体外评价一个稳定与第九血卟啉单体的黄金(2)复杂:对肿瘤细胞毒性和肾脏细胞,细胞聚集,诱导细胞凋亡

文摘

一个稳定的抗肿瘤的潜力与血卟啉单体的非盟(2)复杂第九(Hp),即(非盟(2)。),调查小组的肿瘤细胞系。复杂的表现出强烈的细胞毒性,白血病和lymphoma-derived细胞系更敏感,值与参考的抗癌药物顺铂。相比之下,实体瘤模型对铂药物更敏感。比较评估的代理对人类肾脏细胞株293 t显示(非盟(2)。是更少的细胞毒性。黄金复杂诱发oligonucleosomal DNA碎片在肿瘤细胞后24小时的治疗,因此其细胞毒性效应是至少部分由诱导凋亡细胞死亡。细胞内知名黄金积累检测治疗后肿瘤细胞与非盟(2)。)表明,它假定的药理短潜伏期后目标是可存取的。

1。介绍

顺铂和铂类药物相关的结构代表最重要的一个类抗肿瘤药的代理,是特别宝贵的生殖细胞治疗癌症和各种其他固体恶性肿瘤(1- - - - - -3]。然而,尽管他们重要的临床作用,以铂为基础的化疗与恶性肿瘤细胞具有选择性相对较低,因此他们的应用程序与重大dose-limiting器官毒性(1]。旁边不利的安全性,目前临床应用的主要限制的白金销售代理的发展获得性耐药的肿瘤细胞(2]。因此,一个重要的兴趣是体现对cisplatin-dissimilar类似物的设计、合成与改性药理属性能够绕过细胞耐药机制(4- - - - - -6]。

考虑到金属配合物的热力学稳定性和动力学行为在生物环境,因此其生物化学和药理学特性很大程度上取决于adduct-forming金属中心的性质,它非常赞赏,金属离子的变化可能会改变抗肿瘤的活动(6]。nonplatinum金属化学疗法中一直注意金复合物(7]。众所周知的临床抗关节炎的应用程序(8],在于,药物也兴趣作为潜在的抗肿瘤的药物用金(I)磷化氢衍生品作为最活跃的体内对小鼠肿瘤模型(9]。目前,最大的兴趣在于对发展化疗主要集中在非盟(III)化合物与铂(II)等电子的倾向形成广场平面复合物,类似于顺铂(7,10]。可以预料到,类似于Pt (II)化合物,黄金(III)物种能够绑定DNA,这是他们的细胞毒性的原因。与铂(II),然而,黄金(III)复合物是极其不稳定的生理条件下,几乎排除利息对这类金属药物。此外,黄金(III)复合物高活性和能够氧化一系列生物分子如蛋氨酸、甘氨酸和白蛋白导致快速减少黄金(I)甚至元素(10- - - - - -12]。已经证明非盟(III)化合物的稳定性可以通过与氮增强donor-containing bi -和多齿的螯合配体,如ethylendiamine cyclam,关于环,等等,降低氧化还原电位的金属中心(10,13,14]。最近,大量的报告准备,结构表征,和细胞毒性研究稳定的黄金(3)配合物和有机金属化合物出现在科学文献[10]。

关于氧化还原稳定性和动力学行为,寻找合适的细胞毒性黄金(II)配合物是一个有趣的和开发的抗癌药物设计区域。如今,非盟(II)氧化态可以被视为一个普通国家黄金化学。尽管大量的稳定的抗磁性双核和多核的黄金(II)配合物,单核的稀缺的例子,它们中的大多数都是S-containing配体(15- - - - - -17]。最近,一个稳定的单体的合成和结构表征的血卟啉盟(II)复杂与一般公式[盟(2)。)(图1)据报道和扭曲的八面体结构18]。非盟(II)物种稳定在复杂的协调通过卟啉macrocycle的四个氮原子和两个水分子在轴向位置。

基本原理设计合成porphyrin-based金属配合物抗癌药物是基于选择性积累在一起恶性组织参与增强细胞毒性在光的照射。因此,这种复合物有望像混合药物与结合细胞毒性/光毒性的属性(4]。布鲁纳和同事所描述的大型系列平面铂(II)卟啉配合,卟啉残留的金属中心协调通过吊坠功能(19- - - - - -21]。最近,我们有合成和特征三个稳定的八面体血卟啉复合物铂铂3 +的不寻常的氧化态。在这些配合物的血卟啉配体协调如下:通过四个吡咯n个原子形成金属卟啉类型复杂;或者通过不对称协调两个n个原子从相邻的吡咯环形成SAT-type复杂;或侧链丙首席运营官⁻组在卟啉macrocycle之外。复合物显示明显的细胞毒性和proapoptotic活动对人类肿瘤细胞系(22]。

本研究涉及的细胞毒性活动新合成稳定的黄金(II)复杂的非盟(2)。对肿瘤细胞株的频谱。其影响人类表皮肾脏细胞株293 t研究以评估细胞毒性的选择性。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

rpmi - 1640和DMEM增长媒体、胎牛血清、谷酰胺买来3。圣Sigma-Aldrich有限公司。”路易”,密苏里州,美国。5-dimethylthiazol-2-yl (3 - (4) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT) -特里同x - 100,金本位制,三羟甲基氨基甲烷盐酸,液DMSO,和EDTA从默克公司提供。

黄金(II)与血卟啉复杂——(非盟(2)。)是合成如前所述[18]。参考抗癌药物顺铂从σ购买。股票的解决方案,代理都是刚做好的在DMSO和迅速稀释连续rpmi - 1640中所需的程度。最后稀释DMSO浓度不超过1%。

2.2。细胞系和文化条件

t细胞白血病SKW-3 (KE-37导数)(DSMZ没有。:ACC 53);nonHodgkin淋巴瘤DOHH-2 (DSMZ没有。:ACC 47);慢性骨髓性白血病k - 562 (DSMZ没有。ACC 10),喇嘛- 84 (DSMZ没有。168年ACC)以及膀胱carcinoma-derived 5637 (DSMZ没有。:ACC 35)获得DSMZ GmbH(德国布伦瑞克)。人类膀胱肿瘤细胞株MGH-U1是由美国类型细胞培养(罗克维尔市,医学博士,美国)。细胞保持一样悬挂类型文化(白血病)或附着文化(5637和MGH-U1)在受控环境:rpmi - 1640中,辅以heat-inactivated 10%胎牛血清和2毫米谷酰胺,在37岁^°贺利氏“C”孵化器有限公司为5%₂湿润的气氛。为了保持细胞在记录阶段,文化与新鲜ref rpmi - 1640中每周两到三次。

2.3。细胞毒性试验

细胞生存能力评估使用标准MTT-dye减少化验如前所述[23)与少量修改(24]。指数增长的细胞被播种在96 -平底微型板块(100信用证)的密度细胞每毫升和24小时孵化后37^°C;他们被暴露于各种浓度测试了配合物的72小时。每个浓度至少8井。孵化后MTT测试化合物(3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(σ)解决方案在PBS(10毫克/毫升)添加(10信用证)。微型板块进一步孵化4小时37^°C和甲瓒产品获得的数量确定spectrophotometrically使用电流源多平台读者(Labexim LMR-1)在580海里。细胞存活分数计算比例的未经处理的控制(未经处理的控制= 100%)。实验数据被转换为s形的剂量反应曲线使用非线性回归分析(GraphPad Prizm),使计算相应的集成电路₅₀值。

2.4。DNA碎片分析

细胞凋亡的特征mono -和oligonucleosomal碎片的基因组DNA检测使用“细胞死亡检测酶联免疫试剂盒(德国罗氏诊断)。指数增长的MGH-U1, k - 562, HD-MY-Z,镀SKW-3细胞无菌诗菜肴和暴露于均等的浓度为24小时。胞质分数的每组(治疗或治疗)细胞作为抗原来源的夹心ELISA利用初级antihistone antibody-coated微型板块和一个次要peroxidase-conjugated anti-DNA抗体。histone-associated DNA片段的光度免疫测定是按照制造商的指示执行在405 nm使用ELISA读者(Labexim LMR-1)。结果表示为oligonucleosome富集因子代表之间的比例吸收处理和未经处理的控制样本。

2.5。细胞积累动力学

整除的k - 562细胞和HD-MY-Z细胞(2毫升RPMI 1640)被置于无菌诗菜肴和暴露于不同浓度的复杂:黄金(12.5,25、50和100米)30或60分钟。曝光时间后,细胞纺科汉解释说,在2000转5分钟和含药中被丢弃。细胞被洗了三次磷酸缓冲盐和整除的数和细胞生存能力的决心(台盼蓝染料排斥试验)。此后,50的细胞被消化L 10% Triton X100 (EDTA) 5分钟,和950年L浓盐酸和浓硝酸的混合(3:1)增加了为了让完整的细胞,分解和溶解积累黄金复杂1小时。完整的细胞分解后,样品的体积是调整为1毫升,黄金的浓度是确定。黄金示例解决方案中浓度高于0.5g / mL使用火焰原子吸收光谱法(FAAS)测定了空气乙炔火焰(恂UNICAM SP 1950)。浓度较低的黄金电热原子吸收光谱法测定使用优秀的塞曼3030光谱仪近半年- 600石墨炉。光源是一个空心阴极灯为盟。光谱带通是0.7海里。标准裸石墨管被用作雾化器。只用于量化峰值区域。结果表示为nmol黄金/ 10⁶细胞。

2.6。数据处理和统计

八个独立的细胞毒性分析进行了实验,而细胞凋亡诱导评估是一式四份。数据处理利用MS Excel和GraphPad Prizm软件的电脑。学生的以及与执行作为显著性水平。

3所示。结果

3.1。细胞毒性和肿瘤细胞系

小说的细胞毒性的潜在非盟(II)研究了复杂的面板恶性细胞系,来自白血病,淋巴瘤,实体肿瘤。化学敏感性筛选程序的结果,后72小时的治疗,总结在表1。整个筛选调查顺铂作为一个积极的控制。

非盟(2)复杂的细胞毒性效应评估使用的量效曲线呈现在图2。细胞生存能力显著减少造成50%抑制浓度在微摩尔的多数的细胞系进行测试。

通常,白血病和lymphoma-derived细胞株更敏感的非盟(II)复杂的集成电路₅₀值获得差不多的referent抗癌药物顺铂。其中最敏感的肿瘤模型t细胞白血病SKW-3 (KE-37导数)(表1,图2)。在此细胞株(非盟(II)的相对效力。甚至超过了顺铂。相比之下,solid-tumor-derived细胞系表现出更明显的对顺铂的敏感性比小说黄金(II)复杂。小鼠神经母细胞瘤Neuro2A是耐金属配合物。

3.2。体外细胞毒性研究(非盟(2)(H。₂O)₂在人类与顺铂肾细胞

小说的肾毒性化合物的体外测试系统和建立肾毒性药物顺铂估计。人类胚胎肾293 t细胞暴露在顺铂或72小时(非盟(2)。),此后,他们的生存能力是发现与MTT-dye减少化验(图3)。在测试浓度范围的黄金(II)复杂的证明是略微减少细胞毒性和失败导致50%的细胞生存能力。相比之下,参照药物顺铂在肾细胞表现出更明显的细胞毒性IC₅₀值为3.87M。

3.3。诱导后细胞凋亡(非盟(2)(H。₂O)₂)治疗

尽管他们原则的行为模式,大多数抗癌药物共享能够招募的区别恶性细胞的凋亡细胞死亡信号通路。因此,(非盟(II)的能力。]唤起基因组dna分裂是细胞程序性死亡的一个重要标志是调查。为此,指数增长的SKW-3, k - 562, HD-MY-Z,和MGH-U1细胞暴露在equieffective黄金(2)复杂或顺铂浓度24小时之后,oligonucleosomal DNA碎片的水平是评估使用商用酶联免疫试剂盒(图4)。

结果表明,[盟(2)。)是一种强有力的凋亡电感造成类似水平的DNA碎片药物顺铂作为参考,如果应用于均等的浓度。黄金的影响复杂MGH-U1和HD-MY-Z特点是一个简单的浓度依赖性,即凋亡细胞的比例出现增加浓度。水平的对比,oligonucleosomal dna碎片被发现在最高浓度降低而降低的SKW-3。这个结果可以归因于坏死细胞的比例相对增加的察觉我们的实验设置。黄金复杂未能诱发突出在k - 562细胞中dna碎片在整个浓度范围使用。细胞凋亡水平明显高于控制细胞后才接触最高浓度(IC的两倍₅₀值)。

3.4。细胞内的积累(非盟(2)(H。₂O)₂]

黄金的测定细胞内水平达到30分钟或60分钟的治疗后的k - 562细胞或HD-MY-Z盟(II)上使用了复杂的人物5。著名的黄金时间,浓度模式积累是显而易见的,即k - 562细胞的细胞内水平更高的比那些在HD-MY-Z细胞。这些数据表明,公认的测试化合物的药理目标短潜伏期后很容易访问。

4所示。讨论

我们最好的知识,目前的研究是第一个解决细胞毒性潜在稳定的单体的八面体非盟(II)配合物。小说的抗增殖活性化合物是评估在一个广泛的细胞系,代表一些重要类型的人类癌症。MTT-dye减少化验的结果明确地表明(非盟(2)。)施加强大的细胞毒性/抗增殖作用,在某些情况下是可比的referent细胞毒性药物顺铂。下评估人类t细胞白血病细胞系SKW-3被证明是最敏感的非盟(2)复杂的治疗,IC₅₀这些细胞的价值低于顺铂。在其他白血病模型,(非盟(II)的相对效力。)有点低,但或多或少与顺铂。我们的实验数据表明,顺铂是突出对固体tumor-derived细胞系优越。

临床使用铂药物以及黄金治疗风湿病的代理具有显著的肾毒性,被公认为主要dose-limiting因素。因此,我们试图确定的潜在肾毒性(非盟(2)。)与肾毒素顺铂。转化细胞系似乎是一个有吸引力的模型在肾毒性的体外测试系统用于评估。他们更多功能比主细胞一方面和保留大部分的正常肾脏组织的生化特性另一方面(25]。在目前的研究中,使用293 t细胞最近已被描述为一个合适的肾毒性的体外模型评估26- - - - - -28]。新合成的复杂(非盟(2)。)被证明是对肾脏细胞和细胞毒性远顺铂相比,它没能引起50%抑制细胞的可行性。与此形成鲜明对比的是顺铂被发现与集成电路起到突出的细胞毒性作用₅₀价值与获得癌症细胞系。

目前调查的另一个重要目的是确定黄金的胞内渗透复杂。虽然黄金物种的细胞毒性的具体机制尚未完全阐明,有一种普遍的共识,他们与细胞内的目标,一个常见的特性对于大多数的抗癌药物7,10]。因此,药物的细胞积累似乎是一个关键的先决条件最佳的细胞毒性的活动。小说黄金(II)复杂的特点是一个重要的细胞内积累更加明显在白血病模型k - 562比HD-MY-Z霍奇金淋巴瘤。一种可能的解释是,文化之间的差异在这些细胞系。而k - 562细胞悬浮在培养基,HD-MY-Z细胞倾向于附着在培养容器的底部形成单层膜。相反,接触面积在k - 562细胞相比更大的semiadherent HD-MY-Z。

为了解释观察到的细胞毒性的机制(非盟(2)。),dna碎片被量化的水平。的诱导细胞程序性死亡似乎是一个共同特征调停抗癌药物的细胞毒性效应,特别是金属药物(1,4]。研究结果证实这种现象的共性:[非盟(2)。)被发现在SKW-3诱导凋亡细胞死亡,MGH-U1, k - 562, HD-MY-Z细胞后24小时的暴露。k - 562细胞的低反应的proapoptotic影响(非盟(2)。)是最可能的解释差异的低灵敏度黄金代理及其优秀的胞内积累模式。

当前数据为非盟(2)金属卟啉复杂依照建立的影响与结构相似,八面体Pt (III)复合物具有明显的细胞毒性也(22]。复杂的(非盟(2)。)有一个类似的结构,其中一个Pt (III)复合物,有八面体结构与金属中心在卟啉环通过协调四个pyrrolic氮。细胞毒性的并列显示,而铂金复杂得多积极对慢性粒细胞白血病喇嘛- 84 (18),非盟(II)复杂的研究发挥优越的活动对t细胞白血病SKW3 (KE-37)。这些数据关联与黄金的估计具体的抑制效应物种特别是免疫细胞和t细胞(7]。

卟啉在恶性组织/细胞的选择性吸收是由于复杂的机制,其中最重要的ldl受体介导内吞作用卟啉/脂蛋白复合物形成的循环。因此,卟啉受聘为目标以确保细胞毒性药物的选择性积累到半个固体肿瘤微环境(19- - - - - -21]。这部小说复杂的用于本研究证明重要的胞内积累大概由FCS-lipoprotein复合物的形成和随后的内吞作用。由于配体的光毒性的属性,light-borne扩增的细胞毒性(非盟(2)。不能排除,将在进一步得到解决,这种化合物的更详细的评估。

所有在本研究提供的实验数据显示,(非盟(2)。)是一种生物活性化合物与well-pronounced对恶性肿瘤细胞的细胞毒性和proapoptotic属性。与顺铂相比,它对人类的肾脏细胞和细胞毒性较小这一特性可能被证明是有利的。

承认

本研究为美国国家科学基金资助的保加利亚教育部和科学通过批准号WU-06/05。

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