文摘

骨移植替代物和多孔的生物材料已经广泛用于治疗临界大小的长骨缺陷由于创伤、肿瘤切除,组织变性。特别是,多孔羟基磷灰石是广泛应用于骨重建手术由于其生物相容性。此外,体外修饰的多孔的羟磷灰石与提高组织再生体内成骨的信号,表明在组织工程生物材料改性可以发挥重要的作用。在这项研究中,我们是否遵循了组织工程的战略超声刺激SAOS-2人类成骨细胞扩散和建造他们的细胞外基质内多孔羟基磷灰石支架。超声波刺激有以下参数:平均功率等于149 mW和频率为1.5 MHz。与控制条件相比,超声刺激增加了细胞增殖与骨蛋白质和表面涂层(decorin,骨钙蛋白、骨桥蛋白、i型胶原和iii型胶原蛋白)。机械刺激旨在获得一个更好的修改生物材料内表面的细胞殖民和骨基质涂层。修改后的生物材料可以使用,在临床应用中,作为骨修复植入。

1。介绍

在骨重建手术的一个关键挑战是提供生活结构,具备集成在周围组织的能力。骨移植替代物,如自体、同种异体,异种移植,和多孔生物材料已经广泛用于治疗临界大小的长骨缺陷由于创伤、肿瘤切除,组织变性。生物材料用于构建3 d骨组织工程支架,例如,羟磷灰石(1),部分软化骨骼(2),生物可降解多孔polymer-ceramic矩阵(3,生物活性玻璃(4,5]。

前面的论述,综合分析生物材料是理想的为了遵循典型的组织工程的方法,这种方法包括播种和体外培养的细胞在多孔的支架植入前。

组织工程的方法具有十分重要的意义。为了克服缺点与标准的体外培养系统,如有限的扩散和非齐次cell-matrix分布,一些生物反应器设计提供不同的物理刺激:旋转血管生物反应器(6),灌注生物反应器(7),或一个电磁生物反应器(8例如,]。理想特性的生物反应器是合适的供应水平的氧气、营养物质,细胞因子,生长因子,和适当的物理刺激,为了填充,活骨细胞和矿化细胞外基质,多孔生物材料的体积骨重建手术:这种生活和生物相容性的组织工程的建设可以植入一起插入血管蒂(9]。

格纳和Gogolewski10,11)注意到理想的骨移植替代的特性:它应该是多孔连通孔隙的足够的大小(至少200 米)允许长在肉内的毛细血管和血管周的组织;它应该吸引周围的间充质干细胞骨,促进其分化成成骨细胞;应该避免剪切力之间的界面骨和骨移植替代;应该是可生物降解的。

在这项研究中,在前面的“黄金规则”格纳和Gogolewski,我们选出了多孔羟基磷灰石(12- - - - - -14)和松质骨移植替代,使用超声波刺激[15),我们试图填充细胞外基质和成骨细胞,细胞功能的超声调制(15]。

羟磷灰石广泛用于骨重建手术由于其生物相容性。多孔羟基磷灰石体外修改,成骨的转化生长因子的信号 总科和骨形成蛋白,提高体内组织再生(16),这表明羟磷灰石的修改可以在组织工程起着重要的作用。

结果,目标,在未来的工作中,在加速和增强骨再生的体内,在目前组织工程的研究中,我们展示了一个特定的“仿生战略”,由体外修饰的多孔羟基磷灰石与扩散原位产生的成骨细胞和细胞外基质。换句话说,应用一个超声波15),我们的目的是提高骨松质羟磷灰石内细胞培养,即羟基磷灰石内表面涂生理和生物相容性cell-matrix层。使用这种方法,体外培养材料理论上可以使用,在临床应用中,作为osteointegrable植入。

2。材料和方法

2.1。羟磷灰石磁盘

多孔Orthoss牛羟磷灰石磁盘(直径8毫米;高度,4毫米)请提供Geistlich制药公司(瑞士Wolhusen) [12- - - - - -14]。生物材料有以下特点:内表面面积97 m2/ g,平均孔隙度60%,晶体尺寸10÷60 nm, Ca / P比值等于2.03,正常的人类松质骨(图1)。


图1
扫描电镜的图像不结果实的羟磷灰石、酒吧等于100 m。
2.2。细胞

人类骨肉瘤细胞系SAOS-2得到来自美国类型文化集合(位于马里兰州Rockville,写明ATCC HTB85)。细胞培养在本人的5修改中l谷氨酰胺和玫瑰(巴尔的摩Cambrex生物科学公司,巴尔的摩,马里兰州),补充15%胎牛血清,2%丙酮酸钠,1%的抗生素, M地塞米松,10毫米 甘油磷酸酯(Sigma-Aldrich Inc .)、密尔沃基、WI)。抗坏血酸,另一个成骨的补充,是本人的一个组成部分,它是5修改后的介质。这些细胞被培养 有5%的人 经常使胰蛋白酶化后confluency、统计和播种到羟磷灰石磁盘。

2.3。细胞播种

为了锚羟磷灰石磁盘两个标准孔板,3% (w / v)琼脂糖溶液制备高压蒸汽消毒,在冷却, 100年 L的琼脂糖溶液倒在井的放置羟磷灰石磁盘和冷却完成后修复它们。

生物材料的孔板磁盘是由环氧乙烷消毒 8个小时在65%相对湿度。24小时后的曝气,以去除残留的环氧乙烷,两个文化系统内的磁盘都准备好了:“静态”,即控制板没有外部刺激和“超声波”,也就是说,超声刺激了板。

的细胞悬液 细胞在400年 L添加到每个磁盘的顶端,0.5小时后,600年 L培养基的添加到磁盘。细胞被允许附加在一夜之间,那么静态文化继续在标准板和超声波刺激首次应用。

2.4。超声波刺激

超声波刺激(15)是通过培养基快速应用超声波发生器(Igea、腕、意大利)播种羟磷灰石磁盘。机械波有以下特点:信号频率等于 兆赫,责任周期 年代,重复率等于1±0.02 kHz,和时间平均功率为149±3兆瓦。低强度超声刺激加速骨折愈合的临床研究[17]。

超声波文化放在一个标准的细胞培养孵化环境 和5% 这是刺激20分钟/天总共22天。培养基的改变是天4、7、10、13、16、19。

2.5。标准板文化

静态文化放入一个标准的细胞培养孵化器。静态文化是22天的持续时间和培养基的改变是天4、7、10、13、16、19。

2.6。扫描电子显微镜(SEM)分析

文化的最后时期,磁盘固定为2.5% (v / v)戊二醛溶液在0.1 Na-cacodylate缓冲区(pH = 7.2) 1小时 用Na-cacodylate缓冲区,然后在一个梯度乙醇脱水在室温下系列多达100%。样本保存在100%乙醇为15分钟,然后point-dried至关重要 标本被安装在铝存根,溅射镀黄金(纯洁度等于99%),然后用剑桥立体扫描徕卡显微镜观察(Bensheim徕卡微系统公司、德国)。

2.7。DNA内容

文化的最后时期,细胞被冻融法在无菌细胞溶解去离子的蒸馏水和释放DNA内容评估荧光法(PicoGreen、分子探针,尤金或)。一个DNA标准曲线(15),从一个已知数量的成骨细胞,是用来表达结果细胞数量/磁盘。

2.8。组兔多克隆抗血清

费舍尔et al。(http://csdb.nidcr.nih.gov/csdb/antisera.htm国立卫生研究院,国立牙科和颅面研究,颅面和骨骼疾病的分支,矩阵生化单元,贝塞斯达,MD)给我们,慷慨,用下面的兔多克隆抗体免疫球蛋白G: antiosteocalcin, anti-type-I胶原,anti-type-III胶原,antidecorin, antiosteopontin(抗血清LF-32, lf - 67、lf - 71、低频- 136和lf - 166) [18]。

2.9。的纯化蛋白质

Decorin [19)、骨钙素(immunoenzymatic试验装备,bt - 480生物医学技术,Inc .斯托顿,MA),骨桥蛋白(immunoenzymatic试验装备,900 - 27,试验设计,Inc .,安阿伯市MI)、i型胶原蛋白(20.],iii型胶原蛋白(Sigma-Aldrich)。

2.10。共焦显微镜

文化的最后时期,磁盘固定为4% (w / v)多聚甲醛溶液在0.1磷酸盐缓冲剂(pH = 7.4) 8个小时在室温和用PBS(137毫米氯化钠,氯化钾2.7毫米,4.3毫米 1.4毫米 三次pH = 7.4) 15分钟。磁盘然后被孵化与帕特(PBS含有1% (w / v)牛血清白蛋白和0.02% (v / v)渐变20)在室温下2小时,洗。

l·费雪的antidecorin antiosteocalcin、antiosteopontin anti-type-I胶原蛋白,和anti-type-III胶原蛋白兔多克隆抗血清被用作主要的抗体稀释等于1:1000年的帕特。孵化与主抗体在一夜之间完成 而消极的控制是基于孵化,一夜之间 与帕特的主要抗体。磁盘和消极控制洗和孵化Alexa萤石488山羊antirabbit免疫球蛋白(H + L)(分子探针)的稀释1:500年帕特在室温下1小时。

最后孵化,磁盘在PBS洗,复染色与赫斯特(2的解决方案 g / mL)目标细胞的细胞核,然后洗净。图像是由蓝色激发用共焦显微镜(TCS SPII徕卡微系统)配备一个数字图像捕捉系统在100年 放大。

2.11。细胞外基质蛋白的提取培养磁盘和酶联免疫吸附试验(ELISA)

文化的最后时期,为了评估大量的细胞外基质成分在内部和外部的羟磷灰石表面,磁盘洗广泛与无菌PBS(137毫米氯化钠,氯化钾2.7毫米,4.3毫米 1.4毫米 pH = 7.4)为了除去培养基,然后孵化24小时 1毫升无菌样品缓冲(1.5 M Tris-HCl, 60% (w / v)蔗糖,0.8% (w / v)钠十二烷基硫酸盐,pH = 8.0)。潜伏期结束时,样品缓冲整除被移除,然后磁盘离心机在4000 rpm 15分钟为了收集样品缓冲裹入毛孔。两个文化系统中的总蛋白浓度由BCA蛋白质鉴定评估工具包(皮尔斯生物技术公司,罗克福德,IL)。总蛋白浓度是749±108 克/毫升和1527±274在静态文化 g / mL的超声波文化( )。矩阵提取后,磁盘被孵化,再一次,24小时 1毫升无菌示例缓冲区,和没有检测出蛋白质含量。

校准曲线测量decorin,骨钙蛋白、骨桥蛋白、i型胶原蛋白,和iii型胶原蛋白进行。微量滴定井被涂上一层增加每个纯化蛋白的浓度,从1 ng 2 g,在涂料缓冲区(50毫米 一夜之间pH = 9.5) 一些井涂以牛血清白蛋白(BSA)作为消极的控制。为了测量细胞外基质的每个蛋白ELISA,微量滴定的井被涂布,一夜之间 与100年 提取的细胞外基质(20 L 在涂层缓冲g / mL)。后三个洗PBST (PBS含有0.1% (v / v)渐变20),井与200年被孵化 L (PBS含有2% (w / v) BSA 2小时 1.5小时的井随后被孵化 与100年 l·费舍尔的antidecorin、antiosteocalcin antiosteopontin, anti-type-I胶原蛋白,anti-type-III胶原蛋白兔多克隆抗血清(1:500稀释1% BSA)。洗后,井孵化1小时 与100年 L (HRP-conjugated山羊anti-rabbit免疫球蛋白g(1: 1000稀释1% BSA)。

与100年井终于孵化 L的发展解决方案(phosphate-citrate缓冲区o苯二胺盐酸盐衬底)。颜色反应是与100年停止 L 0.5 H2所以4和吸光度值测定在490 nm标(Bio-Rad实验室,Inc .,大力神,CA)。磁盘内细胞外基质成分的量表示为成品/(细胞 磁盘)。

2.12。统计数据

磁盘数量是24在每个重复实验(12盘的控制文化和12磁盘超声波文化)。实验重复了4次。结果表示为平均值±标准偏差。为了两个文化系统之间的比较结果,单向方差分析(方差分析)事后Bonferroni测试应用,选0.05的显著性水平。

3所示。结果

人类SAOS-2成骨细胞被播种到多孔羟基磷灰石磁盘,然后没有或超声波刺激培养22天。这些文化方法允许SAOS-2细胞的研究,因为他们修改了生物材料与细胞外基质通过扩散和涂层。cell-matrix分布两个文化系统之间的比较。

3.1。显微镜分析

控制条件相比,扫描电镜图片显示,由于超声刺激,成骨细胞扩散和建造他们的细胞外基质内部羟磷灰石表面(数据可用2和3)。文化的最后时期,静态培养细胞很少,从本质上讲,不是周围的细胞外基质,因此广泛的生物材料区域仍缺乏cell-matrix复合物(图2)。相比之下,物理刺激引起了广泛的外套内表面的生物材料:几个成骨细胞扩散和生物材料被cell-matrix倾向于隐藏层(图3)。


图2
扫描电镜图像的静态文化,酒吧等于30 m。成骨细胞在附近的“反散射萧条”并列星号:文化的最后时期,静态培养细胞很少,从本质上讲,不是周围的细胞外基质;因此,广泛的生物材料区域仍缺乏cell-matrix复合物。

图3
超声波的SEM图像文化,酒吧等于30 m。文化时期的物理刺激引起了广泛的外套内表面的生物材料:一些成骨细胞扩散和生物材料被cell-matrix倾向于隐藏层(星号)。

的i型胶原蛋白和decorin immunolocalization细胞细胞核的对比染色显示方面的刺激效果更高的细胞增殖和细胞外基质的更强烈的建筑(数字4和5)。immunolocalization骨钙蛋白、骨桥蛋白、iii型胶原透露类似的结果(数据没有显示)。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图4
Immunolocalization i型胶原蛋白(面板a和c,绿色)和细胞细胞核(面板b和d,蓝色)在静态文化(a和b)板和超声波文化(电池板c和d),酒吧等于80 m。文化时期,控制(a和b)板,骨基质的成骨细胞建立稀疏的数量,然而,刺激文化(电池板c和d),成骨细胞分泌大量的矩阵。immunolocalization骨钙蛋白、骨桥蛋白、iii型胶原蛋白发现类似的结果。
(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图5
Immunolocalization decorin(面板a和c,绿色)和细胞细胞核(面板b和d,蓝色)在静态文化(a和b)板和超声波文化(电池板c和d),酒吧等于80 m。文化时期,控制(a和b)板,decorin的成骨细胞产生很少的数量,矩阵空间组织的主要监管机构,然而,刺激文化(电池板c和d),成骨细胞分泌更多的3 d组织骨矩阵。

这些观测证实了DNA的测量内容的文化时期:在静态文化,每个磁盘增加细胞数量 和超声波文化 与

3.2。细胞外基质提取

为了评估骨内细胞外基质的羟磷灰石磁盘,提取的矩阵进行的ELISA:文化的最后时期,与静态文化相比,超声波刺激与decorin显著提高内表面涂层,骨钙蛋白、骨桥蛋白、i型胶原蛋白,和iii型胶原蛋白 (表1)。

表1
大量的细胞外基质成分羟磷灰石。

4所示。讨论

本研究的目的是在体外的修改与细胞外基质的多孔羟基磷灰石和成骨细胞的骨修复生物材料的生物相容性。

讨论“生物相容性”的概念是必要的。当植入生物材料在生物环境中,nonphysiologic一层吸附蛋白质介导周围宿主细胞与材料表面的相互作用。身体解释这种蛋白质层作为一个外来入侵者必须隔离在一个无血管的和艰难的胶原蛋白囊。因此,必须开发生物医学表面,这样主机组织可以识别“自我”。Castner拉特纳认为“生物相容性的表面”的“生物材料,治愈”表面的字符“干净、新鲜的伤口”[21):这些“self-surfaces”可以获得生理炎症反应导致正常愈合。在这项研究中,我们遵循一个仿生战略播种成骨细胞建立了生物相容性表面制成的骨基质(15,22]。

提高生物材料内表面的涂层,一个超声波应用于种子生物材料(15]。超声波刺激细胞增殖增加约1.6倍。此外,超声波明显增强的i型胶原蛋白的合成,decorin,骨桥蛋白,骨钙素,和iii型胶原蛋白,这是基本的生理骨基质成分:特别是,i型胶原蛋白是最重要的和丰富的骨基质的结构蛋白;decorin是蛋白多糖被视为关键调节器装配和许多细胞外基质蛋白质的功能与主要角色在胶原原纤维的横向发展,推迟外侧装配表面的纤维;骨桥蛋白是一种细胞外糖化骨磷蛋白质分泌早期的骨矿化的发病之前,它结合钙,它可能参与调节羟磷灰石晶体生长,而且,通过特定的交互vitronectin受体,它促进细胞矩阵的附件;骨钙素分泌后矿化,结合骨矿物质。

前面的结果可以解释一个信号模型。超声波刺激引发了网络 通量的成骨细胞胞质和胞内释放 (23- - - - - -25]。根据Pavalko信号模型,增加了胞质 浓度是信号通路的起点,引起前列腺素的分泌增强成骨细胞增殖,并针对某些特定骨基质的基因(23]。

与Pavalko的模型一致,机械刺激成骨细胞产生自分泌和旁分泌前列腺素对细胞增殖的信号;相同的机械刺激成骨细胞产生骨细胞外基质。前列腺素释放的培养基,而蛋白质沉积到生物材料。即使前列腺素和蛋白质有部分常见的生化途径23),他们有不同的几何目的地:分别介质和材料表面。因此,前列腺素的行动效率(细胞增殖提高1.6倍)不同于矩阵沉积(生物材料涂层的效率提高1.7÷表4.5倍1)。

在这项研究中,超声波刺激是一个物理方法获得材料的仿生改性,其内部表面被一层涂层由成骨细胞和骨基质。细胞系的使用显示了超声波刺激的潜力;然而,适当的调优参数的超声波,刺激持续时间,和文化,可以获得一个更好的结果与自体骨髓基质细胞而不是总immunocompatibility SAOS-2成骨细胞与患者。此外,体内植入后培养的多孔的羟磷灰石,超声波治疗可以应用相同的波参数(15)提高病人治疗(17]。

总之,我们提出,培养“self-surface”可以用新鲜的,也就是说,富含自体的细胞和矩阵,或与环氧乙烷灭菌后,也就是说,丰富只有在自体矩阵。在未来的工作中,我们打算使用构造,富含自体矩阵,作为一个简单,存储,组织工程骨修复的产品22]。

确认

作者感谢l·w·费舍尔,k·马丁,s . Setti r . Cadossi a Mortara,遭到d . Picenoni, p . Vaghi。羟磷灰石磁盘成员去Geistlich制药(Wolhusen、瑞士)。快速超声波发生器是一个礼物Igea(腕、意大利)。这项工作是支持的基金会Cariplo Francesco Benazzo赠款(2004.1424/10.8485和2006.0581/10.8485),由普林斯顿格兰特(2006)从意大利教育部大学和研究利维亚Visai, FIRB格兰特(RBIP06FH7J)从意大利教育部大学和研究玛丽亚加布里埃尔Cusella De旧金山。