文摘
为了阐明脲酶的水解酶方面的机制,理论计算的模型进行活性部位,使用密度泛函理论。的桥接氧供体晶体结构中发现的决心是一个氢氧根离子。最初的协调尿素的活性部位发生最有可能通过尿素氧气最低的镍离子配位数。这种协调可以没有获得能源。计算还表明,弱协调脲胺的氮原子第二镍原子是积极可行的。此外,提出机制包括一个四面体中间攻击尿素水解生成的氢氧化碳桥接的建模,和四面体中间被发现大力不利相对于终端协调衬底(尿素)。
1。介绍
脲酶水解酶负责尿素的催化分解挥发性氨和二氧化碳(1]。酶释放氨和氨基甲酸酯,从而自发产生的产品。酶是研究早期(2),有几个原因产生了兴趣。有人建议扮演一个角色在bacteria-induced溃疡3,4],其活动也被发现有影响农业通过挥发urea-a常用肥料产生的酶(5]。脲酶也是第一个酶被发现对它的功能依赖于镍(6),这使得它成为了一个有趣的目标站点为化学家生物无机的模型(7]。
脲酶的蛋白质结构克雷伯氏菌aerogenes在1995年首次解决了(8),自那以后,其他几个酶的结构,有或没有绑定抑制剂已经确定(9- - - - - -12),包括结构巴氏芽孢杆菌(10- - - - - -12),幽门螺杆菌(13]。活跃的站点包含两个镍离子与原子间的距离约为3.5(图1)。离子是由carbamylated架桥赖氨酸和一个氧供体。除了桥梁、镍离子(Ni1)之一是协调两个组氨酸和一个水分子。协调Ni2类似于Ni1之一,包含两个组氨酸残基,一个水分子和晚期绑定天冬氨酸。
一些建议关于可能的反应机制。已经达成共识关于尿素的初步协调到活动网站,已建议通过尿素氧气发生攻击Ni1协调空位(图2),但对于后续步骤有不同的建议。最初提出的机制涉及到攻击尿素碳的氢氧化是Ni2晚期绑定。这导致一个中间桥梁两种金属,可以释放氨形式产品(14,15]。基于一种抑制剂的结构复杂,Benini et al。12,16]建议的机制涉及二次协调Ni2尿素氮原子,这职位氢氧化底物攻击的桥接(水)。尿素的衔接协调基质是由皮尔森et al。17),但是这些调查表明,亲核试剂不是氢氧化桥接,而是Ni2氢氧化水/协调。
几个计算研究脲酶的机制已经在过去的十年里发表。这些包括分子力学研究齐默(18,19]和Smyj [20.)和DFT梅尔兹的研究等。21,22]。后者密度泛函B3LYP层面进行研究和建模的整个直接协调球体dinickel网站与氨基酸残基截断,以便协调完整的官能团(咪唑(他的),氨基甲酸酯(carbamylated赖氨酸)和羧酸盐(Asp)表示。本研究旨在辨别两者之间拟议的机制,涉及到一个桥接衬底(16,17),但它也评估最初的迹象表明尿素是晚期协调。机制涉及到桥中间的密度泛函研究表明,氢氧化桥接是实际的亲核试剂,但发现率确定这些机制的过渡状态,涉及晚期协调尿素分子是非常相似的,不可能区分这些机制的基础上计算。在最近的分子动力学和量子力学模拟,Estiu和梅尔兹(23,24]发现最初的尿素的协调模式,包括终端协调Ni1或桥接配合协调脲羰基一半Ni1和同时氢键相互作用的氢氧化胺氮与桥接,根据氨基酸残基周围的质子化作用状态。
在本文中,我们希望现在DFT-based进行计算,以研究脲酶机制。活性部位的结构初始尿素后协调建模。桥接氧供体的理论涉及的攻击测试。从文学激活数据,列表的能量激活大约50焦每摩尔(25,26与能量之间的差异开始比较结构和确定中间体。
2。结果与讨论
由于计算DFT方法的费用,做了一项调查,发现最小的可靠的模型,以此为基础研究的其余部分。三个模型系统。最小的系统只包含原子从金属离子在三到四个键。第二个包含所有原子的协调,包括氨基酸残基碳原子。第三个模型系统还包括一些nonbonded残留在附近。从结构、本机脲酶的晶体结构巴氏芽孢杆菌(PDB代码2 ubp)使用(11]。在模型中调查,从提取的蛋白质结构,然后几何最小化。一个可能的中间结构与尿素债券Ni1也进行了研究。结果表明,所有的结构给了非常相似的结果,不同的几何和两个研究模型之间的能量。这一结果表明,最小的模型是适用于研究。在选择模型中,只包含metal-bound配体。组氨酸残基被建模为咪唑类、天冬氨酸残基被限制为一个甲基的碳而carbamylated赖氨酸是同样的终止碳(图1)。剩下的配体是不变。
2.1。决定休息的结构
自从x射线晶体学所提供的资料,尤其是蛋白质晶体学,可能不足以准确地确定氢原子的存在和位置,不同的桥接氧供体的性质描述已发表(28- - - - - -30.]。的一部分开始准备一个合适的结构研究中,三个不同的桥接配体被认为是,即O2 -(1),哦- - - - - -(1)和H2O (1 b)。为了避免氢键桥接配体,这可能大大本身改变能源结构,天冬氨酸盐配体被拒绝从镍中心逆时针旋转135°Ni-O债券。允许对比不同结构在整个研究中,基板的能量(尿素和水),进一步在中间化合物添加到生成的每个计算结构的能量。在计算贡献能量,需要一个“免费”质子的能量。由于许多组氨酸便利在活跃的网站,一个质子的能量是由能量差的质子化了的组氨酸和中立的组氨酸,脲酶模型的计算都是独立的。从计算结果中可以看到表1。在比较不同的可能的氧气捐助者,能量最低的结构(轻松)hydroxide-bridged复杂(结构1)。结构的能量1和1 b101和33焦每摩尔高于结构1,分别。氢氧化桥接配体的身份与计算结果一致通过苏亚雷斯et al。21]。如果桥接配体是水和天冬氨酸侧链被允许指向桥接配体,一个质子从水中转移到天冬氨酸发生在几何优化。这个观察到的质子转移是不稳定的一种间接确认模型的复杂1 b。大力支持模型的整体结构复杂1非常类似于x射线结构发表。原子间的距离略短(3.48和3.62 ubp),该网站还在天冬氨酸旋转的方向有所不同。
2.2。协调尿素
为了确定交互的模式作为尿素坐标脲酶的活性部位,之间的对接实验优化模型复杂1和尿素。进行了一系列的优化将尿素从一个遥远的位置之外的活性部位,逐步接近,直到绑定交互实现。最初,尿素是放置在平面上的镍离子和carbamylate氧原子,大约5.5从网站。为了不支持协调到一个特定的镍、carbamylate碳原子之间的距离和尿素氧气被选为进步的距离。在第一个优化,这个距离是8。的迭代次数,这并不总是导致最有利的结构,优化了,距离缩短。这一过程反复进行,直到尿素。尿素的定性结果是保持在一个相对集中的位置的方法,但因为它接近活性部位,它向Ni1迁移,最后定居在一个绑定交互与镍。尿素通过氧原子的协调反式位置Ni1 carbamylated赖氨酸。逐步优化的另一个效应是,water-Ni1债券距离增加直到最后水被释放了。的水分子被省略结构,再优化结构2(图3)。最后尿素镍的距离是2.12。相对于结构1,核间距离大约是相同的(3.47和3.48)。换句话说不需要重大重组尿素的绑定。
测试复杂的可行性2作为第一个绑定脲酶活性部位和底物之间的相互作用,一些其他可能的结构进行了测试。第一个被尿素协调反式Ni1的组氨酸,取代了结合水(结构2)。第二个替代模型通过取代水分子在Ni2协调尿素(结构2 b)。由此产生的能量如表所示2。两种结构都是由30多焦每摩尔相对于冷宫2;这是一个巨大的能量差堪比H‡整个反应。
2.3。四面体中间
为了评估一个四面体中间的可能性在脲酶的催化反应16),许多可能的中间体以及拟议的途径进行了研究。中间体的选择是基于什么可以从建议的收集途径和化学直觉。从2,寻找最有利的配置复杂3中,尿素氮原子坐标Ni2之一,是通过使用类似的方法正如前面的两个案例。最近的尿素氮原子之间的距离和Ni2固定,逐步缩短。在方法中,Ni2-water距离越来越长,直到水分子终于省略结构和Ni2和尿素氮原子的结合距离进行优化。对于复杂的优化结构3如图4。其中一个氮原子接近Ni2键相互作用。这对Ni2取代了水分子。
从3亲核攻击,桥接衬底建模通过缩短尿素碳原子之间的距离和桥接氧气(图5)。直接的方法再次由逐步优化。在地方法,桥接羟基是延长债券,和质子在决赛中被优化结构(4)。复杂的5使质子化得到了不协调的尿素氮原子以促进氨的释放。这延长碳氮的距离,但中间一直没有完全去除氨分子。在复杂的6,包括氨的分解产生氨基甲酸酯、氨完全删除(删除)的结构和合成复杂的结构进行优化。剩下的结构是基于静息状态,1。复合物之间的差异1,7,和8是分子添加类似的能量。在复杂的7,包括氨基甲酸酯的分离,使质子化,recoordination水,释放氨基甲酸和先前发布的氨添加为了获得类似的能量。然后认为自发释放氨基甲酸分解为二氧化碳和氨,添加在复杂的优化8。
提出了中间体和核间距离的能量在表中做了总结3。模型的图形化表示反应途径如图5。有一个适度增长的能量大约40焦每摩尔之前和之后绑定尿素。而令人惊讶的是,随后的形成协调的氮原子Ni2(结构3)没有导致任何更大的能量变化。尿素只有不好的衔接协调的晚期束缚态大约0.9焦每摩尔。然而,应该注意的是,过渡态不是研究和可能更高。Ni-Ni距离是非常相似,3.47。对尿素分子的影响也很小。碳氮的距离是1.37对镍氮协调,而自由氮碳债券被发现大约1.35。的距离2都是1.36。周围的几何协调氮也从近平面结构转移,这是典型的尿素,sp3杂化的配置。优化Ni-N(尿素)距离相当长(2.51),说明弱相互作用。Ni1-O(尿素)债券距离或多或少不变。
的形成4发现需要大量的能量,在双核的网站作为一个大型运动需要形成四面体中间。两种金属之间的桥接氧供体离开镍原子和定位在焊接距离尿素碳。Ni-O(酚盐)在结构上的距离32.01 (Ni1)和2.04 (Ni2)和结构42.16,2.07 (Ni1)和分别(Ni2)。在4的部分双键特性在尿素氮债券已经消失了的杂化碳显然是sp3。碳氮键长,1.46和1.51(见图6)与1.37和1.35在结构上3。镍原子已经远离彼此,和核间距离现在是3.66。氢氧化衔接的协调了尿素接近双核的网站,和保税Ni-N(尿素)从2.51距离缩短在3到2.09在4。从结构的能量差3来4一直计算到111焦每摩尔。考虑到能量过渡态将谎言更高,这可能是认为建模反应途径不可能脲酶的机制的一部分,这是早期发现50焦每摩尔的活化能。
不协调的尿素氮原子的质子化作用,启动离解的氨气,松了一口气的一些能源结构4。合成的能源结构5大约11焦每摩尔低于之前的结构。使质子化氮远离产品碳和1.70处于优化状态从碳,约为0.20进一步比结构4。周围的几何碳再次开始变得更加平面。这导致了应变传递的镍离子,这已经进一步分开。3.80 Ni-Ni距离决定这个网站,这是一个相当长的距离。走向一个完全平面产品继续在结构上6中,氨被正式取消。这又将镍离子分开至3.92和补充能量的结构。的能源结构6142焦每摩尔高于处于休息状态。这在复杂的能量是松了一口气7和8当产品发布和水是recoordinated。
见图5,建议路径所需的能量超过50经验确定活化能焦每摩尔。即使假定一个大型计算能量的不确定性,他们表明,四面体中间不是一个脲酶机制的一部分。活化能的计算机制有望超过150焦每摩尔。
3所示。结论
的绑定和水解尿素脲酶活性部位的建模。酶的静止状态(活性部位)计算。计算表明,桥接氧供体是氢氧根离子;这个结构是101和32.9焦每摩尔比相应的含氧的稳定——或水复合物。与之前的无机相一致模型研究[31日,32)和拟议的机制(15- - - - - -17,21),进一步计算表明尿素最初通过氧原子结合Ni1活性部位。是直接的协调反式位置相对于carbamylated赖氨酸,静息状态的水配体被释放了。
建议的机制的研究涉及四面体中间基于桥接羟基集团(机制一个,图2)进行。在这项研究中,四个额外的可能的中间体进行了研究。发现积极可以协调Ni2尿素氮原子之一,但是进一步转换包括形成四面体中间基于桥接大力羟基是不利的。经验数据发布给激活的能量大约50焦每摩尔的计算表明,150焦每摩尔需要达到四面体中间。进一步的研究涉及计算模型的替代机制涉及亲核攻击在晚期绑定尿素(氢氧化晚期绑定机制B,图2)将进行,检测过渡状态的不同机制将调查。
计算的细节
阿姆斯特丹的密度泛函计算进行密度泛函(ADF)计划,2003.01版(33- - - - - -37),使用一个uncontracted——三倍国标的基础设定冻结核和一个额外的极化作用。局域密度近似(LDA)的实现使用标准斯莱特交换术语(38由于Vosko)和相关术语,Wilk, Nusair [39]。几何图形在LDA优化级别使用分析能源梯度内spin-restricted形式主义(36]。LDA总结合能计算几何图形使用贝克的198840)和Perdew 1986 (41分别]gradient-corrected泛函,交换和关联。在所有计算一种都市性溶剂校正应用通过假设4的溶剂介电常数,模仿蛋白质内部条件。默认的趋同标准了。隆德大学超级计算机的计算进行了设施LUNARC。
确认
本文致力于教授尼克。生物无机的Hadjiliadis为了表彰他的贡献和无机化学。这项工作已经由瑞典研究理事会(VR)的资助。作者感谢教授Ulf莱德有益的讨论,也感谢LUNARC的董事这个超级计算机设施的使用。