肺炎的分子诊断用多重实时PCR检测RespiFinder®SMART 22 FAST在摩洛哥婴儿的组

抽象

背景.在摩洛哥，小儿肺炎仍是一个严重的公共卫生问题，因为它构成了死亡的第一原因是由于传染病。急性呼吸道感染的病因诊断是困难的。因此，有必要在用于精确和快速识别一个例程的设定使用多重实时聚合酶链反应测定的测试。目标. 本文介绍了小儿肺炎的临床表现，并用分子诊断方法对其病因进行了描述。学习规划：于2016年12月1日至2018年5月31日期间，在新生儿科就诊，从出现孤立呼吸窘迫或与全身症状相关的婴儿身上收集气管分泌物。使用多重应答器®SMART 22 FAST对样本进行测试，它可能检测到18种病毒和4种细菌。结果. 在本研究所考虑的86名疑似急性呼吸道感染的婴儿（平均年龄31±19天）中，71名（83%）对一种或多种病毒或/和细菌呈阳性。大多数急性呼吸道感染是由病毒引起的（95%）：呼吸道合胞病毒（a和B）（49%）、鼻病毒（21%）、冠状病毒229E（11%）、人类偏肺病毒（5%）、流感a（3%）、流感H1N1（1%）、腺病毒（2%）和副流感病毒4型（2%）。在我们的病人中，6%有肺炎支原体. 合并感染与严重呼吸系统症状无关。结论. 呼吸道感染的临床谱是复杂的，往往是非特异性的。因此，早期、快速地检测相关致病菌至关重要。多重实时聚合酶链反应的应用有助于选择正确的治疗方法，减少不必要抗生素的总体使用，保护肠道菌群，减少住院时间，减少医院感染。

1.简介

据世界卫生组织（WHO），肺炎定义为急性呼吸道感染（生殖道感染）的影响肺组织（支气管，细支气管和肺泡组织）1个]。在摩洛哥，小儿肺炎仍是一个严重的公共卫生问题，构成死亡的第一原因是由于传染病[2个]。肺炎是儿童发病率和死亡率世界范围内的一个主要原因。世界卫生组织估计，140万名儿童谁每年死于是5岁，其中死亡的最大风险是在新生儿期下[三]。

肺炎的流行病学和病原学因国家和地区而异。在发展中国家，5岁以下儿童肺炎的发病率为每名儿童每年0.29次，而发达国家为每名儿童每年0.05次[4个,5个]。

肺炎是由多种微生物（病毒、细菌或真菌）引起的。病毒是5岁以下儿童最常见的病原体，特别是呼吸道合胞病毒（RSV）、鼻病毒（RV）、流感病毒（IV）、副流感病毒（PIV）和腺病毒（ADV）[6个,7个]。目前至少有26种病毒与肺炎有关。抗菌药物的分布因季节、地理区域和年龄组的不同而不同(4)。考虑到病毒感染的频率，抗菌药物的使用往往是不充分和不必要的[八]。

肺炎的病因诊断是困难的，因为临床表现相似，也因为病毒和细菌之间或不同病毒之间症状的重叠[9个]. 因此，在常规环境下使用多重实时聚合酶链反应（PCR）检测技术进行准确、快速的鉴定是必要的。他们在一次反应中同时检测多种病毒和细菌病原体，在数小时内具有更高的灵敏度和特异性[10]。

本研究的目的是介绍儿童肺炎的临床结果，并描述其流行病学和病原学的婴儿谁生活在摩洛哥和收治新生儿单位。

2。材料和方法

2.1条。研究的设计和人群

本前瞻性研究于2016年12月1日至2018年5月31日在拉巴特儿童医院国家新生儿营养参考中心和医学研究实验室进行。我们在这项研究中纳入了86名单独或与全身症状相关的呼吸窘迫患儿。

2.2。纳入标准

婴儿，不论其胎龄或地理来源，其实际年龄小于4个月，因怀疑肺炎而住院。

纳入标准基于临床症状（呼吸症状）的诊断。如果婴儿出现与世卫组织临床肺炎定义相关的症状，则招募他们。他们被定义为有咳嗽史、呼吸频率升高或胸壁内陷[2个,11]。

2.3。排除标准

年龄在0和9天短暂呼吸窘迫或心脏，神经，或malformative起源的呼吸窘迫的婴儿之间的所有新生儿，被排除在这项研究。

2.4条。数据收集

所有的数据都被输入到包含流行病学，临床，副临床数据，病人的临床评估，以及有关病人家庭成员的信息的表格中。

研究数据如下:（一）流行病学数据：年龄、性别和社会经济状况（ⅱ）病人的环境、家庭条件和健康史（三）临床资料：症状与演变（ⅳ）副临床资料：生物分析（全血计数、C-反应蛋白（CRP）、RT-PCR）、胸片（儿科医生解释）

2.5。收集的样本

气管分泌物（TS）样品收集在第一个12小时住院，并从新生儿科医疗研究实验室在儿童医院在拉巴特转移。

TS的收集按照标准程序进行，即使用气管吸入探头。这是引入，直到遇到阻力，并收回约2厘米。然后释放真空，用旋转动作小心地取出探针，将分泌物吸进无菌收集管。

2.6条。实验室方法

根据制造商的说明，使用Resifinder®SMART 22 FAST对样品进行分析。该方法可同时检测和鉴别22种呼吸道病原体：18种病毒（流感病毒A和B、流感病毒A H1N1、呼吸道合胞病毒A和B、副流感病毒1、2、3和4、鼻病毒（RV）/肠道病毒、冠状病毒（Cor）（229E、NL63、OC43和HKU1）、人偏肺病毒（hMPV），腺病毒（ADV）、博卡病毒（BoV）和4种细菌(嗜肺军团菌,百日咳杆菌,肺炎支原体,衣原体肺炎）12]。

175平方米μTS样品的升在40洗脱 μ升的洗脱缓冲液。该测定法由预扩增步骤，它结合了逆转录酶和多重靶扩增PCR，接着进行探针杂交步骤，探针连接步骤，和探针扩增步骤。内部放大控制（IAC）在该过程的开始时加入与真阴性结果的样品和样品假阴性结果由于PCR故障之间进行区分。目标是使用毛细管电泳[检测13]。

2.7。统计分析

与包为社会科学（SPSS.18）进行统计分析，并通过使用皮尔逊的软件RChi2分析。一个值<0.05被认为具有统计学意义。

2.8。伦理思考

所有参与者的父母给了知情同意书。这项研究的方案经医药在摩洛哥拉巴特学院的生物医学研究伦理委员会。

3.结果

这项研究的受试者共86名婴儿当中。他们提出有呼吸道症状和肺炎的嫌疑。其中，46（53％）为男性，40（47％）为女性，和性别比例为1.15。The mean age was 31 ± 19 days. 54% of the patients were of middle socioeconomic status, 45% had low socioeconomic status, while only one of them was of a high socioeconomic status. According to the parents, 4 (5%) families had a pet at home, 44 (51%) had dampness at home, and 11 (13%) had lived with smokers (Table1个)。

包括在此研究中的所有患者均自觉，至少有一个呼吸的症状与呼吸困难的频率高，占病例95％。咳嗽，流涕和发热为经常用67％，62％和38％，分别为（表2个)。我们的患者的84％进行胸部X-射线，其中62％是不正常的。的与异常胸部X光检查结果的情况下91％，表现出一个证实感染（ )采用RT-PCR技术(表1)三)。平均住院时间6±5天;死亡婴儿的住院时间不包括在内，为10±4天。在此期间，3%的死亡和10%的院内感染并发症被发现。

多重RT-PCR结果显示有7种病毒和1种细菌。在71/86份样本（83%）中至少检测到一种病原体。最流行的病毒是RSV，在46/86的样本中检测到（51%），其中A型和B型分别占59%和41%。在所有样本中，静脉注射A代表了4%，其中一名患者有静脉注射H1N1亚型，20/86（23%）样本中检测到RV，2/86（2%）样本中检测到ADV，10/86（12%）样本中检测到Cor229E，5/86（6%）样本中检测到hMPV，2/86（2%）样本中检测到PIV4。6%的病人肺炎支原体. 共感染22例，占全部样本的26%（22/86），阳性样本的31%（22/71）。两种病毒共感染19例。共感染病毒/细菌4例。最常见的共感染组合是RSV/rhino(n个 = 7) and RSV/Cor229E (n个 = 6）（表4个)。

根据我们的研究，病毒的季节性分布各不相同，图表显示，病毒感染基本上出现在最冷的季节（秋冬），此时一些呼吸道病毒的季节性还没有很好的确定。RSV A和B是最常见的病毒，在9月和12月频繁出现。1月、2月和7月发现了静脉注射甲型流感病例；2月发现了H1N1流感病例。Cor229E在5月份占主导地位。在研究期间检测到RV，没有任何选择。其他病毒hMPV、ADV和PIV4的发病率较低（图1个)。

我们比较了阳性样本（83%）和阴性样本（17%）的流行病学、临床和放射学特征。男性阳性率为62%（44/71， )。早产率在阳性的情况下提出的64.3％（ )。对于一般特征（包括年龄，社会经济地位，以及患者的环境），两组间比较没有显示任何意义，其余（表1个)。两组患者的临床症状和体征均以阳性多见，阳性多见。差异无统计学意义。鼻扩口只在a阳性病例中出现(表2个)。

4。讨论

人类的呼吸道容易受到病毒和细菌的感染。肺炎是下呼吸道感染的主要临床表现，是全世界儿童住院的主要原因。死亡率和发病率较高，尤其是在生命的最初几年[14–16]。

一些实验室技术被用于检测与rti有关的试剂，包括免疫荧光、酶免疫分析、培养分离和分子生物学。目前的分子方法可以检测出大量的病毒，细菌也可以使病原学诊断更加有效，而传统的方法灵敏度较低，且大多不适合快速诊断[17–19]. 在拉巴特儿童医院，生殖道感染很常见，尤其是急性下生殖道感染，在全因会诊中占很大比例[2个]。因此，他们的精确诊断是必要的[19]. 目前，许多分子检测技术已经发展并商业化[20]. Ruuskanen等人。据报道，在使用分子诊断的儿童病例中，病毒感染的证据占49%[4个,21]。

我们研究的第一次，对于急性呼吸道感染在新生儿CHR服务的病因预期数据。我们评估86名临床怀疑肺炎摩洛哥婴儿RespiFinder®SMART 22 FAST的性能。在我们的样本的比例非常高，是积极的（83％）。我们的大多数患者有病毒感染。此外，检测到在测试板大多数病毒（RSV，RV，COR 229E，肺病毒，IVA，IV A型H1N1，ADV和PIV4）。Dabisch-Ruthe等。报告说，在检测病毒的RespiFinder-19的较高的临床灵敏度。他们发现呼吸道病毒在气管分泌的64％（TS）的样品[12]。这种高阳性与其他采用分子方法进行的研究相似[2个,22–24]。

在本研究中，最常见的病原体是RSV A/B，在53%的样本中检测到。根据几项研究，RSV（A和B）是世界范围内婴幼儿肺炎最常见的病因[25]。霍尔CB等。提示RSV既有住院患儿和门诊的最大疾病负担，尤其是5岁以下的儿童[26]. 婴儿中这一比例较高是由于母体抗体在预防呼吸道合胞病毒感染方面无效[24]。系统地审查Shi等实现。在2015年估计，急性3000万次发作降低RSV引起的呼吸道感染大约在4年中低收入和中等收入国家少岁儿童的生命的第一年的三分之一。他们还估计在高收入国家，280万个集[27]。在研究中检测到的第二种病毒是RV 23％。人类的RV是上，下呼吸道感染和普通感冒的主要病原体最常见的病原体。它会导致婴幼儿[严重急性呼吸道感染28,29]。ADV在箱子2％中检测到;它是下呼吸道感染的年龄在2年以上，并在儿童或成人的主要原因之一，但很少在新生儿和婴幼儿[三十]。甲型流感占病毒检测阳性样本中的4％。据埃津等人发表在摩洛哥的一项研究结果。两个季节（2016/2017年至2017年/ 2018）期间，在急性呼吸道感染病例流感病毒感染的影响尤其是年龄超过65岁（20.7％）和5岁至15岁（36％）之间的孩子成人，而儿童两年多岁少具有低的速率（4.4％）〔31]。IV是在冬季几周闻名ARI的季节性爆发[29]。根据由卡内拉等人，在巴西实现0岁至18岁之间的儿童中的研究中，该病毒是阳性与IV H1N1（38％）[频率更高32]. 在2%的病例中检测到PIV亚型4，据报道它是ARIs的一个较少见的病因[33]。该组冠状是异质的（冠状病毒229E，OC43，NL63和HKU1）34]. 在我们的研究中，我们只检测到Cor229E。冠状病毒和其他新发现的与rti有关的病毒（人博卡病毒和hMPV）的临床症状与其他呼吸道病毒相似，并且在年轻时经常被发现[13]。我们的研究结果与在儿童和婴儿中进行的其他研究结果相似[35,36]. 我们的病原学结果与图卢兹大学医院对ARIs患儿进行的研究结果一致；采用15号应答器分析样本，病毒感染率为88.7%，RSV检出率为39.5%[9个]。对于细菌，只有6％的我们的患者中有肺炎支原体，而在病例81％已用抗生素治疗。细菌的低发病率可通过使用抗生素如结合艺术疑似病例中使用的紧急动作进行说明。贝克曼和赫希检测肺炎支原体在儿童和成人患者[中2.1％36]。

根据几项研究，共感染的发生率取决于不同的人群和测试面板[37]。Bruijnesteijn van Coppenraet等报道，分子检测显示双重感染的频率很高。具体而言，冠状病毒(75%)、RSV(58%)和RV(46%)经常被检测为混合感染[八]. 目前的研究显示，31%的阳性样本中有联合感染，RSV/rhino和RSV/Cor229E的联合感染频率很高。一些研究指出，临床严重程度与多个病毒的联合感染有关[八,37,38]。另一项研究报告说，合并感染并没有随着临床严重程度有关[39]. 我们的研究结果显示，在临床严重程度上，合并感染和单一感染没有显著差异。此外，不同病因的临床表现往往相似。病毒检测与临床特征的相关性显示了呼吸体征的优势，特别是呼吸困难、呼吸困难、发绀、呼吸困难、喘息和喘息。我们的临床症状和体征与Singh S等人的研究结果一致。小于2个月的婴儿[40个]。

五，结论

呼吸道感染的临床表现是复杂的，而且往往是非特异性的。因此，早期、快速地检测相关病原体是至关重要的。在摩洛哥，呼吸道感染的多重RT-PCR检测不用于常规诊断。使用它们在不久的将来可以帮助儿科医生选择一个适当的治疗,减少不必要的抗生素的整体使用,停止其使用的病人感染了病毒,启动抗病毒治疗和保持肠道菌群,并有助于减少院内感染,减少住院的长度,也会降低管理成本。呼吸道感染的多重RT-PCR检测可能是未来更大样本和不同年龄组研究的主题。

数据可用性

用于支持该研究结果的数据包括在项目之内。

利益冲突

作者宣称他们有兴趣对这篇文章的发表任何冲突。

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