文摘

神经生长抑制因子(GIF),也称为金属硫蛋白(metallothionein-3),会损害培养神经元的存活和神经突的形成。众所周知,- - - - - -domain-domain互动hGIF神经元生长抑制生物活性是至关重要的一步,尽管确切的机制还不清楚。在此,(MT3) -(MT3)突变和hGIF-truncated变异到三十五了,他们的生化性质通过酸碱滴定,EDTA, DTNB反应。抑制活动对神经元存活和神经突的扩展也检查了。我们发现到三十五突变域包含域集群展示的功能域与在hGIF集群。这些结果表明,稳定和溶剂metal-thiolate集群的可访问性域名是非常重要的神经生长抑制活性hGIF也表明特定的主要结构域在hGIF domain-domain交互至关重要。

1。介绍

阿尔茨海默病(AD)的病理模式特点是进步的神经元损失的形成伴随着intraneural神经原纤维缠结和细胞外淀粉样斑块1]。一个假设推测,这些症状是由一个失衡引起的神经营养因子(2]。1988年,小泽和同事建立了大脑的摘录,AD患者刺激神经元生存更大程度比正常大脑提取,由于失去人类生长抑制因子(hGIF) [3,4]。它也报道,metallothionein-3 (MT3)水平下降在星形胶质细胞损伤退化性疾病,如帕金森病、amyothrophic侧索硬化症,和进行性核上的麻痹5]。因为同质性高与MT1 /是一级结构,hGIF列为太家族中的一员,也叫hMT3 [6]。

金属硫蛋白(MTs)低分子量,cysteinerich,和金属离子结合蛋白。在哺乳动物中,四太亚型(MT1,是,MT3 MT4)已确定(7]。两个主要的亚型MT1和是被发现在大多数器官,可以迅速广泛的刺激引起,如金属离子和细胞因子(8,9]。然而,MT3 MT4专门表达在中枢神经系统(CNS)和复层鳞状上皮细胞,分别和没有回应这些抗病诱导剂7]。所有的哺乳动物MTs显示两个域,每个域包含一个metal-thiolate集群:氨基β- - - - - -域包含一个集群的三个金属配合九个半胱氨酸;c端α域包含一组四个金属配合十一个半胱氨酸。集群结构,金属离子被桥接和终端半胱氨酸四面体地协调,对MTs的功能[很重要10]。不同于大多数其他金属离子,金属硫蛋白可以结合金属具有高热力学稳定性(11- - - - - -13]。这些属性被认为使MTs功能必不可少的微量金属体内平衡,解毒的重金属离子和氧化应激反应(14,15),等等。尽管高相似性MT-3的主要结构和哺乳动物MT-1 / MT-2,这三个蛋白的生物学性质不同。最明显的特征就是MT-3但不是MT-1 / MT-2展览活动神经元生长抑制神经细胞培养的研究。这个活动MT-3已经报道的原生铜₄锌₃-hGIF和重组锌₇-hGIF [16]。进一步研究证实,抑制活动主要是与n端域,而c端域就发现不活跃(17,18]。根据我们先前的研究,表明神经生长抑制生物活性hMT3受多种因素控制。为例子,单一氨基酸插入(刺)接近n端和glutamate-rich hexapeptide插入接近糖是重要的生物活性hGIF [6]。CPCP图案也是关键生物活性;也许这个主题的具体结合位点hMT3与其他生物分子(17- - - - - -19),溶剂metal-thiolate集群的可访问性,这是与蛋白质的结构密切相关,相互metal-thiolate集群的可访问性和敏感的生物小分子(20.- - - - - -23]。此外,domain-domain交互可能扮演了一个重要的角色在调制metal-thiolate集群的稳定的构象域等等。

早期的研究表明域名是非常重要的生物功能的蛋白质。我们提出,域有稳定作用在hGIF域。然而,这种稳定作用的机制仍不清楚。朱文昊Yu博士在2003年,在我们实验室建造C34M C35S猴子金属硫蛋白突变体和发现新成立的残域(32 - 61)能结合金属离子的四倍,尽管域只有九个半胱氨酸(24]。此外,半胱氨酸的数量域的羊金属硫蛋白(sGIF),于2002年被发现,是九,两个不到其他物种含有11个半胱氨酸。因此,通过比较与sGIF hGIF的主要结构,我们构造一个hGIF到三十五突变(到三十五变异的片段在hGIF移除,它包含两个集群一样sGIF)和一个(MT3) -(MT3)变异。的生化性质突变体通过酸碱滴定,EDTA, DTNB反应,他们对神经元存活的生物活性和神经突扩展也检查了。我们发现在hGIF到三十五突变的截断α域(也称为域包含摘要)类似于野生型hGIF集群域,它展示的功能域与集群在人类生长抑制因子。实验结果表明,该稳定和溶剂metal-thiolate集群的可访问性β域名是非常重要的神经生长抑制活性hGIF也表明特定的主要结构域的hGIF hGIF domain-domain交互至关重要。

2。实验

2.1。试剂

融合表达载体pGEX-4T-2,大肠杆菌BL21,谷胱甘肽琼脂糖4 b, superdex - 75,交联葡聚糖G-25买来Amersham法玛西亚生物技术。(deoxy-ribonucleoside三磷酸核苷酸,T4 DNA连接酶,和限制性内切酶,BamH我和EcoR我购买来自新英格兰生物学实验室。空斑形成单位的DNA聚合酶,细胞培养试剂、异丙基β-D-thiogalactoside (IPTG)和triton - 100买来Sangon(上海,中国)。DNA凝胶萃取设备购买试剂盒。2,-dithiodipyridine 5-dithiobis - (1-nitrobenzoic酸)(DTNB)、乙二胺四乙酸(EDTA),凝血酶是σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。Neurobasal-A介质和无血清培养系统B27补充剂是从GIBCO-BRL购买(盖瑟斯堡,医学博士,美国)。其他试剂的分析级。

2.2。克隆、表达和纯化hMT3及其变体

人类MT3 (hMT3)细胞的互补脱氧核糖核酸制备逆转录聚合酶链反应(PCR)紧随其后。的基因(MT3) -hGIF (MT3)变异到三十五突变,单身域hMT3被放大的PCR方法(25]。每一部分是消化和克隆到向量pGEX-4T-2作为BamH I / EcoR我DNA测序片段和验证。表达和纯化过程hMT3及其突变体进行了说明书中所描述的Glutathione-Sepharose 4 b(通用电气医疗集团生命科学)做了一些调整。简单地说,文化的细胞(50 mL)种植在磅中含有100毫克氨苄青霉素的这开始的文化被稀释100倍到500毫升新鲜的2·YTA,细胞与0.1毫米IPTG诱导时的吸光度,0.6 - -0.8在600 nm,紧随其后的是小时增长之前的0.2毫米ZnSO₄。细胞在OD收获_600年值为2.5,一般达到3 - 4小时后归纳。巯基乙醇的保护下,GST融合蛋白的亲和柱分离谷胱甘肽琼脂糖4 b,洗的PBS直到280海里的吸光度小于0.02。然后融合蛋白是由凝血酶消化了14小时在乳沟缓冲区(50 mM Tris-HCl、150毫米氯化钠和2.5毫米pH值8.0)。含凝血酶洗提和重组hMT3 (n端标记Gly-Ser)融合蛋白的裂解是汇集,集中,并进一步由superdex - 75与10毫米Tris-HCl凝胶过滤柱平衡,50 mM氯化钠,pH值8.0。的主要筛选了高峰集中,脱盐,冻干,存储

2.3。蛋白质特性和重构

apo-form hMT3及其变异生成根据文献[26),完全或)下载蛋白质是由调整氮气的保护下(26]。MTs的浓度是由反应评估2,在10 g -dithiodipyridineSDS、EDTA 1毫米和12毫升醋酸(pH值4.0),使用= 19800(27]。金属离子的内容在每个蛋白质分析了火焰原子吸收分光光度法(BRAIC wfx - 110,北京)。电喷雾电离质谱(质)被用来衡量hMT3的分子量和它的变体。每个蛋白质溶解在1%甲酸(v / v)的浓度10 ng m力量的测量进行了《时尚先生》3000年电喷雾质谱仪(力量Daltonics,不来梅,德国)。工具性条件毛细管volt 4 kV;干气、5 L喷雾器气体,15 PSI;输液流量,3L。

2.4。紫外可见和圆形Dichroid光谱

紫外可见吸收光谱进行扫描,从200年到400 nm HP8453紫外可见分光光度计(美国惠普,帕洛阿尔托,CA)在室温下使用1.0厘米石英试管。CD光谱测量在200 - 300纳米的范围Jasco j - 715分光偏振计在室温下在磷酸缓冲(10毫米Tris-HCl, 100毫米氯化钾,pH值8.0)。

2.5。酸碱滴定法

的光谱光度测量的酸碱滴定的方法执行Winge和Miklossy10]。简单地说,6 - 7M Cd^{2 +}重组蛋白质溶解在10毫米Tris-HCl, pH值8.0,包含100毫米氯化钾和越来越多的1 M盐酸滴定。酸化的进程监控在250 nm HP8453紫外分光光度计。

2.6。用EDTA和DTNB反应

Cd的反应^{2 +}重组hMT3及其突变体与EDTA进行调查根据李的方法等。28):9M蛋白反应了1.2毫米EDTA在10毫米Tris-HCl, pH值8.0,包含100毫米氯化钾。避免EDTA的吸光度,反应是监控在265 nm HP8453紫外分光光度计在20-seocnd间隔为100分钟。的反应重组与DTNB hMT3及其突变体是研究根据肖等人的方法。29日):3.5M蛋白与1毫米DTNB反应在10毫米Tris-HCl, pH值8.0,包含100毫米氯化钾反应监测在412 nm (= 13600 每隔20秒)在一个HP8453紫外分光光度计为60分钟。

2.7。制备大鼠大脑提取

老鼠大脑提取准备如前所述[3]。简而言之,整个大脑从成年男性连帽纯种老鼠(200克)摘除和均质汉克斯缓冲区,离心100紧随其后g。上层清液filter-sterilized (0.22美国m过滤器,微孔,Billerica的)。刚做好的老鼠大脑的总蛋白浓度提取由布拉德福德的方法,决定和大脑提取150立即使用的浓度g m(30.]。

2.8。大脑皮层细胞的文化

文化的大脑皮质细胞准备如前所述[30.,31日)与轻微的修改。简单地说,脑皮质的纯种老鼠胎儿(18天)被移除和细胞分离机械通过粗碎皮质组织通过吸管轻轻反复。组织碎片被轻轻通过一个过滤器。细胞被洗了,悬浮在一个特定的培养基为选择性神经元增长,开发包括Neurobasal-A介质(GIBCO), 0.1% (f / c) B-27补充(GIBCO)和0.1毫米(f / c)谷酰胺(σ)。然后细胞被播种在polylysine-coated 24-well文化板块的密度细胞/。文化是保持在一个室的氛围下湿润空气含有5%股份有限公司₂。四小时后,培养基代替新鲜中包含有150g m老鼠大脑提取和10 - 20g m蛋白质。文化是保持在相同条件下三天。可视化神经元细胞,文化在4%多聚甲醛固定,然后用台盼蓝染色。最后,神经元神经突的长度是由测量的神经突之间的距离和细胞表面使用徕卡Qwin程序(Rueil法国石竹,法国)和至少60神经元神经突有超过100的记录在每个实验。

3所示。结果与讨论

DNA测序表明,突变基因被成功构建和hMT3及其突变体的主要结构如图1。重组蛋白的表达和纯化后,收益率约9毫克文化。因为这些蛋白质被凝血酶从GST融合蛋白裂解,他们有一个额外的Gly-Ser n端二肽。然而,额外的二肽的存在并不显著影响蛋白质的结构和性能(31日]。证实了他们的分子量组分,测定分子量与理论值(表匹配良好1)。根据先前的研究,Cd^{2 +}被认为是一个有用的调查结合位点在MTs [32,33),在锌提供丰富的结构信息^{2 +}代替MTs。此外,Cd^{2 +}代替MTs显示优于锌的数量^{2 +}代替MTs,包括倾向更高的氧化稳定性,明显,因此更容易检测和量化LMCT乐队,以及使用^111年Cd或^113年Cd同位素核磁共振实验,等等。因此,光盘^{2 +}经常被用来作为替代锌吗^{2 +}在结构研究hMT3 [20.,23,34,35]。在目前的研究中,Cd^{2 +}重组MTs采用光谱和metal-binding研究,而锌^{2 +}重组MTs只用于生物,因为Cd^{2 +}太是神经元细胞毒性的生物(17]。hMT3及其变体的金属内容由火焰原子吸收分光光度法和表中列出1。

图2(一个)显示了紫外可见光谱的Cd^{2 +}重组hMT3及其突变体,溶解在10毫米Tris-HCl, pH值8.0,包含100毫米氯化钾。所有的光谱显示吸收肩膀约250海里,是ligand-to-metal电荷转移的特点(LMCT) Cd-S债券(36]。吸收280海里很低因为芳香族氨基酸的缺失。根据实验结果,吸收强度在250纳米线良好Cd-S债券的数量,表明金属的测量内容是准确的。

CD谱是一种常见的方法来研究金属中心结构和蛋白质二级结构。在金属硫蛋白的研究,应用CD的研究几何和多肽折叠二级结构。图2 (b)显示了CD光谱hGIF,∆到三十五突变体,β(MT3) -β(MT3)突变体和单一β域蛋白质。与记者hGIF同意的CD谱(20.]。众所周知,两个吸收峰((260海里(+)和240 nm ()位于低能地区的Cd₇太CD的迹象metal-thiolate集群的形成,和两个峰值的变化非常敏感的结构metal-thiolate集群(13]。hGIF相比,的两座山峰β(MT3) -β(MT3)突变体明显减少,波长蓝移,使的形状β(MT3) -β(MT3)突变体类似于单身β域。它是合理的考虑到先前的研究结果α域主要有助于光盘的CD谱₇太在β域的贡献有限。这主要是因为的三个金属原子β域定位在同一个平面上;因此它们具有高对称性,有助于一个小光盘吸收。氨基和c端β(MT3) -β(MT3)突变形成three-metal集群和导致较弱的强度比hGIF CD光谱吸收。至于∆到三十五突变,两座山峰位于低能地区hGIF相比明显蓝移。此外,摩尔椭圆率的CD谱∆到三十五变异显著减少,和CD谱的形状更接近于单身β域。因此,它很可能形成两个three-metal集群,M₃年代₉,在∆到三十五突变(35]。然而,有明显的区别之间的CD光谱形状∆到三十五变异和单一β域,这表明一些存在的差异域的∆到三十五突变和βhGIF域。也许不同分布的半胱氨酸肽链会导致蛋白质折叠模式的改变和metal-thiolate集群的结构,最终导致CD谱的变化。

酸碱滴定的实验,质子的浓度会增加与减少博士因此,质子与硫醇盐配体争夺绑定Cd^{2 +}的释放,从而导致Cd^{2 +}从光盘^{2 +}硫醇盐集群,导致下降的特征吸收250海里。因此,250海里的紫外吸光度被记录在酸碱滴定法,以调查Cd-S集群的稳定性。根据我们先前的研究中,hMT3滴定曲线没有明显分为两个独立的阶段,很难告诉一个阶段从其他酸碱滴定的阴谋。指出没有大幅稳定区别这两个Cd-S集群。根据图3,有一个明显的酸碱滴定曲线之间的区别β(MT3) -β(MT3)突变和hGIF。由于缺乏域的β(MT3) -β(MT3)突变,Cd的稳定性₃年代₉在β(MT3) -β(MT3)突变开始从中性pH值降低,而Cd的稳定性₃年代₉开始从5 pH值降低∆到三十五突变和hGIF。这进一步证明了域可以稳定β在hGIF域有效。比较了pH值的滴定曲线∆到三十五突变hGIF的曲线,我们发现两个半胱氨酸的删除域Cd的稳定性没有影响₃年代₉集群hGIF任何明显的学位。我们都知道,∆到三十五突变域和β(MT3) -β(MT3)突变体β域包含一个集群,而有一个Cd₄年代₁₁集群在hGIFα域。有趣的是,稳定的功能在域更类似于Cd₄年代₁₁集群在hGIF域。这个结果就变得合理的主要结构域和hGIF域被认为是由于他们有相同的基本结构除了删除片段(³³鳞状细胞癌³⁵)。因此,我们认为可能是由于特定的主要结构域它们包含,稳定了β通过氢键、疏水作用域,domain-domain交互中扮演重要的角色在我们之前的研究中描述(21]。

MTs的反应与EDTA反映了巯基之间的竞争和外源性配体结合的金属离子,也用于调查metal-thiolate集群的稳定性(35]。pseudofirst-order条件下(EDTA的浓度是MTs的300倍),这个反应hMT3及其突变体显然是两相的,与一个快速阶段和缓慢的阶段。观察到的速率常数是通过策划ln与时间和表中列出2。如表所示,的速度β(MT3) -β(MT3)两阶段反应明显增加,而的∆级到三十五突变和hGIF相似,这意味着的metal-thiolate集群的稳定性∆到三十五突变比hGIF没有相当大的变化。这个结果与酸碱滴定法的实验结果是一致的。与EDTA, DTNB反应与亲核在MTs含巯基的组织。这个反应密切相关的溶剂可及性metal-thiolate集群和MTs(通常是两相的29日]。根据Winge和同事,快速和慢速阶段可能对应的DTNB反应β域和MTs的域,分别17]。观察到的速率常数是通过策划ln与时间和这些也列在表2。表示,快速反应的速率常数β(MT3) -β(MT3)突变hMT3几乎两倍,表明溶剂易访问性的Cd₃年代₉集群的β域的β(MT3) -β(MT3)突变产生了质的飞跃。然而,快速的反应速度∆到三十五突变与DTNB接近hGIF,以及减缓反应速度。这意味着两个Cd的溶剂可及性₃年代₉集群的∆到三十五突变体类似于它在hGIF同行。关于与EDTA和DTNB反应的结果,Cd₃年代₉集群的域的∆变异到三十五,有相同的稳定和溶剂可及性集群在hGIFα域。这意味着在hGIF metal-thiolate集群的结构域删除两个半胱氨酸后不会发生巨大的变化。此外,hGIF相比,metal-thiolate集群β(MT3) -β(MT3)突变体显示较低的稳定和较高的溶剂可及性。最明显的区别β(MT3) -β(MT3)突变和∆到三十五突变体是没有特定的氨基酸序列β(MT3) -β(MT3)突变hGIF域。因此,它再一次证明hGIF的一级结构域是重要的函数,这是与我们的pH值一致性滴定实验。

如前所述,Cd^{2 +}重组蛋白是神经细胞毒性。因此,采用重组蛋白质生理功能测试。hMT3神经生长抑制作用,β(MT3) -β(MT3)变异∆到三十五突变体进行了测试。如图4神经突的平均总长度hMT1g-treated在三天 m . hMT3显著降低平均神经突长度 米的平均神经突的长度β(MT3) -β(MT3)和∆到三十五mutant-treated神经元和m,分别(±值代表了标准误差值)。神经生长抑制活性hMT1g和hMT3同意报道之前(31日,35]。此外,β(MT3) -β(MT3)突变抑制活性明显低于hGIF。这将是低得多,如果采取的浓度β域考虑,β(MT3) -β(MT3)突变蛋白活性比等于两倍摩尔hMT3神经生长抑制。然而,∆到三十五突变体类似于hGIF神经生长抑制活性。

据报道,神经生长抑制活性hMT3主要来自它β域,而域并不直接参与神经生长抑制活性(17]。然而,域可以影响的功能β域虽然在MTs [domain-domain交互确实存在21,37- - - - - -39),和已经证明在我们以前的工作21,37]。把所有实验结果一起,hGIF及其突变体的稳定性和溶剂可访问性metal-thiolate集群的氨基端β域的良好生物活性的蛋白质;所以他们可能非常重要hMT3的神经生长抑制活性。也许,域可以影响metal-thiolate集群的稳定性和溶剂可及性β域通过domain-domain互动,多事故地影响整个蛋白质的生物活性。

4所示。结论

考虑到实验结果的EDTA, DTNB反应,和酸碱滴定法和神经生长抑制活动,我们建议metal-thiolate集群的稳定性和溶剂可及性β域很重要hGIF神经生长抑制活动。比较β域的β(MT3) -β(MT3)突变和β域的∆到三十五突变,这两个突变体具有不同的生物活性。正是因为∆到三十五突变体的类似于hGIF域域。这进一步表明,域稳定β域通过hGIF domain-domain交互,从而调节生理活动。此外,在目前的研究中,我们发现有一个明显的区别∆到三十五突变和β(MT3) -β(MT3)光谱和生化特性。的域的∆到三十五突变,其中包含M₃年代₉集群,集群metal-thiolate一样β域的β(MT3) -β(MT3)突变体,并仍保留的功能₄年代₁₁集群的hGIF域。这表明两个保守的半胱氨酸的删除不会导致hGIF metal-thiolate集群的巨大的变化域。与此同时,域的∆到三十五突变显然是不同的β域的β(MT3) -β(MT3)突变体的稳定效果,其中最明显的区别是域的∆到三十五变异包含hGIF的主要结构α域。但是,β域的β(MT3) -β(MT3)突变体包含hGIF的主要结构β域。这表明,特定的主要结构域在hGIF domain-domain交互至关重要。我们相信,我们的研究结果将提供一个进一步向更好的理解之间的关系的结构metal-thiolate集群和这群迷人的生物活性分子。

确认

这项工作由上海浦江人才支持部分项目(08年pj14017),中国国家自然科学基金(没有。29281005也没有。20771029),上海市重点学科建设项目(B108)和新药项目平台的创建(没有。2009年zx09301 - 011)。作者还要感谢杨教授p y y王博士从复旦大学的生物医学科学研究所的帮助ESI质谱的测量。