文摘

目前的工作包括四个金属硫蛋白的重组合成(MTs) metal-unsupplemented文化和回收金属配合物的表征分析和光谱技术。四个MTs是两个果蝇(MtnA和MtnB),一个酵母(Crs5),和一个鼠标(mMT1)金属硫蛋白亚型。这四个MTs展览不同的金属绑定偏好,从明确Cu-thionein字符定Zn-thionein性质,分别。虽然在所有情况下,唯一的金属离子存在于纯化复合物本质上,我们的研究结果强调了这两种类型的MTs的不同行为,在条件会模仿他们在生理环境中合成。因此,本质上不同的角色可以猜测的结构性产物MT肽没有任何金属过载,取决于他们的锌-或Cu-thionein字符。

1。介绍

金属硫蛋白(MTs)的总科小蛋白质,无处不在,可能是多源的,协调重金属离子通过metal-thiolate债券建立了他们的高度丰富的半胱氨酸残基1]。目前,由于他们在1957年首次报道2),MTs生物结构和他们的贡献的各种生理过程最多样化的生物仍然是一个有争议的问题(3]。除了排毒性能,MTs似乎参与锌和铜内稳态,而另外他们似乎参与无数的过程特定于每个不同组的生物。

Apo-MTs(也称为thioneins)是随机线圈多肽,只有折叠金属协调到一个明确的三维结构。这意味着MTs采用不同的三维结构——主要的蛋白质functionality-depending行列式的性质和数量的金属离子协调在给定的金属络合物。这尤其值得注意,因为尽管表达的水平太基因仍然没有金属感应普遍偏低,可能存在一些生物或组织积累demetalated(没有金属离子)在一定条件下thionein肽。事实上,几年前,这是声称的水平thionein在哺乳动物组织在生理条件下可以明显足够高的港口重要意义太功能在锌和氧化还原代谢4,5]。然而,本地MT合成是极低的,除非相应的基因被诱导的存在一个特定的金属离子或其他压力条件。反过来,这实际上排除了本地apo-forms的净化,在生理条件下产生的。这严重的缺点可以避免通过重组合成。值得注意的是,尽管这一策略已经被许多作者获得广泛使用metal-MT复合物最多样化的生物,它很少被用来研究MT合成在生理环境中没有金属的盈余。几年前我们建立一个大肠杆菌表达系统,使锌的生物合成^{2 +}——、Cd^{2 +}和铜⁺太复合物,相当于本地合成,足够的数量和纯度,允许分析、光谱、光谱特性,通过增加相应的重组细菌金属补充媒体(6,7]。在这项工作中,我们采用了相同的合成原理来研究不同的MTs的金属结合能力(即当生产的细菌生长在标准。,非金属补充媒体),特别是为了确定的特性zinc-complexes biosynthesized在这些条件。

执行这项研究我们选择四个金属硫蛋白,属于广泛的生物:两个果蝇(MtnA和MtnB),酵母(Crs5),和鼠标(mMT1)同种型(表1),因为他们表现出不同的金属绑定偏好时考虑按照我们的分类Zn-thionein与Cu-thionein [8]。我们最近修订后的第一个分类方案,基于两个离散MT组,我们现在提出一个逐步分级极端Zn-thioneins和Cu-thioneins之间拥有连续的中间形式的金属绑定属性(9]。我们包括本文的结果清楚表明,首先,所有MTs能够一定程度上捕捉和协调锌^{2 +}离子存在于标准(nonsupplemented)细菌生长介质(磅)。其次,值得注意的是我们的结果表明,锌含量和平均的精确Zn-MT给定太肽复合物恢复取决于其顺次排列分类情况,换句话说,锌-与Cu-thionein字符。因此,一方面这部作品揭示了太多肽的行为当没有金属盈余在周围环境;另一方面,它增加了一个新的标准来支持我们的MTs的分类根据其金属处理的能力。

2。实验

2.1。重组Metal-MT复合物的合成

MTs的重组合成(主要是GST-MT融合)通过相应的cdna克隆表达在pGEX向量。建设这些质粒是详细报道7]鼠标MT1同种型,10为酵母)酿酒酵母Crs5太,11,12)的d .腹Mtn(或MtnA)和Mto(或MtnB)亚型。所有的metal-MT复合物分析了从1 l文化BL21纯化工作大肠杆菌细胞与相应pGEX-MT转化质粒,生长在标准磅(Luria-Bertani)汤100毫克毫升⁻¹氨苄青霉素和金属补充,除了控制条件,当300年M ZnCl₂被添加到LB培养基。GST-MT合成与isopropyl-1-thio -诱导-D-galactopyranoside (IPTG)最后一个100毫米的浓度。2.5小时感应后,细胞被离心收获。metal-MT复合物的防止氧化,氩充溢在净化后的细胞破坏的所有步骤。蛋白质纯化、细胞resuspended在冰冷的PBS (1.4 M氯化钠,氯化钾27毫米,101毫米Na₂HPO₄,KH和18毫米₂阿宝₄v / v) 0.5%巯基乙醇、受声波降解法和离心机在12000 g 30分钟。GST-MT融合是纯化从恢复上层清液gluthatione-Sepharose 4 b(通用电气医疗集团)批亲和色谱法孵化温柔的混合物在室温下搅拌为60分钟。在PBS三洗后,由于GST-MT构造包括凝血酶识别网站,这种蛋白酶添加(10 u /毫克的蛋白质)和消化是一夜之间在第23 - 25°C。这使得分离消费税部分仍绑定到凝胶矩阵从太一半(筛选了与凝血酶)。随后,这洗出液集中使用Centriprep集中器(Amicon)(美国Billerica的微孔,MA)的截止3 kDa和分次使用FPLC,通过superdex - 75列(通用电气医疗集团)平衡与50 mM Tris-HCl, pH值7.0,1毫升分钟运行⁻¹。分数是收集和分析蛋白质含量的吸光度在254海里。整除的protein-containing FPLC分数进行分析15% sds - page和彩色Coomassie蓝色。MT-containing样本存储在连接池°C,直到进一步的表征。

2.2。电感耦合等离子体原子发射光谱(icp - aes)

元素组成的重组表达太复合物进行了分析(S、锌、Cd和、铜),电感耦合等离子体原子发射光谱(icp - aes) Polyscan 61 e光谱仪(热贾雷尔灰公司,富兰克林,妈,美国)在适当波长(年代,182.040海里;锌、213.856 nm;Cd, 228.802海里;铜、324.803 nm)。样本准备在“传统”(HNO稀释为2%₃(v / v))13)或“酸性”(在1 M盐酸孵化65°C 5分钟)条件(14]。MTs浓度重组准备计算假设的唯一贡献他们的内容是由太肽。

2.3。质谱分析

分子质量测定是由电喷雾电离质谱配有time-of-fly分析仪(ESI-TOF MS)使用微Tof-Q仪器(布鲁克Daltonics Gmbh是一家现代化、不来梅、德国)校准与奈(200 ppm奈1:1 H₂O:异丙醇混合物),界面上的1100系列高效液相色谱泵(安捷伦科技)配备一个autosampler,罗盘控制的软件。分析MT样本的实验条件:20L的样本注入PEEK长管(1.5米0.18毫米身份证)40岁在下列条件下L / min: capillary-counterelectrode电压,5.0 kV;反溶剂温度、90 - 110°C;干气、6 L / min。光谱收集在一个m / z范围从800年到2000年。液体载体是90:10的15毫米醋酸铵、乙腈,pH值7.0。所有的样品都注入至少一式两份,以确保再现性。在所有情况下,根据报道分子质量计算方法(15]。

3所示。结果与讨论

(表四MTs研究工作1)覆盖广泛的生物:从vertebrates-the鼠标mMT1缩氨酸invertebrates-two果蝇(MtnA和MtnB)多肽、单细胞真核生物酵母Crs5 MT。此外,他们表现出微分对锌金属结合的能力^{2 +}和铜⁺,他们的立场在我们的锌-与Cu-thionein顺次排列分类(9]。本研究的总体结果综合表(表中给出2)为了方便比较,但他们独立讨论如下。MTs之一,Mtn-B也是多余的锌条件下合成(300米在培养基),作为一个积极的控制与nonsupplemented实验。是非常重要的强调在所有情况下,Cd和铜含量的准备工作也是衡量,但是获得的值总是不显著。这是符合金属离子含量的细胞内环境大肠杆菌细胞,据估计约为0.1毫米的锌只有10 - 100米范围内对铜(16),因此锌^{2 +}离子确实是唯一可用的新兴太肽。

,mMT1对碘氧基苯甲醚的四个鼠标(哺乳动物)基因组中编码,有很长一段时间的范例二价金属绑定MTs。因此,它是在第三位置的16个Zn-thioneins顺次排列分类,如表所示3。这意味着相应的多肽具有较高与二价金属离子形成配合物的能力(锌^{2 +}和Cd^{2 +}),这样这些复合物折叠,在生理条件下保持稳定。引人注目的是,重组合成mMT1呈现独特的锌₇-mMT1复合物(图1(一)、表2),无论细菌培养补充了锌(300米)(7]。这表明一个极端熟练mMT1不仅形成结构良好Zn-complexes当这些金属离子在盈余,而且捕捉锌^{2 +}离子存在于一个标准的环境中,这可能是重要的重要性在考虑其潜在功能在生理条件下。

Crs5是一个酿酒酵母太,nonhomologous排比Cu-thionein Cup1出现在相同的酵母种类。尽管最初被认为是一个二次铜阻剂,我们表明,它决定了生存在锌过载,此外,有关它的所有数据能力聚合定义部分Zn-thionein特性与Crs5 [10]。事实上,它坐落在一个中间位置的锌和Cu-thionein排名(位置的16 MTs,表3)。当这个MT合成缺乏锌过载的情况下,不仅意味着Zn-per-MT比率从5.7减少到4.2(表2),但也有一个巨大的各种各样的Zn-Crs5物种产生,所显示的样品的质谱(图1 (b))。除了主要的锌₄-Crs5物种,包括制备其他复合物,表现出广泛的化学计量学,从最高价值观察补锌(锌₇crs)的主要物种恢复(10](锌₆和锌₅-Crs5),以及其他undermetalated(不含金属)复合物,锌₃-锌₁-Crs5。因此清楚这太能够协调一些锌离子从正常的生理环境,但在这种情况下,超过一半的多肽包括锌负荷低于他们将多余的锌条件下。

最后,两个果蝇MTs, MtnA MtnB,研究Cu-thioneins的行为,因为他们都被定性为动物MTs最类似于典型Cup1 Cu-thionein [9]。因此两个多肽能够呈现核铜(I)配合物在重组合成铜媒体(11,12]。尽管这些属性,Cu-thioneins能够折叠成锌^{2 +}包含复合物时产生的多余的锌的观察控制实验(图1 (e)、表2)和文献数据(11,12]。然而,目前的结果提供的证据表明,这不是在nonsupplemented媒体,自MtnA和MtnB都恢复主要是apo-forms或锌₁mtn复合物(表2)。女士这些准备工作(数据的光谱1 (c)和1 (d))显示,太多肽严重undermetalated(不含金属),与配合物表现出的丰富的金属含量远低于他们可以达到满载物种(表3)。因此,它必须是假定这些MTs应该出现在一个正常的环境(即。,没有金属离子盈余),他们会协调很少锌^{2 +}离子,如果任何。

联合观察这些结果导致重要的考虑。首先,很明显,锌(II)浓度的水平通常出现在细胞细胞质(估计在0.1毫米大肠杆菌(16)使Zn-MT复合物的建筑,即使没有锌过载。这是极其重要的预测原生太的命运肽翻译在uninduced条件下,它会在完全赞同的假设基础条件,MTs展示一个清晰的Zn-thionein字符作为锌合成细胞内^{2 +}复合物,接受相应的交换反应过多的其他金属离子的存在17]。然而,Zn-MT物种产生的合成nonsupplemented媒体,和他们的关系与那些来自传统zinc-supplemented文化,高度依赖的类型太认为,精确,Zn-thionein字符。因此,鼠标MT1同种型,一个真正的Zn-thionein,收益率在培养条件完全相同的结果,显示了极端捕获锌的能力^{2 +}离子的生理环境。另一方面,真正的Cu-thioneins分析几乎是无法产生锌^{2 +}包含复合物,除非它们合成下多余的锌,甚至呈现apo-forms或锌₁太作为主要产品(参看结果MtnA MtnB,人物1、表2)。比较正常的合成和推广媒体(表3),就意味着锌:MT含量比和锌^{2 +}包含物种恢复,强调Zn-thionein性格太肽的越高,越相似的结果将Zn-MT复合物的合成条件。相反,Cu-thionein字符越大,物种越不同会造成这些合成,以至于Cu-thioneins具有固有的能力来协调锌^{2 +}离子存在时的生理浓度。这意味着Cu-thioneins,如果合成的结果(即组成型表达的基因。下,没有金属盈余),仍将主要是apo-peptides细胞内,但从未基底锌^{2 +}包含复合物。

4所示。结论

综合考虑我们的数据表明,合成的结果不同的MTs nonmetal-supplemented媒体高度依赖锌-与Cu-thionein性格。虽然在所有情况下锌^{2 +}前几乎包含复合物产生收益率相同的Zn-MT物种zinc-supplemented和正常生产的重组(nonsupplemented)中,而后者几乎是无法协调锌^{2 +}除非这些金属离子在明确盈余(300米在文化媒体)。这些结果可能反映了这两种MTs的本质上不同的角色在生理条件下,以及他们well-assumed时不同的角色本身作为保护性反应合成相应的cognate-metal过载。

确认

这项工作是支持的西班牙Ministerio de Ciencia y Tecnologia授予美国bio2009 - 12513 - co2 - 01 Atrian和bio2009 - 12513 m . Capdevila co2 - 02。这项工作的作者是公认的“族de Recerca”“Generalitat de加泰罗尼亚”,参考2009 sgr - 1457。作者感谢Serveis Cientifico-Tecnics de la巴塞罗那大学的和Servei d 'Analisi Quimica (SAQ) de la de巴塞罗那自治大学分别分配icp - aes质仪、时间。他们也感谢米利暗Romagosa MT合成和Ayelen帕加尼技术指导。