 7小时2O 0.0425 g, MnSO4 ⋅ H2O 0.175 g, CoCl2 ⋅ 6小时2O 0.007 g, CuCl2 ⋅ 2 h2O 0.007 g, FeCl3 ⋅ 6小时2O 0.0009克氯化钠0.0009 g,酵母提取物0.2 g, veratryl酒精0.07 g,酒石酸3.0 g (pH值调整到4.5与40%氢氧化钠),和80 g(渐变”是补充道。包含20毫升的无菌培养瓶100毫升的液体培养生长介质孢子悬浮液接种1毫升(孢子密度 5 × 1 0 6 孢子/毫升)无菌,真菌文化生长静止的文化条件下30°C BOD(生化需氧量)孵化器。一毫升整除的液体培养真菌生长介质是24小时的定期收回,缝匠肌膜过滤器过滤(0.22μ米),分析了使用报告(锰过氧化物酶的活性16)方法。

2.3。酶测定

锰过氧化物酶的活性测定spectrophotometrically [16通过监测吸光度的变化 = 2 4 0 纳米由于乳酸Mn (III)的形成和使用的摩尔消光系数值65,00米−1厘米−1。反应溶液1毫升由“50μM MnSO4,50μM H2O2,合适的酶解的整除50 mM乳酸钠/乳酸缓冲pH值4.5 30°C。“一个酶单位转换1μ底物摩尔到产品在指定的试验条件下。UV / VIS分光光度计日立(日本)模型u - 2000配备了电子温度控制单元是用于光谱光度测量的测量。最少数量的吸光度测量是0.001吸光度单位。平均每个数据点都是一式三份测量标准偏差小于4%。

2.4。纯化的酶

锰过氧化物酶的纯化的真菌文化是生长在60 100毫升无菌培养瓶生长介质的每个包含20毫升如上所述。第五日接种真菌孢子的锰过氧化物酶活性达到最大值时,文化汇集,菌丝被通过四层纱布过滤,滤液和文化800毫升0.95国际单位/毫升活动集中与Amicon浓差电池型号8200使用PM10分子量的超滤膜。截止值10 kDa 10毫升。浓缩酶渗出反对1000倍超过10毫米琥珀酸钠缓冲pH值4.5一夜之间在20°C。分离酶加载在DEAE纤维素柱尺寸1厘米×22厘米是preequilibrated相同的缓冲区。50毫升的吸附酶被同一个缓冲区,并筛选了通过应用生理盐水梯度(0 - 400毫米;100毫升+ 100毫升= 200毫升)。5毫升分数被收集和分析了锰过氧化物酶活动金和格伦(报告的使用方法16使用Lowry方法)和蛋白质浓度(17]。活动分数是8200和集中Amicon浓度细胞模型和模型3之后,可以使用超滤膜可吸入颗粒物。浓缩酶被储存在4°C,用于进一步的研究。酶没有宽松的活动在这些条件下两个月。

2.5。SDS-Polyacrylamide凝胶电泳

酶制剂的同质性检查通过sds - page分析(18),分子质量是决定使用韦伯和奥斯本的方法19]。分离丙烯酰胺凝胶12% 0.375 Tris-HCl缓冲pH值8.8和堆积丙烯酰胺凝胶5% 0.063 6.8 M Tris-HCl缓冲区。蛋白质被染色和可视化Coomassie蓝色的r - 250。分子量标记被磷酸化酶(97.4 kDa),牛血清白蛋白(66.0 kDa),卵清蛋白(43.0 kDa),碳酸酐酶(29.0 kDa),大豆胰蛋白酶抑制剂(20.1 kDa)和溶菌酶(14.3 kDa)。凝胶的恒流运行20 mA使用Electragel 50 Technosource设备,孟买,印度。

2.6。稳态动力学

的 值锰(II)决定通过测量稳态速度对酶催化反应的不同浓度的锰(II)离子在一个固定的饱和浓度的H2O2和绘画双倒数图(20.]。反应的解决方案包括1毫升、100μM H2O2在50 mM乳酸acid-sodium乳酸缓冲30°C和MnSO pH值4.54不同于0.02毫米到15毫米不等。“5μg的酶与特定活动4 IU / mg补充道。为测定采用相同的程序 值H2O2除了H2O2浓度不同的范围从0.01毫米至12毫米的固定100毫米MnSO的浓度4。的 值计算的线性回归分析数据点双倒数的情节。纯化酶的最佳pH值是由测量稳态速度对酶催化反应的解决方案上面的成分不同的pH值在2.0到5.0范围使用50 mM乳酸/乳酸钠缓冲和绘制图表反应的稳态速度对pH值的解决方案。最佳温度是由测量稳态速度对酶催化反应的解决方案上面的成分的温度范围15到35°C和策划稳态速度和温度。

2.7。螯合剂对MnP的影响

不同的锰的影响(3)螯合剂分子“草酸,乳酸和丙二酸酯”对酶的活性决定通过测量酶的活性在不同浓度的锰(II)离子的存在缓冲区的螯合羧酸钠盐使用方法在文献报道[20.]。Mn(3)形成的初始速度被吸光度变化监测 = 2 7 0 海里,因为草酸锰(III)的摩尔消光系数值,Mn (III)乳酸和Mn (III)丙二酸酯,5500,3500,8500−1厘米−1分别是在文献[21]。反应溶液1毫升由100μM H2O2在适当的缓冲30°C和MnSO pH值4.54浓度变化范围在5μM - 140μM。“在每种情况下10μL 2国际单位/毫升纯化酶的添加。稳态的Mn率(3)生产使用上面的摩尔系数值计算。稳态Mn (III)螯合物的生成速率μ摩尔/分钟策划反对MnSO的浓度4。

2.8。煤解聚活动

煤炭纯化酶的解聚活动被记录评估UV / VIS光谱的间隔30分钟的解决方案组成的“200μL(胡敏酸1毫克/毫升蒸馏水,400μL H2O2刚做好的100(蒸馏水)μ米、400μ50 mM的L乳酸钠缓冲pH值4.5维持在30°C和10μL 2国际单位/毫升的酶”是补充道。吸光度随时间增加为360 nm, 450海里的吸光度随时间减少。胡敏酸的解聚反应动力学是研究通过监测的吸光度增加在360 nm和吸光度减少450海里的间隔2分钟以上反应的解决方案。图表绘制吸光度在360 nm和450 nm和时间。胡敏酸解聚作用研究在三个buffers-succinic酸/琥珀酸钠、乳酸、乳酸钠和丙二酸/丙二酸酯钠。

2.9。Haloperoxidase活动

的haloperoxidase活动存在的纯化锰过氧化物酶H2O2在低pH值被记录评估反应的UV / VIS光谱组成的解决方案1毫升“溴化钾或KI 20毫米,0.1毫米H2O2在20毫米琥珀酸琥珀酸钠缓冲pH值3.0维持在30°C。“5μL或1μL的酶解(2国际单位/毫升),分别添加在溴化钾或亲吻的情况下的解决方案。三溴化的特征光谱(Br3−)和(我3−)观察复合物22]。MnP的pH值依赖催化氧化溴和碘化之后通过测量吸光度的增加在266 nm和353 nm,分别在上面的反应的解决方案组成缓冲的pH值在2.0到4.5范围不同pH值单位。稳态的氧化反应使用摩尔消光系数的计算 3 。 6 × 1 0 4 米−1厘米−1在三溴化复杂和266海里 2 。 5 × 1 0 4 米−1厘米−1在353纳米三碘化复杂(23]。

3所示。结果与讨论

锰过氧化物酶的最大活动在液体培养的生长介质f . durissimusmtcc - 1173出现在孵化后的第五天真菌孢子和活动的峰值0.95国际单位/毫升。酶的纯化过程中总结表1。它涉及文化滤液浓度超滤和柱层析法对阴离子交换剂diethylaminoethyl DEAE纤维素。50 mM的必然产物DEAE纤维素酶琥珀酸琥珀酸钠缓冲pH值4.5 20°C和氯化钠的由线性梯度筛选了150毫米到230毫米在上面的缓冲区。酶的活性筛选了35毫升30倍集中,通过sds - page分析纯度。sds - page分析的结果在图所示1。巷1包含蛋白质分子量标记和巷2包含了纯化酶。单个蛋白质的存在带巷2中清楚表明,纯化酶是纯粹的。酶的相对分子质量计算的sds - page分析42.0 kDa。尽管锰过氧化物酶纯化的真菌资源,即p . chrysosporium(19),Phanerochaete sordida(24),Nematoloma frowardii(25),Ceriporiopsis subvermispora(26),黑曲霉(27),革盖菌属多色的(28]、曲霉菌terreusld 1 (29日),平菇(30.),而地区香菇(4),在大多数的情况下净化过程并非如此简单的酶的纯化培养滤液的f . durissimusmtcc - 1173。

表1
净化图表锰过氧化物酶的真菌菌株的培养滤液传染媒介durissimusmtcc - 1173。

图1
利用sds - page分析纯化后的酶。巷1:分子量。标记。巷2:纯化锰过氧化物酶(25μg)。

使用MnSO Michaelis-Menten情节和双倒数的阴谋4和H2O2作为基质的变量数据所示2(一个)和2 (b)。计算 值锰(II)和H2O2是59μM和32μM,分别。锰过氧化物酶的p . chrysosporium已经被广泛地研究[21]。的报道 值H4的锰过氧化物酶同工酶p . chrysosporium使用锰(II)和H2O2随着基质41μM和39μM,分别。因此, 使用锰(II)和H值2O2锰过氧化物酶的底物f . durissimus在同一个范围内报道(21锰过氧化物酶的p . chrysosporium。计算 c 一个 t 值锰(II)和H2O2是22.4秒−1和14.0年代−1分别给 c 一个 t / 值0.38μ米−1年代−1和0.44μ米−1年代−1,分别。报道[21)的值 c 一个 t 锰(II)的乳酸acid-sodium乳酸缓冲pH值4.5 30°C的锰过氧化物酶p . chrysosporium是211年代−1给出的值 c 一个 t / 等于5.1μ米−1年代−1。因此,纯化酶的催化效率低于锰过氧化物酶同工酶的催化效率H4纯化p . chrysosporium。

(一)
(一)
(b)
(b)
图2
Michaelis-Menten并使用(a) MnSO双倒数的阴谋4和H2O2分别作为变量基质。反应一个包含“5毫升μ4 g的酶(具体活动IU / mg)在50 mM乳酸acid-sodium乳酸缓冲pH值4.5 30°C”。(一)H2O2固定在100年μM和(b) MnSO4固定在100年μ使用MnSO纯化锰过氧化物酶4固定的变量衬底50μM H浓度2O2。细节的部分2。

纯化锰过氧化物酶的活动的变化与反应溶液的pH值如图3(一个)。计算最佳pH值为4.0,低于最佳pH值报告(21锰过氧化物酶的p . chrysosporium。温度变化的影响在纯化锰过氧化物酶的活动图所示3 (b)它表明酶的最适温度是26°C的温度最优值附近28°C的锰过氧化物酶p . chrysosporium(21]。

(一)
(一)
(b)
(b)
图3
纯化酶的活性的变化与pH值(a)和(b)温度。反应溶液1毫升含有“5μg的酶(具体活动4 IU /毫克),100年μM H2O2,100年μM MnSO4在50 mM乳酸乳酸钠缓冲。“在(a) pH缓冲不一的固定温度30°C。在(b)在固定的温度反应的解决方案是不同的pH值为4.5。
3.1。Mn (III)螯合剂的影响

纯化的Michaelis-Menten阴谋使用MnSO锰过氧化物酶4作为固定的变量衬底H2O2在缓冲区不同螯合剂浓度丙二酸盐,草酸乳酸、琥珀酸在图所示4。很明显从图的最大速度稳态Mn (III)的形成依赖于螯合试剂。我们使用MnP从稳态动力学结果f . durissimus在缓冲区的存在不同的螯合剂与稳态动力学结果Kuan et al。21使用MnP的p . chrysosporium。计算 , c 一个 t , c 一个 t / 值不同的螯合锰过氧化物酶的试剂f . durissimus给出了在表2。文献[21锰过氧化物酶)值p . chrysosporium也包括在表比较。从表中很明显的催化速率常数Mn (III)的形成依赖于确认使用的螯合剂螯合剂的作用分子锰过氧化物酶的催化。Wariishi et al。7)提出,免费hexaaqua锰(II)是MnP的衬底和螯合剂的作用分子的去除和稳定Mn (III)后形成的酶。然而,Kuan et al。21]使用停止流的研究已经明确,减少MnP休息酶化合物II是依赖于各种锰(II)配合物与螯合剂表明螯合锰(II)氧化锰(III)的酶。使用MnP从都得出了上面的结论p . chrysosporium(7,21]。我们使用锰过氧化物酶从稳态动力学研究f . durissimus也支持的结论Kuan et al。21]。

表2
, c 一个 t , c 一个 t / 值纯化锰过氧化物酶的存在不同的螯合剂。

图4
稳态的Mn率(3)形成的20毫米琥珀酸缓冲(X), 0.5毫米草酸在10毫米琥珀酸缓冲(⚫乳酸),20毫米缓冲区(♦)和40毫米的pH值4.5丙二酸盐缓冲(▲)30°C。反应溶液1毫升含有5μ克酶(4 IU /毫克),100年μM H2O2,MnSO4是多种多样的。
3.2。胡敏酸降解

录音解决方案的UV / VIS光谱含有腐殖酸,H2O2乳酸,乳酸acid-sodium纯化酶缓冲pH值4.5 30°C的间隔30分钟表示增加了吸光度在360 nm,如图5(一个)的吸光度并减少450海里,如图5 (b)类似于水介质解聚煤的结果由木质素过氧化物酶和H2O2据Wondrack et al。31日]。吸光度下降在450被归因于棕色的颜色消失的煤炭,和吸光度的增加在360年被归因于黄颜色的形成富啡酸化合物在煤解聚作用[31日]。我们的结果与腐殖酸的纯化MnP和H2O2表示腐殖酸的解聚。腐殖酸解聚作用的时间进程,研究了通过测量吸光度增加在360 nm缓冲区的琥珀acid-sodium琥珀酸,乳酸acid-sodium乳酸和丙二酸acid-sodium丙二酸酯。它已经被显示在图4的Vmax酶催化反应是依赖于离子螯合锰(III)出现在缓冲区。订单已Vmax(丙二酸酯)> Vmax(乳酸)> Vmax(琥珀酸)。吸光度的增加在360 nm,如图5(一个)随着时间的顺序相同的Vmax对酶催化反应在不同的缓冲区。吸光度下降在450 nm,如图5 (b)也遵循了同样的顺序。

(一)
(一)
(b)
(b)
图5
胡敏酸解聚纯化酶的活动。吸光度(a)增加360海里;(b)吸光度下降在460海里。反应溶液200毫升含有“μ克胡敏酸,5μ克酶(4 IU /毫克),40岁μM H2O2,100年μM MnSO420毫米的缓冲区pH值4.5。“琥珀酸钠缓冲液(⚫)、乳酸钠缓冲(♦)和丙二酸酯钠缓冲(▲)。
3.3。Haloperoxidase活动

纯化的haloperoxidase活动锰过氧化物酶测试通过记录反应的UV / VIS光谱包含“2.5解决方案1毫升μ纯化MnP的g, 20毫米KBr, 100μM H2O2在20毫米琥珀acid-sodium琥珀酸缓冲pH值3.0 30°C。三溴化”特征光谱的谱像复杂的Br3−与λ马克思在266 nm报道(23]。图6 (b)显示了相同的解决方案的频谱成分如前所述,除了KI仅被用于KBr和0.5μg的酶已被添加。这个频谱也像三碘化的特征光谱λ马克思在285 nm和353 nm报道(23]。因此,纯化MnP解放Br2和我2在H的存在2O2在pH值3.0。pH值依赖Br的氧化速度−对溴2和我−都给我2也一直在做,结果如图6(c)表示pH值3.0和2.5的最适条件,分别对Br的氧化−和我−。自由品牌2这不是环保用于许多溴化反应在有机化学。酶与H2O2和KBr是可能的环保试剂溴化反应在有机合成。

(一)
(一)
(b)
(b)
图6
光谱的纯化MnP催化氧化溴和碘化以形成三碘化三溴化(a)和(b)的复合物。Br对pH值的依赖关系−和我−氧化的纯化酶显示为插入(c),反应溶液1毫升含有“2.5μ克酶和20毫米KBr 0.5 (a)μ克的酶和20毫米KI在20 (b)μ3.0 M琥珀酸钠缓冲pH值30°C包含100μM H2O2”。(c)相同的溶液成分已被用作(a)和(b),但小灵通各有不同。

总之这个沟通报告锰过氧化物酶的纯化和表征文化滤液新的真菌菌株f . durissimus使用一个简单的过程。纯化酶的MnP有相似的属性p . chrysosporium,一个广泛的研究了MnP的。这种酶depolymerises腐殖酸和显示了氧化Br haloperoxidase活动−和我−在低pH值。

确认

作者感谢UGC,新德里的金融支持通过它主要研究项目。f . 31-94/2005 (SR) 3月30日,2006年,这项工作已经完成。m·亚达夫是感谢UGC新德里d s Kothari博士奖学金的奖励。s·k·辛格感谢化学系,DDU戈勒克布尔大学UGC-DSA奖学金的奖励有价值的学生。